一种防治松材线虫的组合物及其应用的制作方法

1.本发明涉及一种防治松材线虫的组合物及其应用，属于松材线虫防治技术领域。


背景技术：

2.松材线虫病，又称松萎蔫病(pine wilt disease)，是松树的一种极具毁灭性的病害；松树一经感染，蔓延迅速，涉及数十种松属植物，包括我国在内的世界多个国家存在疫情，该病已发展为世界性的严重森林病害。松材线虫(bursaphelenchus xylophilus)是松材线虫病主要的病原，松材线虫的防控对于控制松材线虫病至关重要。目前防控松材线虫最直接、最有效的杀线虫剂主要是广谱性合成药剂，线虫易产生耐药性，且存在高毒、高残留、污染环境、对非靶标有益生物构成威胁等缺陷，这使得生态友好的天然杀线剂的开发显得尤为迫切。自然界植物资源丰富，植物源杀线剂近些年一直是松材线虫病研究的热点。通过将多种有生物活性的天然植物混合，提高稳定性，优化其性能，是开发天然产物生物制剂的一种有效途径。
3.花椒(zanthoxylum bungeanum maxim.)是芸香科、花椒属落叶小乔木多年生植物，是我国传统的药食同源植物。花椒果实含有丰富的活性物质，具有止痛、杀虫等多种活性。专利cn101209059a公开了一种新型杀根结线虫生物制剂及其应用方法，它是以百部粉为主要有效成分，花椒粉在内几种植物材料的粉末为次主要成分制成可湿性微粉，虽可有效抑制番茄根结线虫的发生，但对于花椒杀根结线虫活性未详尽研究；同时对于松材线虫杀灭效果也未研究。cn108925315a公开了一种“两步法”生物熏蒸防控设施蔬菜根结线虫的方法；首先将花椒籽饼按1000kg/亩的施用量以撒施的方式与设施土壤混匀，覆盖透明地膜，闷棚30天左右。蔬菜定植前7天，将灭活的花椒籽按1000kg/亩的施用量均匀的撒在栽培畦中，与土壤混匀后定植蔬菜。上述方法不合适于松材根结线虫的防治。


技术实现要素：

4.本发明克服了上述现有技术的不足，提供了一种防治松材线虫的组合物及其应用，该组合物是以花椒粗提物为主要活性成分，黄芪粗提物为增效成分复配而成；该组合物能够有效防治松材线虫，并且制备工艺简单，使用简便，适合推广使用。
5.本发明的技术方案是：一种防治松材线虫的组合物，其特征是，该组合物由花椒粗提物和黄芪粗提物复配而成，所述花椒粗提物和黄芪粗提物的质量比为24～25:1；
6.所述花椒粗提物为采用浓度10％ nh4cl水溶液在45～55℃对花椒果实进行浸提，再利用二甲苯萃取获得；所述黄芪粗提物为采用甲醇或者正己烷加热回流提取黄芪根获得。
7.优选的，黄芪粗提物为采用甲醇加热回流提取黄芪根获得。
8.优选的，上述花椒果实和黄芪根均粉碎成过60目筛的粉末。
9.上述组合物制备方法为：
10.(1)采用浓度10％ nh4cl水溶液在45～55℃对花椒果实粉末进行浸提，再利用二
甲苯萃取，浓缩至呈粘稠状，然后采用有机溶剂稀释获得花椒粗提物溶液；
11.(2)采用甲醇或者正己烷加热回流提取黄芪根粉末，提取液浓缩至呈粘稠状，再用有机溶剂稀释获得黄芪粗提物溶液；
12.(3)将黄芪粗提物溶液加入到花椒粗提物溶液中，制成花椒、黄芪组合物溶液。
13.优选的，步骤(1)10％ nh4cl水溶液用量为花椒粉质量的8～12倍；浸提时间为1.5～3小时。
14.优选的，步骤(2)加热回流提取3～4h。
15.优选的，步骤(1)、(2)稀释使用的有机溶剂为dmf。
16.本发明还提供了上述组合物在松材线虫防治方面的应用。
17.本发明通过对花椒粗提物研究发现，花椒粗提物对松材线虫具有良好的杀灭活性；通过加入黄芪粗提物发现，黄芪粗提物对花椒粗提物杀线效果有显著增效作用，从而对研制开发新型的防治松材线虫的生物制剂开辟新的方向。
18.本发明的有益效果：
19.1、高效杀线。该组合物具有较高的杀松材线虫活性，600μg/ml组合物溶液处理松材线虫24h，松材线虫校正死亡率达99.33％；24h lc
50
＝67.67μg/ml；
20.2、该组合物在林间能够有效预防松材线虫病发生，防治效果为79.59％；
21.3、该组合物保留了花椒、黄芪中多种活性成分，且制备方法简单，成本低廉，便于大规模生产。
具体实施方式
22.下面将结合本发明实施例中的内容，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下述实施例中，花椒的使用部位为成熟果实，黄芪的使用部位为根。
23.实施例1：不同浓度nh4cl花椒粗提物获取及杀线活性检测(检测浓度：按生药计，浓度约为1mg/ml)
24.本实施例提供了花椒粗提物的提取方法及不同浓度nh4cl花椒粗提物对松材线虫杀灭效果相关实验。
25.1.花椒粗提物获取
26.(1)将新鲜、干燥、干净的花椒果实于植物粉碎机充分粉碎1～2min，并过60目筛得到花椒粉；
27.(2)按10％添加量(重量比)将花椒粉分别添加至浓度为5％、10％和15％的nh4cl溶液中，50℃恒温浸提2h，期间每隔0.5h搅拌一次。对照为用水代替nh4cl溶液进行提取。
28.(3)浸提完成后，经4层纱布过滤，得到不同处理粗滤液。
29.(4)按重量比1:1将不同处理粗滤液与有机溶剂(二甲苯或者正己烷)混合，于分液漏斗中进行萃取；萃取时间24h。萃取完成后，上层即为不同浓度nh4cl、不同有机溶剂萃取的花椒粗提物萃取液。
30.根据此方法，我们初步获得8种花椒粗提物萃取液，分别为：花椒粗提物-ck-a、花
椒粗提物-5-a、花椒粗提物-10-a、花椒粗提物-15-a、花椒粗提物-ck-b、花椒粗提物-5-b，花椒粗提物-10-b和花椒粗提物-15-b。其中：“ck”代表水，“5”代表5％nh4cl溶液，“10”代表10％nh4cl溶液，“15”代表15％nh4cl溶液；“a”代表有机溶剂二甲苯，“b”代表有机溶剂正己烷。
31.2.不同花椒粗提物杀线活性检测
32.杀线活性检测方法如下：
33.(1)稀释100倍：将上述所得8种花椒粗提物萃取液，各加入8％表面活性剂吐温-80，用水稀释100倍，备用。
34.(2)制备松材线虫溶液。首先，将无菌松材线虫(bursaphelenchus xylophilus)接种于长满灰葡萄孢菌(botrytis cinerea)的pda平板上，25℃条件下恒温培养5d左右后分离线虫；分离方法为贝尔曼漏斗法。然后，将分离到的线虫液，在3500r/min条件下离心3～5min去除杂质，用无菌水稀释线虫液体；重复3次；收集到无杂线虫液。最后，利用稀释法制成浓度约为2500头/ml松材线虫溶液。
35.(3)检测步骤(1)不同花椒粗提物对松材线虫杀灭效果。按照1:1的体积比将不同花椒粗提物稀释液分别与线虫溶液混合；混合液总体积为200μl，此时混合液中松材线虫稳定在250头左右。空白对照为无菌水代替待测花椒粗提物。混合完成后，25℃条件下静置处理，在处理24h后用光学显微镜镜检，观察松材线虫死亡情况，计算并比较各待测粗提物处理松材线虫校正死亡率。
36.我们以线虫僵直并以解剖针触动无反应确定为死亡标准。
37.死亡率(％)＝处理线虫死亡数/处理线虫总数
×
100
38.校正死亡率(％)＝(处理死亡率-空白对照死亡率)/(1-空白对照死亡率)
×
100
39.镜检方式：处理完成后将混合液于2000r/min离心机离心180～200s，去掉上清，用200μl无菌水重悬，取50μl重悬液于载玻片上，镜检。
40.结果发现，花椒粗提物杀线虫效果随浸提液nh4cl溶液浓度的升高呈现先上升后下降趋势；经10％ nh4cl溶液充分提取的花椒粗提物杀线虫效果显著优于其它浓度(参照表1)。进一步比较发现，以二甲苯为萃取剂获得的花椒粗提物杀线虫效果显著优于以正己烷为萃取剂获得的花椒粗提物(参照表1)。该结果说明，经10％ nh4cl溶液充分提取、二甲苯萃取后的花椒粗提物具有显著的杀松材线虫效果。
41.表1不同花椒粗提物对松材线虫杀灭效果统计
[0042][0043]
实施例2：黄芪不同有机溶剂粗提物获取及对花椒粗提物杀线增效效果研究
[0044]
本实施例提供了黄芪粗提物的提取方法及不同含量黄芪粗提物对花椒粗提物杀线效果影响的相关实验。
[0045]
1.黄芪粗提物获取
[0046]
利用索氏提取器对黄芪内含物进行提取，获得黄芪粗提物，具体方法如下：
[0047]
(1)将黄芪根用清水洗净并浸泡5min，除去材料表面杂质成分，自然晾干；
[0048]
(2)利用粉碎机粉碎1～2min，过60目筛得到黄芪粉；
[0049]
(3)取干净的250ml规格的索氏提取器，加入20g干燥的黄芪粉，黄芪粉置于上下密封的装有脱脂棉填塞的滤纸筒中；分别量取100ml甲醇和正己烷，分别加入到索氏提取器中；样品充分浸泡3～4h，80℃加热回流提取3～4h；
[0050]
(4)冷却，提取液旋转蒸发至粘稠状；
[0051]
(5)提取完成后加入dmf定容至100ml，即得不同黄芪粗提物溶液。
[0052]
根据此方法，我们获得2种黄芪粗提物，分别为：黄芪粗提物-b、黄芪粗提物-c。其中：“b”代表提取剂正己烷，“c”代表提取剂甲醇。
[0053]
2.不同黄芪粗提物杀线活性检测
[0054]
按照实施例1所述方法对不同黄芪粗提物溶液(不需要稀释100倍)杀线虫效果进行检测。结果显示，经黄芪粗提物-b和黄芪粗提物-c处理24h后，松材线虫校正死亡率分别为-0.53％和-0.59％(参照表2)；说明，黄芪粗提物对松材线虫无杀灭活性。
[0055]
表2不同黄芪粗提物对松材线虫杀灭效果统计
[0056][0057]
3.不同浓度黄芪粗提物对花椒粗提物杀线效果影响
[0058]
(1)制备标准花椒粗提物溶液。按照实施例1中所述最优方法(10％ nh4cl溶液充分提取，二甲苯萃取)获得花椒粗提物萃取液，将其旋转蒸发至粘稠状，用dmf稀释制成1mg/ml的花椒粗提物(所述浓度为有效成分花椒粗提物的含量，下同)溶液，即为标准花椒粗提物溶液。
[0059]
(2)制备标准黄芪粗提物溶液。按照上述1所述方法制备黄芪粗提物提取液，提取液旋转蒸发至粘稠状后，直接用dmf稀释制成1mg/ml黄芪粗提物(所述浓度为有效成分黄芪粗提物的含量，下同)，即为标准黄芪粗提物溶液，此时获得两种标准黄芪粗提物溶液。
[0060]
(3)制备粗提组合物溶液。将两种标准黄芪粗提物溶液分别按照标准花椒粗提物溶液体积的0.5％、1％、2％、4％和8％的量加入到标准花椒粗提物溶液中；分别用对应对的7.5％、7％、6％、4％和0％dmf补齐，保证花椒粗提物含量一致(此时，花椒粗提物有效成分含量为926μg/ml，黄芪粗提物含量分别为4.63μg/ml、9.26μg/ml、18.5μg/ml、37.0μg/ml、74.0μg/ml)，制成不同粗提组合物溶液。
[0061]
(3)不同粗提组合物杀线效果检测。按照实施例1所述方法对不同粗提组合物杀线虫效果进行检测。不同之处是，不需要稀释100倍，且空白对照1为加入8％dmf的花椒粗提物溶液。混合完成后，25℃条件下静置处理，在24h用光学显微镜镜检，观察松材线虫死亡情况，计算并比较各处理松材线虫校正死亡率。
[0062]
结果显示，无论是以甲醇或是正己烷为萃取剂制备黄芪粗提物，与标准花椒粗提物混合后，均能提高花椒粗提物对线虫杀灭能力，具有增效效果。进一步分析发现，4％和8％黄芪甲醇粗提物对花椒粗提物杀线促进效果最为明显，该粗提物混合液处理松材线虫24h后，松材线虫校正死亡率为100％，较对照增长16.97％；说明4％黄芪甲醇粗提物对花椒粗提物杀线促进效果达到饱和。以上结果说明，以甲醇为有机溶剂提取黄芪所获得的粗提物，按4％含量与花椒粗提物进行充分混合，能够有效提高花椒粗提物杀线效果，有效成分含量花椒粗提物：黄芪粗提物＝24～25:1。
[0063]
表3不同粗提组合物杀线效果统计
[0064][0065]
实施例3：花椒、黄芪粗提组合物杀线毒力测定
[0066]
本实施例提供了花椒、黄芪粗提组合物的制备方法及组合物24h毒力方程和lc
50
相关实验。
[0067]
1.花椒、黄芪粗提组合物制备
[0068]
(1)标准花椒粗提物溶液制备。按照实施例1中所述最优方法(10％ nh4cl溶液充分提取，二甲苯萃取)获得花椒粗提物萃取液，旋转蒸发至粘稠状，用dmf稀释制成1mg/ml花椒粗提物溶液，即为标准花椒粗提物溶液。
[0069]
(2)标准黄芪粗提物溶液制备。按照实施例2所述最优方法(甲醇提取)提取液蒸发至粘稠状后，直接用dmf稀释制成1mg/ml黄芪粗提物溶液，即为标准黄芪甲醇粗提物溶液；
[0070]
(3)制备标准粗提组合物溶液。将标准黄芪甲醇粗提物溶液按照4％的量加入到标准花椒粗提物溶液中，制成1mg/ml粗提组合物溶液(有效成分含量花椒粗提物：黄芪粗提物＝25:1)，即为标准粗提组合物溶液。
[0071]
2.标准组合物杀线毒力测定
[0072]
利用稀释法(dmf为溶剂)将标准粗提组合物溶液分别稀释到200μg/ml、400μg/ml、600μg/ml、800μg/ml、1000μg/ml和1200μg/ml。按照实施例1所述方法进行杀松材线虫效果检测，在处理24h后观察松材线虫死亡情况，计算各处理松材线虫校正死亡率，各处理组合物终浓度为100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml和600μg/ml。
[0073]
结果发现，600μg/ml组合物处理松材线虫24h，松材线虫校正死亡率达99.33％；我们进一步得到了其毒力回归方程，通过毒力回归方程计算得到粗提组合物lc
50
＝67.67μg/ml，说明组合物具有较高的杀松材线虫活性(参照表4)。
[0074]
表4不同浓度组合物对松材线虫杀灭效果统计(处理24h)
[0075][0076]
实施例4：花椒、黄芪粗提组合物林间药效试验
[0077]
本实施例提供了以花椒、黄芪粗提组合物为有效杀线成分的制剂林间药效试验。
[0078]
本试验于2022年6月在安徽黄山试验基地开展，此处历年松材线虫病害严重。供试药剂为花椒、黄芪粗提组合物dmf溶液(有效成分含量为0.1g/ml，两种粗提物质量比25：1)；稀释倍数300倍；对照为清水。使用方式为无人机飞防。
[0079]
本试验共划分为施药处理区和对照区。施药处理区共50亩，处理株数2743棵；对照区共50亩，处理株数2805棵。按照供试药剂100ml/亩用量进行飞防，施药后15～20d，进行第二次飞防。两次施药完成后，于第二年对马尾松死亡情况进行统计，并计算施药处理区校正死亡率。
[0080]
结果分析发现：田间喷施两次300倍杀线粗提组合物后，马尾松死亡率降低至1.09
‰
；相比对照，马尾松死亡率大大降低。结果表明，杀线粗提组合物在林间能够有效预防松材线线虫病发生，其防治效果为79.59％(参照表5)。同时，用药方式简便易行，具有可推广性。
[0081]
表5马尾松死亡情况统计
[0082]

技术特征：
1.一种防治松材线虫的组合物，其特征是，以花椒粗提物为主要活性成分，黄芪粗提物为增效成分复配而成。2.如权利要求1所述的一种防治松材线虫的组合物，其特征是，该组合物由花椒粗提物和黄芪粗提物复配而成，所述花椒粗提物和黄芪粗提物的质量比为24～25:1；所述花椒粗提物为采用浓度10％nh4cl水溶液在45～55℃对花椒果实进行浸提，再利用二甲苯萃取获得；所述黄芪粗提物为采用甲醇或者正己烷加热回流提取黄芪根获得。3.如权利要求2所述的一种防治松材线虫的组合物，其特征是，所述黄芪粗提物为采用甲醇加热回流提取黄芪根获得。4.如权利要求2所述的一种防治松材线虫的组合物，其特征是，所述花椒果实和黄芪根均需要粉碎成过60目筛的粉末。5.如权利要求4所述的一种防治松材线虫的组合物的制备方法，其特征是，(1)采用浓度10％nh4cl水溶液在45～55℃对花椒果实粉末进行浸提，再利用二甲苯萃取，浓缩至呈粘稠状，然后采用有机溶剂稀释获得花椒粗提物溶液；(2)采用甲醇或者正己烷加热回流提取黄芪根粉末，提取液浓缩至呈粘稠状，再用有机溶剂稀释获得黄芪粗提物溶液；(3)将黄芪粗提物溶液加入到花椒粗提物溶液中，制成花椒、黄芪组合物溶液。6.如权利要求5所述的一种防治松材线虫的组合物的制备方法，其特征是，所述步骤(1)10％nh4cl水溶液用量为花椒粉质量的8～12倍；浸提时间为1.5～3小时。7.如权利要求5所述的一种防治松材线虫的组合物的制备方法，其特征是，所述步骤(2)加热回流提取3～4h。8.如权利要求5所述的一种防治松材线虫的组合物的制备方法，其特征是，所述步骤(1)、(2)稀释使用的有机溶剂为dmf。9.权利要求1-4中任一项所述的组合物在松材线虫防治方面的应用。

技术总结
本发明公开了一种防治松材线虫的组合物及其应用，该组合物是以花椒粗提物为主要活性成分，黄芪粗提物为增效成分复配而成；该组合物具有较高的杀松材线虫活性，600μg/mL组合物溶液处理松材线虫24h，松材线虫校正死亡率达99.33％；该组合物在林间能够有效预防松材线虫病发生，防治效果为79.59％，并且该组合物的制备工艺简单，使用简便，适合推广使用。适合推广使用。


技术研发人员：张雷 赵林 牛赡光 张淑静 周孟豪 朱昌宇 武海卫 陈凤霞
受保护的技术使用者：安徽森科生物科技有限公司
技术研发日：2023.07.11
技术公布日：2023/10/15