一种微生物聚集浓缩及浓度探测装置与方法

1.本发明涉及细菌分析技术领域，具体说是一种微生物聚集浓缩及浓度探测装置与方法。尤指不均匀电场诱导的微生物聚集浓缩及浓度探测方法。


背景技术：

2.在食品安全领域中，微生物安全是至关重要的一部分。中国人口众多，每天需要消耗大量的食物。巨大的需求使得确保食品在生产过程中不被微生物污染变得十分困难。为监测市场中食品微生物污染情况，目前多通过平板计数法对大量样本进行抽检。若需要进一步分析微生物的核酸序列或蛋白质结构，则需要将细菌分离提纯后进行分子生物学分析或色谱分析。这三类方法虽然能够获得较为准确的微生物信息，但是因为存在操作复杂、耗时长等缺点，使得不适用于大量样品的快速检测。
3.拉曼光谱作为一种快速检测技术，能够通过反应化学键振动、拉伸、转动等信息来实现微生物的实时检测。为进一步降低拉曼光谱技术的检测限值，提高微生物检测稳定性，越来越多人在采集光谱信号前会通过离心、磁选等手段对微生物进行浓缩。但由于离心无法分离除微生物以外的其它物质，磁选在样品前处理过程中耗时较长，实验操作步骤较多。


技术实现要素：

4.针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种微生物聚集浓缩及浓度探测装置与方法。该装置由pdms微流体通道层和pt-玻璃电极层两部分组成，能够使多种微生物在不均匀电场的作用下高效分选与浓缩；具有适应性强、分选速度快、浓缩效率高等优点。另外，通过与拉曼光谱检测技术相结合，能够实现对液体介质中微生物的快速、稳定检测。
5.为达到以上目的，本发明采取的技术方案是：
6.一种微生物聚集浓缩及浓度探测装置，其特征在于，包括上基板和下基板，上基板和下基板之间设有pdms微流体通道层和pt电极层；
7.pdms微流体通道设有进样口与出样口，进样口和出样口与上基板上的多个开口分别连接；
8.pt电极层中设有电极负极与电极正极，电极负极与电极正极均为分叉结构；上述电极负极与电极正极的分叉结构的叉指相互交叉分布。
9.在上述方案的基础上，
10.所述的pdms微流体通道层为椭圆形，包括一个进样口和三个出样口，进样口与出样口2分别位于椭圆形通道长轴两端，出样口1和出样口3对称分布于椭圆形通道短轴两端；上述进样口和三个出样口与上基板上的四个开口分别连接。
11.在上述方案的基础上，
12.所述电极负极与电极正极的分叉结构均为扇形，上述电极负极与电极正极的扇形分叉结构的叉指相互交叉呈扇形分布；
13.上述电极负极中的一个叉指与其相邻的电极正极中的一个叉指之间的夹角为θ。
14.在上述方案的基础上，
15.在出样口1或出样口3处设置拉曼激光探头，用于获取浓缩微生物的浓度信息。
16.本发明的另一个目的在于提供一种微生物聚集浓缩及浓度检测方法。
17.为达到上述目的，本发明采取的技术方案为：
18.一种微生物聚集浓缩及浓度探测方法，其特征在于：包括如下步骤：
19.步骤1，将待处理微生物样品液从pdms微流体通道进样口注入探测装置；
20.步骤2，在pt电极层中的电极负极与电极正极之间施加电压，对微粒进行分选和浓缩；
21.步骤3，在出样口1和/或出样口3收集经过分选和浓缩的微生物，并使用拉曼激光探头获取浓缩微生物的浓度信息。
22.在上述方案的基础上，
23.步骤1中所述的将微生物样品液注入探测装置的方式包括注射器一次性注入或微流泵连续注入。
24.在上述方案的基础上，
25.步骤2中所述施加电压后，电极负极中的一个叉指与其相邻的电极正极中的一个叉指之间任意位置的场强e(r)如下式(1)所示，e(r)须小于待分离微生物的最大承受能力：
[0026][0027]
上式中，ε0为电极的介电常数；r为上述叉指之间任意位置距离扇形圆心处的距离；r1和r2分别为负极叉指尖和正极叉指尖到扇形圆心的距离，或者r1和r2分别为正极叉指尖和负极叉指尖到扇形圆心的距离；q为电极上的电荷值；u为施加的电压；θ为电极负极中的一个叉指与其相邻的电极正极中的一个叉指之间的角度；
[0028]
微生物在流体通道中受到的不均匀电场诱导力f
dep
(r)如下式(2)所示：
[0029][0030]
其中ε0、εm和ε
p
分别为电极、流体介质和微生物的介电常数；r
p
为微生物半径大小。
[0031]
在上述方案的基础上，
[0032]
采取微流泵连续注入方式时，微生物样品液的流动速度范围为：1-5mm/s。
[0033]
本发明所述的一种微生物聚集浓缩及浓度探测装置与方法，其有益效果为：
[0034]
1、本发明设计了一种不均匀电场诱导的微生物浓缩与分选装置。不仅能够分选具有不同介电常数的微生物，还能够实现对细菌悬液的50倍浓缩；
[0035]
2、通过拉曼探头检测，能够实现对100cfu/ml细菌的检测，拉曼光谱变异系数小于5％；
[0036]
3、本发明所诉的微生物浓缩与浓度探测装置与方法具有适应性强、浓缩效率高、检测速度快等优点。
附图说明
[0037]
本发明有如下附图：
[0038]
图1本发明一种微生物聚集浓缩与浓度检测装置结构示意图；
[0039]
图2微生物聚集浓缩与浓度检测装置场强分布示意图；
[0040]
图3流体静止状态下微生物的受力情况示意图；
[0041]
图4流体流动状态下微生物运动情况示意图；
[0042]
图5流体流通状态下微生物的分选浓缩示意图；
[0043]
图6本发明实施例1中微生物浓缩示意图；
[0044]
图7本发明实施例2中微生物浓缩示意图；
[0045]
图8本发明实施例3中微生物分选示意图(浅色为大肠杆菌，深色为沙门氏菌)。
具体实施方式
[0046]
以下结合附图对本发明作进一步详细说明。
[0047]
如图1、2所示，pt电极层中的电极负极与电极正极的分叉结构均为扇形，上述电极负极与电极正极的扇形分叉结构的叉指相互交叉呈扇形分布；电极负极和电极正极分别位于装置的上部和下部。电极正极和负极厚度均为100nm，通过磁控溅射和激光划片等工艺制作。
[0048]
为防止流体输入过程中产生气泡，以及样品输出时液体在流体通道中产生残留，微流体通道结构设计为椭圆形。进样口与出样口2分别位于椭圆形通道长轴两端，出样口1和出样口3对称分布于椭圆形通道短轴两端；高场强区域与出样口1相对应，低场强区域与出样口3相对应。
[0049]
上述电极负极中的一个叉指与其相邻的电极正极中的一个叉指之间任意位置场强e(r)可通过下式(1)计算：
[0050][0051]
上式中，ε0为电极的介电常数；r为上述叉指之间任意位置距离扇形圆心处的距离；r1和r2分别为负极叉指尖和正极叉指尖到扇形圆心的距离；q为电极上的电荷值，可通过改变施加电压大小进行控制；θ为电极负极中的一个叉指与其相邻的电极正极中的一个叉指之间的角度，用于调整电场强度的不均匀程度。
[0052]
合理选择q和θ值的大小，可以使得本装置适用于多种微生物的分选与浓缩。当作用于革兰氏阴性菌时，由于该种细菌容易受到电场的影响的损伤，所以在细菌浓缩时可以通过适当减小q值以保持细菌活性。当作用于介电常数较大的细菌时，细菌能够产生的较多的极化电荷，此时通过增大角度θ，加大场强分布不均匀度，能够提高细菌浓缩效率。
[0053]
如图3所示，微生物在流体通道中受到的不均匀电场诱导力大小可以通过下式(2)进行计算。
[0054][0055]
其中ε0、εm和ε
p
分别为电极、流体介质和微生物的介电常数；r
p
为微生物半径大小。若微生物的介电常数大于流体介质，则受正向诱导力，反之则受负向诱导力。力的方向指向或远离扇形圆心。
[0056]
将流体(待处理微生物样品液)使用注射器一次性注入探测装置，使得流体在初始
处于静止状态后施加电压，无论微生物处在流体通道哪个位置，在不均匀电场和通道壁弹力的作用下均会向出样口1或出样口3运动。此时，微生物受到流体曳力大小可通过式(3)计算：
[0057][0058]
其中μ为流体运动粘度；ρ
p
、d
p
和m
p
分别为微生物的密度、直径和质量；vm和v
p
分别为流体介质和微生物的绝对运动速度。流体速度为0时，曳力方向与微生物运动方向相反。通过增加施加电压值，能够加大微生物在不均匀电场中所受的力，使装置实现微生物高效浓缩。
[0059]
将流体(待处理微生物样品液)使用微流泵连续注入探测装置，使得流体在初始处于流动状态同时施加电压，微生物受到流体曳力方向与微生物和流体介质的相对运动方向有关。如图4所示，由于曳力的增大，(a)图中受正向作用力的微生物将从出样口1和出样口2排出，(b)图中受负向作用力的微生物将从出样口2和出样口3排出。此时该装置主要起微生物分选作用。
[0060]
如图5所示，通过增加施加电压值和降低流体流动速度，能够增加对微生物的不均匀电场诱导力作用，减少曳力作用。使受正、负向诱导力的微生物将分别从出样口1和出样口3排除。此时，该装置能够使微生物在分选的同时实现高效浓缩。其中，电压值需要小于微生物所能承受的最大值；流体速度范围为：1-5mm/s。
[0061]
对于受到正向诱导力的微生物，在不均匀电场的有效作用下向出样口1聚集。如图1所示，将拉曼激光探头放置于出样口1处，在拉曼效应作用下，可以快速获取浓缩微生物的浓度信息。
[0062]
实施例1：
[0063]
浓缩物质：大肠杆菌——限定微生物介电常数和物理参数，如质量、尺寸等。
[0064]
流体介质：普通缓冲液——介电常数一般在80左右。
[0065]
装置尺寸：r1＝0.2cm，r2＝2cm，θ＝π/36。
[0066]
此时，电压强度需小于大肠杆菌细胞膜的诱导电场，约为5000v/cm，即e(r1)≤5000v/cm，即施加电压需小于86伏，电荷q小于860库伦。流体介质流速为0(即流体采用注射器一次性注入方式)，或者流速限定范围为1-3mm/s(即流体采用微流泵注入方式)。
[0067]
使用微流泵将50μl大肠杆菌悬液按3mm/s的速度注入微流通道内，过程中出样口1和出样口3关闭，出样口2打开以排放废液。完成注射后关闭出样口2，打开出样口3，通过微流泵使1μl细菌样品从出样口3排出，最后使用拉曼光谱技术检测出样口3处的细菌浓度情况。整个过程在15分钟内可以完成。通过浓缩后的细菌拉曼信号能够根据浓缩倍数等比例放大。信号稳定性也能够同时得到提高，变异系数小于5％。
[0068]
以上限定后的仿真结果如图6所示。
[0069]
实施例2：
[0070]
浓缩物质：与氧化铁纳米颗粒充分混合的沙门氏菌溶液——限定介电常数和物理参数，如质量、尺寸等。
[0071]
流体介质：普通缓冲液——介电常数一般在80左右。
[0072]
装置尺寸：r1＝0.2cm，r2＝2cm，θ＝π/36。
[0073]
此时，施加电压需小于沙门氏菌细胞膜的诱导电场，约为10000v/cm，即e(r1)≤10000v/cm，即施加电压需小于172伏，电荷q小于1720库伦。流体介质流速为0(即流体采用注射器一次性注入方式)，或者流速限定范围为1-2mm/s(即流体采用微流泵注入方式)。
[0074]
使用微流泵将50μl处理后的沙门氏菌悬液按2mm/s的速度注入微流通道内，过程中出样口1和出样口3关闭，出样口2打开以排放废液。完成注射后关闭出样口2，打开出样口1，通过微流泵使1μl细菌样品从出样口1排出，最后使用拉曼光谱技术检测出样口1处的细菌浓度情况。整个过程在20分钟内可以完成。通过浓缩后的细菌拉曼信号能够根据浓缩倍数等比例放大。信号稳定性也能够同时得到提高，变异系数小于5％。
[0075]
仿真结果如图7所示。
[0076]
实施例3：
[0077]
分离物质：大肠杆菌和与氧化铁纳米颗粒充分混合的沙门氏菌。
[0078]
流体介质：普通缓冲液——介电常数一般在80左右。
[0079]
装置尺寸：r1＝0.2cm，r2＝2cm，θ＝π/36。
[0080]
此时，施加电压e(r1)≤5000v/cm，即施加电压需小于86伏，电荷q小于860库伦。流体介质流速为0(即流体采用注射器一次性注入方式)，或者流速限定范围为1-2mm/s(即流体采用微流泵注入方式)。
[0081]
使用微流泵将50μl混合细菌悬液按2mm/s的速度注入微流通道内，过程中出样口1和出样口3关闭，出样口2打开以排放废液。完成注射后关闭出样口2，依次打开出样口1和出样口3，通过微流泵使1μl细菌样品分别从出样口1和出样口3排出，最后使用拉曼光谱技术检测出样口3处的细菌浓度情况。整个过程在25分钟内可以完成。通过浓缩后的细菌拉曼信号能够根据浓缩倍数等比例放大。信号稳定性也能够同时得到提高，变异系数小于5％。
[0082]
仿真结果如图8所示。
[0083]
本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。

技术特征：
1.一种微生物聚集浓缩及浓度探测装置，其特征在于，包括上基板和下基板，上基板和下基板之间设有pdms微流体通道层和pt电极层；pdms微流体通道设有进样口与出样口，进样口和出样口与上基板上的多个开口分别连接；pt电极层中设有电极负极与电极正极，电极负极与电极正极均为分叉结构；上述电极负极与电极正极的分叉结构的叉指相互交叉分布。2.如权利要求1所述一种微生物聚集浓缩及浓度探测装置，其特征在于：所述的pdms微流体通道层为椭圆形，包括一个进样口和三个出样口，进样口与出样口2分别位于椭圆形通道长轴两端，出样口1和出样口3对称分布于椭圆形通道短轴两端；上述进样口和三个出样口与上基板上的四个开口分别连接。3.如权利要求2所述的一种微生物聚集浓缩及浓度探测装置，其特征在于：所述电极负极与电极正极的分叉结构均为扇形，上述电极负极与电极正极的扇形分叉结构的叉指相互交叉呈扇形分布；上述电极负极中的一个叉指与其相邻的电极正极中的一个叉指之间的夹角为θ。4.如权利要求3所述的一种微生物聚集浓缩机浓度探测装置，其特征在于，在出样口1或出样口3处设置拉曼激光探头，用于获取浓缩微生物的浓度信息。5.一种应用如权利要求3或4任意一项所述的探测装置的微生物聚集浓缩及浓度探测方法，其特征在于：包括如下步骤：步骤1，将待处理微生物样品液从pdms微流体通道进样口注入探测装置；步骤2，在pt电极层中的电极负极与电极正极之间施加电压，对微粒进行分选和浓缩；步骤3，在出样口1和/或出样口3收集经过分选和浓缩的微生物，并使用拉曼激光探头获取浓缩微生物的浓度信息。6.如权利要求5所述的一种微生物聚集浓缩及浓度探测方法，其特征在于：步骤1中所述的将微生物样品液注入探测装置的方式包括注射器一次性注入或微流泵连续注入。7.如权利要求6所述的一种微生物聚集浓缩及浓度探测方法，其特征在于：步骤2中所述施加电压后，电极负极中的一个叉指与其相邻的电极正极中的一个叉指之间任意位置的场强e(r)如下式(1)所示，e(r)须小于待分离微生物的最大承受能力：上式中，ε0为电极的介电常数；r为上述叉指之间任意位置距离扇形圆心处的距离；r1和r2分别为负极叉指尖和正极叉指尖到扇形圆心的距离，或者r1和r2分别为正极叉指尖和负极叉指尖到扇形圆心的距离；q为电极上的电荷值；u为施加的电压；θ为电极负极中的一个叉指与其相邻的电极正极中的一个叉指之间的角度；微生物在流体通道中受到的不均匀电场诱导力f
dep
(r)如下式(2)所示：其中ε0、ε
m
和ε
p
分别为电极、流体介质和微生物的介电常数；r
p
为微生物半径大小。
8.如权利要求7所述的一种微生物聚集浓缩及浓度探测方法，其特征在于：采取微流泵连续注入方式时，微生物样品液的流动速度范围为：1-5mm/s。

技术总结
本发明涉及一种微生物聚集浓缩及浓度探测装置与方法。所述探测装置包括上基板和下基板，上基板和下基板之间设有PDMS微流体通道层和Pt电极层，PDMS微流体通道设有进样口与出样口，进样口和出样口与上基板上的多个开口分别连接，Pt电极层中设有电极负极与电极正极，电极负极与电极正极均为分叉结构；上述电极负极与电极正极的分叉结构的叉指相互交叉分布。该装置适应性强、浓缩效率高、检测速度快，能够分选具有不同介电常数的微生物，还能够实现对细菌悬液的50倍浓缩；通过拉曼探头检测，能够实现对100CFU/mL细菌的检测，拉曼光谱变异系数小于5％。小于5％。小于5％。


技术研发人员：彭彦昆 陈雅惠 郭庆辉 赵鑫龙
受保护的技术使用者：中国农业大学
技术研发日：2023.05.23
技术公布日：2023/10/15