一种还原型谷胱甘肽响应的阳离子聚合物及其制法与应用的制作方法

1.本发明属于阳离子聚合物技术领域，具体涉及一种还原型谷胱甘肽响应的阳离子聚合物及其制法与应用。


背景技术：

2.随着生物技术的不断发展，以基因治疗(gene therapy)为技术手段的新一代疾病治疗方法在慢性病、肿瘤、遗传病等治疗领域正越来越受到各方的高度关注。基因治疗通过人工手段将具有特定遗传信息的基因输送至靶细胞并表达目标蛋白，实现对先天或后天基因缺陷造成病症的调节、治疗甚至治愈。病毒载体由于转染效率和表达效率高的优势得到了广泛的利用，但其本身的抗免疫原性、潜在的致瘤风险、基因装载量不足、制备工艺复杂、产率低等缺点严重制约了其发展。
3.聚阳离子作为合成载体，通过正负电荷静电作用，将dna/rna压缩成纳米复合物，以保护基因在生物体内免受酶降解等影响，同时基因被细胞摄取，从而实现基因治疗的疗效。聚乙烯亚胺(pei)、聚l-赖氨酸(pll)、聚β-氨基酯等各种合成的聚合物普遍报道用于基因递送。普遍地，pei25kda已被用作基因转染评价的金标准。尽管pei作为最有效的阳离子聚合物之一，普遍用于临床前和临床研究，但高正电荷密度对细胞膜的生物毒性限制了其临床应用。高分子量及长链结构有利于转染，虽然聚阳离子载体递送效率高，但受到生物毒性制约，难以临床应用。


技术实现要素：

4.本发明的主要目的在于提供一种还原型谷胱甘肽响应的阳离子聚合物及其制法与应用，以克服现有技术的不足。
5.为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
6.本发明实施例提供了一种还原型谷胱甘肽响应的阳离子聚合物，所述阳离子聚合物具有如式(i)所示的结构：
[0007][0008][0009]
其中，m为5～500，n为5～500。
[0010]
本发明实施例还提供了一种还原型谷胱甘肽响应的阳离子聚合物的制备方法，其包括：
[0011]
使己内酯与叔丁氧羰基保护的氨基硫内酯进行开环缩合反应，再经脱保护反应，制得还原型谷胱甘肽响应的阳离子聚合物。
[0012]
本发明实施例还提供了前述的制备方法制得的还原型谷胱甘肽响应的阳离子聚合物，所述阳离子聚合物具有如式(i)所示的结构：
[0013][0014]
其中，m为5～500，n为5～500。
[0015]
本发明实施例还提供了前述的还原型谷胱甘肽响应的阳离子聚合物在制备基因转染试剂或基因转染中的用途。
[0016]
本发明实施例还提供了一种基因转染试剂，其包括前述的还原型谷胱甘肽响应的阳离子聚合物。
[0017]
本发明实施例还提供了一种基因转染方法，其包括：
[0018]
将转染试剂与基因药物混合并进行孵育处理，制得基因药物纳米复合物；
[0019]
其中，所述转染试剂与基因药物至少通过静电作用形成所述基因药物纳米复合物；所述转染试剂包括前述的还原型谷胱甘肽响应的阳离子聚合物和/或前述的基因转染试剂。
[0020]
本发明实施例还提供了前述的基因转染方法制得的基因药物纳米复合物。
[0021]
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明提供一种具有高效基因递送能力的gsh响应性的阳离子聚合物(硫内酯功能化阳离子聚合物载体)，同时该硫内酯功能化阳离子聚合物载体较商业化pei25kda细胞毒性更小、摄取效率更高，具有基因治疗的潜在实用价值。
附图说明
[0022]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0023]
图1为本发明实施例1制备的硫内酯功能化阳离子聚合物载体的核磁氢谱图；
[0024]
图2是本发明实施例2中硫内酯功能化阳离子聚合物载体对huh-7细胞的细胞毒性图；
[0025]
图3是本发明实施例3中dna纳米复合物经动态光散射dls测试的水合粒径图；
[0026]
图4是本发明实施例3中dna纳米复合物经动态光散射dls测试的水合粒径图；
[0027]
图5a-图5b是本发明实施例4中不同gsh浓度条件下dna或rna纳米复合物的凝胶阻滞结果图；
[0028]
图6a-图6c是本发明实施例5中硫酯功能化载体与pei25kda转染荧光标记dna的体外细胞摄取图；
[0029]
图7a-图7c是本发明实施例5中硫酯功能化载体与pei25kda转染荧光标记rna的细胞摄取途。
具体实施方式
[0030]
鉴于现有技术的缺陷，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技
术方案，其主要是在阳离子聚合物中引入具有gsh响应的硫酯基团将是实现高效基因递送的有效方式。生理条件下，硫酯和硫醇的交换反应可实现阳离子聚合物的分子结构降解。载体能成功担载dna或rna，并在肿瘤细胞内刺激响应性降解，靶向高效释放基因药物，实现高的转染效率、生物相容性及细胞摄取效率。
[0031]
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0032]
具体的，作为本发明技术方案的一个方面，其所涉及的一种还原型谷胱甘肽响应的阳离子聚合物具有如式(i)所示的结构：
[0033][0034]
其中，m为5～500，n为5～500。
[0035]
本发明实施例的另一个方面还提供了一种还原型谷胱甘肽响应的阳离子聚合物的制备方法，其包括：
[0036]
使己内酯与叔丁氧羰基保护的氨基硫内酯进行开环缩合反应，再经脱保护反应，制得还原型谷胱甘肽响应的阳离子聚合物。
[0037]
在一些优选实施方案中，所述制备方法具体包括：
[0038]
使包含己内酯、叔丁氧羰基保护的氨基硫内酯和催化剂的第一混合反应体系于30～200℃进行开环缩合反应，制得第一中间产物；
[0039]
以及，使所述第一中间产物与三氟乙酸混合并于30～200℃进行脱保护反应，制得所述还原型谷胱甘肽响应的阳离子聚合物。
[0040]
进一步地，所述催化剂包括1，8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯和/或1 57-三叠氮双环(4.4.0)癸-5-烯，且不限于此。
[0041]
进一步地，所述第一中间产物具有如式(ii)所示的结构：
[0042][0043]
其中，m为5～500，n为5～500。
[0044]
进一步地，所述己内酯、叔丁氧羰基保护的氨基硫内酯与催化剂的摩尔比为5～95：95～5：0.1～10。
[0045]
进一步地，所述第一中间产物与三氟乙酸的摩尔比为50～95：1～30。
[0046]
进一步地，所述开环缩合反应的时间为0.5～48h。
[0047]
进一步地，所述脱保护反应的时间为0.5～48h。
[0048]
在一些优选实施方案中，所述制备方法还包括：先采用二碳酸二叔丁酯与氨基硫内酯进行反应，获得所述叔丁氧羰基保护的氨基硫内酯。
[0049]
进一步地，所述氨基硫内酯具有如式(iii)所示的结构：
[0050][0051]
在一些优选实施方案中，所述还原型谷胱甘肽响应的阳离子聚合物(亦记为：硫内酯功能化阳离子聚合物载体)的制备方法包括：
[0052]
己内酯与叔丁氧羰基保护的氨基硫内酯经1，8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯(dbu)催化开环缩合制，接着三氟乙酸(tfa)脱保护制得硫内酯功能化阳离子聚合物载体。
[0053]
具体反应方程如下式所示：
[0054][0055]
本发明实施例的另一个方面还提供了前述的制备方法制得的还原型谷胱甘肽响应的阳离子聚合物，所述阳离子聚合物具有如式(i)所示的结构：
[0056][0057]
其中，m为5～500，n为5～500。
[0058]
本发明实施例的另一个方面还提供了前述的还原型谷胱甘肽(ghs)响应的阳离子聚合物在制备基因转染试剂或基因转染中的用途。
[0059]
本发明实施例的另一个方面还提供了一种基因转染试剂，其包括前述的还原型谷胱甘肽响应的阳离子聚合物。
[0060]
本发明实施例的另一个方面还提供了一种基因转染方法，其包括：
[0061]
将转染试剂与基因药物混合并进行孵育处理，制得基因药物纳米复合物；
[0062]
其中，所述转染试剂与基因药物至少通过静电作用形成所述基因药物纳米复合物；所述转染试剂包括权利要求1或6所述的还原型谷胱甘肽响应的阳离子聚合物和/前述的基因转染试剂。
[0063]
进一步地，所述基因药物包括dna、rna、蛋白中的任意一种或两种以上的组合，且不限于此。
[0064]
进一步地，所述基因药物的分子量为2000～500000。
[0065]
进一步地，所述孵育处理的温度为30～40℃，时间为1～120min。
[0066]
在一些更为具体的实施方案中，所述基因转染的方法包括：将硫内酯功能化阳离子聚合物与基因药物分别以一定浓度分散在水中，混合、共孵育，经静电作用复合形成基因药物纳米复合物。
[0067]
本发明实施例的另一个方面还提供了前述的基因转染方法制得的基因药物纳米复合物。
[0068]
本发明利用刺激响应性的阳离子聚合物，实现高转染效率的同时有效降低细胞毒性。
[0069]
本发明中的还原型谷胱甘肽(ghs)响应的阳离子聚合物为智能可降解阳离子聚合物，具有足够的电荷密度、分子量及分子链长，能通过静电作用有效复合基因药物，并在生理环境中经刺激响应可被降解成小的片段，从而具有实现高基因转染效率和低细胞毒性的潜力。
[0070]
肿瘤细胞中还原型谷胱甘肽gsh浓度为普通细胞的10倍左右，本发明在阳离子聚合物中引入具有gsh响应的硫酯基团将是实现高效基因递送的有效方式。生理条件下，硫酯和硫醇的交换反应可实现阳离子聚合物的分子结构降解。载体能成功担载dna或rna，并在肿瘤细胞内刺激响应性降解，靶向高效释放基因药物，实现高的转染效率、生物相容性及细胞摄取效率。
[0071]
下面结合若干优选实施例及附图对本发明的技术方案做进一步详细说明，本实施例在以发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
[0072]
本案申请人通过细胞实验，体外验证转染效率和生物相容性，具体经凝胶阻滞、细胞摄取和转染效率实验，综合评价基因药物纳米复合物体外转染效果。
[0073]
下面所用的实施例中所采用的实验材料，如无特殊说明，均可由常规的生化试剂公司购买得到。
[0074]
本发明采用的试剂如：氨基硫内酯、boc酸酐、己内酯，二氯甲烷，1，8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯，1 57-三叠氮双环(4.4.0)癸-5-烯，灭菌水。
[0075]
测试仪器：动态光散射仪、酶标仪、凝胶显像仪、流式细胞仪、荧光显微镜等。
[0076]
实施例1
[0077]
氨基硫内酯boc保护；以boc保护的氨基硫内酯、己内酯、1，8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯为原料(三者的摩尔比为10∶10∶0.2)，用二氯甲烷做溶剂加热并于80℃进行开环缩合10h，进一步在tfa存在下并于80℃进行脱保护反应10h，制得硫内酯功能化阳离子聚合物载体，即还原型谷胱甘肽响应的阳离子聚合物。图1为制备的硫内酯功能化阳离子聚合物载体的核磁氢谱，从图中可以找到聚合物结构的特征峰。
[0078]
表1.硫内酯功能化阳离子聚合物载体的分子量及其分布
[0079]
[硫内酯]0：[己内酯]0分子量分子量分布3：1310001.75
[0080]
实施例2
[0081]
实施例1中硫内酯功能化阳离子聚合物载体的细胞毒性
[0082]
将huh-7细胞接种到96孔板上，细胞密度为1.0
×
104个/孔，加100ul含10％fbs、1％青霉素/链酶素的dmem完全培养基培养24h。吸掉上清液，更换培养基，加入10μl不同浓度的聚合物溶液，孵育48小时。pbs清洗细胞，加入100μl新培养基，向每孔加入10μlcck-8溶液，孵育1小时，用酶标仪测定在450nm处的吸光度。图2为硫酯载体对huh-7细胞的细胞毒性测试结果，在载体浓度高达3.13μg/ml时细胞毒性仍在80％以上，并且明显低于对应浓度的pei 25kda。
[0083]
实施例3
[0084]
实施例1中硫内酯功能化阳离子聚合物载体与dna或rna纳米复合物的制备
[0085]
将硫内酯功能化阳离子聚合物载体分散在灭菌水中，并与dna或rna溶液按所需重
量比(阳离子聚合物与核酸)轻轻混合。最后，将混合物涡旋5秒，在37℃培养箱孵育30分钟即制得基因纳米复合物。经动态光散射测得，在一定载体和基因质量比条件下，均可有效地将dna(160nm)或rna(110nm)压缩至200nm以内的纳米药物。该尺寸范围的纳米药物有利于细胞摄取。其中，硫内酯功能化阳离子聚合物载体/dna质量比w/w＝3时，制备的dna纳米复合物的水合粒径如图3所示；硫内酯功能化阳离子聚合物载体/dna质量比w/w＝15时，制备的dna纳米复合物的水合粒径如图4所示；
[0086]
实施例4
[0087]
琼脂糖凝胶电泳实验评估基因纳米复合物的还原响应性
[0088]
以硫内酯功能化阳离子聚合物载体/dna＝15或硫内酯功能化阳离子聚合物载体/rna＝3(w/w)复合，制备基因复合的纳米复合物，进行琼脂糖凝胶电泳实验。复合物gsh响应性通过在梯度浓度下孵育30分钟后电泳，90v电泳25分钟，然后通过凝胶显像仪观察结果。琼脂糖凝胶电泳照片见图5a、图5b，载体能实现有效阻滞dna或rna，并且10mm以内gsh浓度条件下可控释放。
[0089]
实施例5
[0090]
dna或rna纳米复合物的细胞摄取及转染效率评估
[0091]
荧光标记的pegfp和cy3sirna分别作为dna和rna的代表用于与硫内酯功能化阳离子聚合物载体(简写为：硫酯功能化载体)复合。将huh-7细胞接种到48孔板中，培养过夜，每孔含有1.5
×
104个细胞和200μl dmem。在转染前，将孔板中的旧培养基换成新鲜无血清培养基，其中含有本发明载体或pei25kda复合的dna或rna纳米颗粒(pegfp每孔200ng，w/w比率为3；cy3sirna每孔100nm，w/w比率为15)。未转染的细胞作为空白对照，培养6小时后，用荧光显微镜观察转染结果。如图6a-图6c和图7a-图7c所示，载体均显示出较pei25kda更好的细胞摄取和转染效率。
[0092]
实施例6
[0093]
氨基硫内酯boc保护；以boc保护的氨基硫内酯、己内酯、1 5 7-三叠氮双环(4.4.0)癸-5-烯为原料(三者的摩尔比为5：95：0.1)，用二氯甲烷做溶剂加热并于30℃进行开环缩合48h，进一步在tfa存在下并于30℃进行脱保护反应48h，制得硫内酯功能化阳离子聚合物载体，即还原型谷胱甘肽响应的阳离子聚合物。
[0094]
实施例7
[0095]
氨基硫内酯boc保护；以boc保护的氨基硫内酯、己内酯、1，8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯为原料(三者的摩尔比为95∶5∶5，用二氯甲烷做溶剂加热并于200℃进行开环缩合0.5h，进一步在tfa存在下并于200℃进行脱保护反应0.5h，制得硫内酯功能化阳离子聚合物载体，即还原型谷胱甘肽响应的阳离子聚合物。
[0096]
此外，本案发明人还参照前述实施例，以本说明书述及的其它原料、工艺操作、工艺条件进行了试验，并均获得了较为理想的结果。
[0097]
应当理解，本发明的技术方案不限于上述具体实施案例的限制，凡是在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落于本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种还原型谷胱甘肽响应的阳离子聚合物，其特征在于，所述阳离子聚合物具有如式(i)所示的结构：其中，m为5～500，n为5～500。2.一种还原型谷胱甘肽响应的阳离子聚合物的制备方法，其特征在于，包括：使己内酯与叔丁氧羰基保护的氨基硫内酯进行开环缩合反应，再经脱保护反应，制得还原型谷胱甘肽响应的阳离子聚合物。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，具体包括：使包含己内酯、叔丁氧羰基保护的氨基硫内酯和催化剂的第一混合反应体系于30～200℃进行开环缩合反应，制得第一中间产物；以及，使所述第一中间产物与三氟乙酸混合并于30～200℃进行脱保护反应，制得所述还原型谷胱甘肽响应的阳离子聚合物。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述催化剂包括1，8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯和/或1 5 7-三叠氮双环(4.4.0)癸-5-烯；和/或，所述第一中间产物具有如式(ii)所示的结构：其中，m为5～500，n为5～500；和/或，所述己内酯、叔丁氧羰基保护的氨基硫内酯与催化剂的摩尔比为5～95∶95～5∶0.1～10；和/或，所述第一中间产物与三氟乙酸的摩尔比为50～95∶1～30；和/或，所述开环缩合反应的时间为0.5～48h；和/或，所述脱保护反应的时间为0.5～48h。5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，还包括：先采用二碳酸二叔丁酯与氨基硫内酯进行反应，获得所述叔丁氧羰基保护的氨基硫内酯；优选的，所述氨基硫内酯具有如式(iii)所示的结构：6.由权利要求2-5中任一项所述的制备方法制得的还原型谷胱甘肽响应的阳离子聚合物，所述阳离子聚合物具有如式(i)所示的结构：
其中，m为5～500，n为5～500。7.权利要求1或6所述的还原型谷胱甘肽响应的阳离子聚合物在制备基因转染试剂或基因转染中的用途。8.一种基因转染试剂，其特征在于，包括权利要求1或6所述的还原型谷胱甘肽响应的阳离子聚合物。9.一种基因转染方法，其特征在于，包括：将转染试剂与基因药物混合并进行孵育处理，制得基因药物纳米复合物；其中，所述转染试剂与基因药物至少通过静电作用形成所述基因药物纳米复合物；所述转染试剂包括权利要求1或6所述的还原型谷胱甘肽响应的阳离子聚合物和/或权利要求8所述的基因转染试剂；优选的，所述基因药物包括dna、rna、蛋白中的任意一种或两种以上的组合；优选的，所述基因药物的分子量为2000～500000；优选的，所述孵育处理的温度为30～40℃，时间为1～120min。10.由权利要求9所述的基因转染方法制得的基因药物纳米复合物。

技术总结
本发明公开了一种还原型谷胱甘肽响应的阳离子聚合物及其制法与应用。所述阳离子聚合物具有如下式所示的结构：其中，m为5～500，n为5～500。本发明中的还原型谷胱甘肽响应的阳离子聚合物较商业化PEI25kDa细胞毒性更小、摄取效率更高，具有基因治疗的潜在实用价值。价值。价值。


技术研发人员：钱林生 赵德林 崔祥林
受保护的技术使用者：苏州锦博莱生物医药科技有限公司
技术研发日：2023.06.27
技术公布日：2023/10/15