用于检测宫颈上皮内瘤样病变和宫颈鳞状细胞癌的核酸分子与试剂盒的制作方法

1.本技术涉及生物医学技术领域，具体涉及一种用于检测宫颈上皮内瘤样病变和宫颈鳞状细胞癌的核酸分子与试剂盒。


背景技术：

2.宫颈癌包括宫颈鳞状细胞癌和宫颈腺癌，其中，宫颈腺癌较宫颈鳞状细胞癌少见，在宫颈癌患者中，罹患宫颈鳞状细胞癌的患者所占比例约为80％至85％，罹患宫颈腺癌的患者所占比例约为10％至15％。
3.宫颈癌前病变也称为宫颈上皮内瘤样病变，根据cin(cervical intraepithelial neoplasia)分类系统，宫颈上皮内瘤样病变分为cin1、cin2以及cin3，其中，cin1为轻度宫颈上皮内瘤样病变，cin2为中度宫颈上皮内瘤样病变，cin3为高度宫颈上皮内瘤样病变，由于cin3的下一个阶段就是宫颈癌，所以cin3也称为原位癌(carcinoma in situ,cis)。目前广泛用于筛查宫颈癌和宫颈上皮内瘤样病变的方法主要有三种，第一种为细胞学筛查，第二种为醋酸/碘染色肉眼观察，第三种为人乳头瘤病毒(human papilloma virus,hpv)检测，其中，细胞学筛查和醋酸/碘染色肉眼观察具有取样不便、准确率不高、无法区分宫颈癌类别的缺点，hpv检测具有价格昂贵、无法区分宫颈癌类别的缺点。
4.因此，研发用于诊断或监测宫颈上皮内瘤样病变和宫颈鳞状细胞癌的核酸分子具有重要的临床、科研及社会价值。


技术实现要素：

5.针对现有技术的不足之处，本技术提供了一种用于检测宫颈上皮内瘤样病变和宫颈鳞状细胞癌的核酸分子与试剂盒。
6.本技术的技术方案如下：
7.第一方面，本技术提供了一种用于检测宫颈上皮内瘤样病变和宫颈鳞状细胞癌的核酸分子，包括：
8.(1)第一核酸分子，seq id no.1至seq id no.10所示核苷酸序列中的一种或几种的组合；和/或
9.(2)第二核酸分子，seq id no.11至seq id no.20所示核苷酸序列中的一种或几种的组合。
10.进一步地，所述核酸分子包括：
11.(1)第一核酸分子，seq id no.1至seq id no.10所示核苷酸序列中的至少五种的组合；和/或
12.(2)第二核酸分子，seq id no.11至seq id no.20所示核苷酸序列中的至少五种的组合。
13.进一步地，所述核酸分子包括：
14.(1)第一核酸分子，seq id no.1至seq id no.10所示核苷酸序列的全部组合；和/或
15.(2)第二核酸分子，seq id no.11至seq id no.20所示核苷酸序列的全部组合。
16.第二方面，本技术提供了一种用于检测宫颈上皮内瘤样病变和宫颈鳞状细胞癌的试剂盒，所述试剂盒包括：能够特异性检测受试样品的dna中seq id no.1至seq id no.20所示的任意一种或其中几种的核苷酸序列中甲基化水平的试剂，所述甲基化水平是每一核苷酸序列中甲基化cpg位点的数量占该核苷酸序列中cpg位点总数量的比例。
17.进一步地，所述试剂盒包括：
18.(a)修饰试剂，用于差异修饰所述受试样品的dna中甲基化cpg位点和非甲基化cpg位点；以及
19.(b)检测试剂，用于确定或辅助确定所述受试样品的dna中seq id no.1至seq id no.20所示的任意一种或其中几种的核苷酸序列的每一cpg位点是甲基化的还是非甲基化的。
20.进一步地，所述修饰试剂包括重亚硫酸盐及其衍生物；
21.和/或，所述检测试剂包括pcr试剂，所述pcr试剂包括特异性扩增seq id no.1至seq id no.20所示的任意一种或其中几种的核苷酸序列的引物对和/或特异性探针；
22.和/或，所述试剂盒还包括阳性对照物和/或阴性对照物；
23.其中，所述阳性对照物包括如seq id no.1至seq id no.20所示的任意一种核苷酸序列或其中几种核苷酸序列的组合，并且所述任意一种核苷酸序列或所述组合中的每一核苷酸序列分别含有甲基化cpg位点；
24.所述阴性对照物包括如seq id no.1至seq id no.20所示的任意一种核苷酸序列或其中几种核苷酸序列的组合，并且所述任意一种核苷酸序列或所述组合中的每一核苷酸序列均不含有甲基化cpg位点。
25.进一步地，所述试剂盒还包括dna提取试剂，用于从所述受试样品中提取和/或纯化dna。
26.进一步地，所述受试样品为血液、尿液、宫颈刮片、阴道分泌物、阴道冲洗物、子宫颈上皮细胞、手术后的离体组织或经纯化处理后的dna样品。
27.本技术还提供了如第二方面中所述的试剂盒的使用方法，所述使用方法包括步骤：
28.提供受试样品，采用所述修饰试剂处理所述受试样品或所述受试样品的dna，获得修饰处理的dna样本；
29.选择所述dna样本的检测序列组，所述检测序列组包括第一检测序列子组和/或第二检测序列子组，所述第一检测序列子组包含如seq id no.1至seq id no.10所示的任意一种核苷酸序列或至少两种核苷酸序列的组合，所述第二检测序列子组包含如seq id no.11至seq id no.20所示的任意一种核苷酸序列或至少两种核苷酸序列的组合；以及
30.采用所述检测试剂与所述dna样本反应，并测定所述检测序列组中各个核苷酸序列的cpg甲基化水平。
31.可选地，所述使用方法还包括步骤：比较检测序列组中每一核苷酸序列的甲基化水平与对应的预设阈值的大小。
32.可选，所述使用方法还包括步骤：比较所述第一检测序列子组的cpg甲基化水平的均值与第一参考值的大小，和/或比较所述第二检测序列子组的cpg甲基化水平的均值与第二参考值的大小；
33.其中，若所述第一检测序列子组的cpg甲基化水平的均值大于或等于第一参考值，和/或所述第二检测序列子组的cpg甲基化水平的均值小于或等于第二参考值时，则判定所述受试样品为阳性；
34.若所述第一检测序列子组的cpg甲基化水平的均值小于第一参考值，且所述第二检测序列子组的cpg甲基化水平的均值大于第二参考值时，则判定所述受试样品为阴性。
35.进一步地，所述第一参考值为：正常个体集合的dna中所述第一检测序列子组的cpg甲基化水平的均值的特定倍数，所述特定倍数为4.1至6.2之间的任意一个数值，所述正常个体集合包括三个或三个以上正常个体；
36.和/或，所述第二参考值为：正常个体集合的dna中所述第二检测序列子组的cpg甲基化水平的均值的特定百分比数，所述特定百分比数为12.5％至51％之间的任意一个数值，所述正常个体集合包括三个或三个以上正常个体。
37.有益效果：本技术提供了一种用于检测宫颈上皮内瘤样病变和宫颈鳞状细胞癌的核酸分子与试剂盒，所述核酸分子包括第一核酸分子和/或第二核酸分子，所述核酸分子作为宫颈上皮内瘤样病变和宫颈鳞状细胞癌筛查、监测及诊断的分子标志物，具有敏感性高、特异性强、准确率高、稳定性理想的优点，可以应用于临床实践以指导宫颈上皮内瘤样病变和宫颈鳞状细胞癌的治疗/预防方案，具有重要的临床、科研及社会价值。
38.所述试剂盒是通过检测dna样本中检测序列组的cpg甲基化水平来筛查、监测及诊断宫颈上皮内瘤样病变和宫颈鳞状细胞癌，受试样品可以是血液、尿液、宫颈刮片、阴道分泌物、阴道冲洗物、子宫颈上皮细胞、手术后的离体组织或经纯化处理后的dna样品，能够实现无创检测，具有广泛的应用前景。
附图说明
39.图1为本技术实施例2中对公共数据进行验证所得的roc曲线；
40.图2为本技术实施例3中对公共数据进行验证所得的roc曲线；
41.图3为本技术实施例4中对公共数据进行验证所得的roc曲线。
具体实施方式
42.本技术研究了一种用于检测宫颈上皮内瘤样病变和宫颈鳞状细胞癌的核酸分子与试剂盒，其中，用于检测宫颈上皮内瘤样病变和宫颈鳞状细胞癌的核酸分子包括第一核酸分子和/或第二核酸分子，其中，第一核酸分子为seq id no.1至seq id no.10所示核苷酸序列中的一种或几种的组合；第二核酸分子为seq id no.11至seq id no.20所示核苷酸序列中的一种或几种的组合。
43.其中，seq id no.1至seq id no.10所示核苷酸序列的具体信息详见下表1：
44.表1 seq id no.1至seq id no.10所示核苷酸序列的具体信息
[0045][0046]
其中，seq id no.11至seq id no.20所示核苷酸序列的具体信息详见下表2：
[0047]
表2 seq id no.11至seq id no.20所示核苷酸序列的具体信息
[0048][0049][0050]
可以理解的是，第一核酸分子可以为seq id no.1至seq id no.10所示核苷酸序列中的两种或两种以上的组合；第二核酸分子可以为seq id no.11至seq id no.20所示核苷酸序列中的两种或两种以上的组合。
[0051]
第一核酸分子还可以为seq id no.1至seq id no.10所示核苷酸序列中的三种或三种以上的组合，例如，第一核酸分子包括如seq id no.1至seq id no.3所示的核苷酸序列；第二核酸分子还可以为seq id no.11至seq id no.20所示核苷酸序列中的三种或三种以上的组合，例如第二核酸分子包括如seq id no.11至seq id no.13所示的核苷酸序列。
[0052]
第一核酸分子还可以为seq id no.1至seq id no.10所示核苷酸序列中的五种或五种以上的组合；第二核酸分子还可以为seq id no.11至seq id no.20所示核苷酸序列中的五种或五种以上的组合。
[0053]
第一核酸分子还可以为seq id no.1至seq id no.10所示核苷酸序列的全部组合；第二核酸分子还可以为seq id no.11至seq id no.20所示核苷酸序列的全部组合。
[0054]
可以理解的是，当核酸分子包含第一核酸分子和第二核酸分子时，第一核酸分子包含的核苷酸序列的数目可以与第二核酸分子包含的核苷酸序列的数目不相同，例如第一核酸分子为seq id no.1至seq id no.10所示核苷酸序列中的两种，第二核酸分子为seq id no.11至seq id no.20所示核苷酸序列中的五种。
[0055]
在本技术的一些实施例中，核酸分子中每一核苷酸序列均不包括甲基化cpg位点，使得核酸分子可以作为阴性对照物。在本技术的另一些实施例中，核酸分子中的至少一种核苷酸序列包括甲基化cpg位点，使得核酸分子可以作为阳性对照物。
[0056]
如本技术所用，“cpg位点”是指胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(methylated cpg)位点。
[0057]
本技术实施例还提供了一种试剂盒，包括能够特异性检测受试样品的dna中seq id no.1至seq id no.20所示的任意一种或其中几种的核苷酸序列中甲基化水平的试剂，其中，“甲基化水平”是指cpg位点的甲基化水平，具体是指每一核苷酸序列中甲基化cpg位点的数量占该核苷酸序列中cpg位点总数量的比例。因此，不同核苷酸序列的cpg位点的数量可能不相同，但是cpg位点的甲基化水平可能相同；此外，不同核苷酸序列的cpg位点的甲基化水平相同并不意味着不同核苷酸序列的同一个cpg位点均会同等发生甲基化或者同等不发生甲基化。
[0058]
本技术实施例的试剂盒包括修饰试剂和检测试剂，其中，修饰试剂用于差异修饰受试样品的dna中甲基化cpg位点和非甲基化cpg位点，检测试剂用于确定或辅助确定受试样品的dna中seq id no.1至seq id no.20所示的任意一种或其中几种的核苷酸序列的每一cpg位点是甲基化的还是非甲基化的。
[0059]
在本技术的一些实施例中，修饰试剂包括重亚硫酸盐及其衍生物。
[0060]
在本技术的一些实施例中，检测试剂包括pcr试剂，所述pcr试剂包括特异性扩增seq id no.1至seq id no.20所示的任意一种或其中几种的核苷酸序列的引物对和/或特异性探针，每个特异性引物对包括正向引物和反向引物。
[0061]
如本技术所用，“引物”是指在pcr反应中用作dna复制反应起始子的寡核苷酸序列，本领域技术人员根据已知序列信息的核苷酸序列知晓用于其pcr扩增的引物对设计方法。
[0062]
如本技术所用，“探针”是指是一段带有检测标记，且顺序已知的，并与目的基因互补的核酸序列(dna或rna)。
[0063]
在本技术的一些实施例中，试剂盒还包括阳性对照物和/或阴性对照物，其中，阳性对照物包括如seq id no.1至seq id no.20所示的任意一种核苷酸序列或其中几种核苷酸序列的组合，并且所述任意一种核苷酸序列或所述组合中的每一核苷酸序列分别含有甲基化cpg位点；阴性对照物包括如seq id no.1至seq id no.20所示的任意一种核苷酸序列或其中几种核苷酸序列的组合，并且所述任意一种核苷酸序列或所述组合中的每一核苷酸序列均不含有甲基化cpg位点。
[0064]
在本技术的一些实施例中，试剂盒还包括dna提取试剂，用于从受试样品中提取和/或纯化dna。
[0065]
在本技术的一些实施例中，受试样品为血液、尿液、宫颈刮片、阴道分泌物、阴道冲洗物、子宫颈上皮细胞、手术后的离体组织或经纯化处理后的dna样品，例如，来源于手术切除术或活组织检查(例如来自患者活组织检查的细胞)的肿瘤材料、组织或体液，例如血液或者活组织。组织可以以任何合适的方法移除，例如穿刺活组织检查、吸引术、刮擦、利用手术切除法切除。合适的样品包含总的肿瘤材料，即肿瘤浸润白细胞(til)、基质和肿瘤细胞。任选地，样品可以为切除的肿瘤碎片。样品可以在一个或多个时间点获得。任选地，在通过本技术方法分析材料前，可以利用一种或多者收集后制备或储存技术对样品进行处理(例如：固定、储存、冷冻、裂解、匀浆、dna或rna抽提、cdna转化、超滤、稀释(例如使用盐水、缓冲剂或生理上可接受的稀释剂等进行稀释)、浓缩、蒸发、离心、分离、过滤等)。
[0066]
相应地，本技术实施例还提供了上述试剂盒的使用方法，包括步骤：
[0067]
s1、供受试样品，采用修饰试剂处理受试样品或受试样品的dna，获得修饰处理的dna样本；
[0068]
s2、选择dna样本的检测序列组，所述检测序列组包括第一检测序列子组和/或第二检测序列子组，第一检测序列子组包含如seq id no.1至seq id no.10所示的任意一种核苷酸序列或至少两种核苷酸序列的组合，第二检测序列子组包含如seq id no.11至seq id no.20所示的任意一种核苷酸序列或至少两种核苷酸序列的组合；
[0069]
s3、采用检测试剂与dna样本反应，并测定所述检测序列组中各个核苷酸序列的cpg甲基化水平。
[0070]
可以理解的是，可采用本领域已知的dna甲基化水平检测方法检测各个核苷酸序列的甲基化水平，例如甲基化特异性pcr方法、亚硫酸氢盐处理及测序方法、联合亚硫酸氢钠的限制性内切酶分析方法、荧光定量pcr方法、甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析方法或焦磷酸测序方法，并且本领域技术人员知晓将检测dna甲基化的方法所得的结果转化为甲基化水平的过程。
[0071]
在本技术的一些实施例中，所述使用方法还包括步骤：比较检测序列组中每一核苷酸序列的甲基化水平与对应的预设阈值的大小，其中，预设阈值可以是正常个体集合中对应核苷酸序列的甲基化水平的均值，正常个体集合包括三个或三个以上正常个体。
[0072]
在本技术的另一些实施例中，所述使用方法还包括步骤：比较所述第一检测序列子组的cpg甲基化水平的均值与第一参考值的大小，和/或比较所述第二检测序列子组的cpg甲基化水平的均值与第二参考值的大小；
[0073]
其中，若所述第一检测序列子组的cpg甲基化水平的均值大于或等于第一参考值，和/或所述第二检测序列子组的cpg甲基化水平的均值小于或等于第二参考值时，则判定所述受试样品为阳性；
[0074]
若所述第一检测序列子组的cpg甲基化水平的均值小于第一参考值，且所述第二检测序列子组的cpg甲基化水平的均值大于第二参考值时，则判定所述受试样品为阴性。
[0075]
如本技术所用，“第一检测序列子组的cpg甲基化水平的均值”是指第一检测序列子组中所有核苷酸序列的甲基化水平的平均值，例如第一检测序列子组由seq id no.1至seq id no.3所示的三种核苷酸序列组成，seq id no.1所示的核苷酸序列的甲基化水平为
a1，seq id no.2所示的核苷酸序列的甲基化水平为a2，seq id no.3所示的核苷酸序列的甲基化水平为a3，则第一检测序列子组的cpg甲基化水平的均值为(a1+a2+a3)/3；又如，第一检测序列子组仅由seq id no.1所示的核苷酸序列组成，则第一检测序列子组的甲基化水平的平均值即为seq id no.1所示的核苷酸序列的甲基化水平。同理，“第二检测序列子组的cpg甲基化水平的均值”是指第二检测序列子组中所有核苷酸序列的甲基化水平的平均值。
[0076]
在本技术的一些实施例中，第一参考值为：正常个体集合的dna中所述第一检测序列子组的cpg甲基化水平的均值的特定倍数，所述特定倍数为4.1至6.2之间的任意一个数值，正常个体集合包括三个或三个以上正常个体。
[0077]
进一步地，第二参考值为：正常个体集合的dna中所述第二检测序列子组的cpg甲基化水平的均值的特定百分比数，所述特定百分比数为12.5％至51％之间的任意一个数值，正常个体集合包括三个或三个以上正常个体。
[0078]
下面将结合本技术实施例中的附图，对本技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本技术中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本技术保护的范围。如本技术所用，“第一”和“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”和“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个所述特征。如本技术所用，“患者”是指首诊罹患宫颈上皮内瘤样病变或宫颈鳞状细胞癌的人类和其他哺乳类动物，患者可以是正在接受宫颈上皮内瘤样病变或宫颈鳞状细胞癌治疗的个体，或是希望使用本技术方法进行分析或治疗的任何个体。任选地，患者可以是正处于i、ii、iii或iv期的宫颈鳞状细胞癌，例如可以是i或ii期患者，或也可以是ii或iii期患者，或还可以是iii或iv期患者。任选地，患者还可以是正处于cin1、cin2或cin3的宫颈上皮内瘤样病变。如本技术所用，“受试者”是指采用本技术技术方案进行检测、分析或治疗的任何个体，包括首诊罹患宫颈上皮内瘤样病变或宫颈鳞状细胞癌的人类和其他哺乳类动物，还包括未罹患宫颈上皮内瘤样病变和宫颈鳞状细胞癌的人类和其他哺乳类动物。
[0079]
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本技术中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用，但不能限制本技术的内容。
[0080]
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过本领域已知方法制备。
[0081]
本技术实施例中涉及的全基因组提取、构建wgbs文库、wgbs测序以及数据处理均由北京诺和致源科技股份有限公司完成。
[0082]
本技术实施例中涉及的试剂盒tiangen dp304购置于天根生化科技(北京)有限公司；ez dna methylation-goldtm试剂盒购自美国zymo research公司；dna浓度测定试剂盒购置于美国加利福尼亚州生命技术公司；
[0083]
本技术实施例中涉及的agilent bioanalyzer 2100仪器购置于安捷伦；qubit2.0荧光计购自美国life technologies公司；分光光度计购自美国implen公司。
[0084]
本技术实施例中所有操作均符合制造商的说明。
[0085]
本技术实施例涉及的受试样品来源于广州医科大学附属第三医院的生物库，共涉及18例患者的离体样本，其中，6例患者在组织学上首次被诊断为低等级宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasias 1,cin1)，对应的受试样品为手术切除的宫颈病变组织，分别为样品1至样品6；5例患者在组织学上首次被诊断为高等级宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasias 3,cin3)，对应的受试样品为手术切除的宫颈病变组织，分别为样品7至样品11；2例患者在组织学上首次被诊断为宫颈腺癌(adenocarcinoma of cervix,cca)，对应的受试样品为手术切除的宫颈癌变组织(置于-80℃的条件下保存)，分别为样品12和样品13；5例患者在组织学上首次被诊断为宫颈鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma,ccs)，对应的受试样品为手术切除的宫颈癌变组织(置于-80℃的条件下保存)，分别为样品14至样品18。本次研究方案不包括宫颈癌复发患者，并已获得每个中心伦理委员会的批准，并且在手术前已获得每位患者的书面知情同意。
[0086]
本技术实施例涉及的对照组来源于5例健康女性(身体各项指标正常，且子宫颈未发生病变)的离体样本，离体样本均为宫颈刮片，分别对应对照1至对照5。
[0087]
实施例1
[0088]
将18例受试样品和5例对照样品分别进行全基因组dna提取、全基因组dna甲基化测序(whole genome bisulfite sequencing,wgbs)以及测序结果分析操作，包括如下步骤：
[0089]
s1.1、采用tiangendp304试剂盒对各个受试样品/对照样品分别进行全基因组提取操作，并通过琼脂糖凝胶电泳监测dna的降解与污染，获得全基因组dna；
[0090]
s1.2、采用分光光度计(implen,ca,usa)测定步骤s1.1的全基因组dna纯度，并使用与2.0荧光计配套使用的dna浓度测定试剂盒检测全基因组dna的浓度，然后采用超声波dna破碎仪(covaris s220)将全基因组dna超声处理至多个200bp至300bp的dna片段，再加末端修复和腺苷酸化，以将掺有26ngλdna的全基因组dna(总量为5.2μg)片段化；
[0091]
s1.3、按照制造商的说明条件，将胞嘧啶甲基化的条形码连接于步骤s1.2中经超声处理后获得的dna片段上，获得连接dna片段；
[0092]
s1.4、采用ez dna methylation-goldtm试剂盒处理步骤s1.3的连接dna片段两次，获得经亚硫酸氢盐处理的单链dna片段；
[0093]
s1.5、采用kapa hifi hotstart uracil和readymix(2x)试剂盒对步骤s1.4中经亚硫酸氢盐处理的单链dna片段进行pcr扩增，获得wgbs文库，利用qubit2.0荧光计和荧光定量pcr测定wgbs文库的浓度，且在agilent bioanalyzer 2100系统上测定插入片段的大小；
[0094]
s1.6、对步骤s1.5的wgbs文库进行测序，测序深度至少达到30
×
，然后利用moabs系列软件分析测序数据，获得wgbs文库中各个dna片段的胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤二核苷酸甲基化水平、全基因组dna中胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤二核苷酸的深度与覆盖度，以及全基因组dna的平均甲基化水平，其中，全基因组dna的平均甲基化水平是指wgbs文库中各个dna片段的胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤二核苷酸甲基化水平的均值。
[0095]
需要说明的是，seq id no.1至seq id no.10所示核苷酸序列分别对应区间一至区间十，通过步骤s1.1至s1.6获得各个受试样品/对照样品在区间一至区间十的cpg位点甲基化水平，实验结果详见下表3和表4：
[0096]
表3 18例受试样品和5例对照样品的全基因组dna中区间一至区间十的cpg位点甲基化水平
[0097]
[0098][0099]
备注：null表示空值，空值不参与平均值的计算，0.00表示未发生甲基化，其他数值代表甲基化水平。
[0100]
由表3的实验数据可知，对照1至对照5组成正常个体集合，正常个体集合在区间一至区间十的甲基化水平的平均值为0.14((0.12+0.15+0.12+0.22+0.10)/5)，首诊为cin1患者的受试样品dna(样品1至样品6)在区间一至区间十的cpg位点甲基化水平的均值为正常个体集合的平均值的2至4.7倍，首诊为cin3患者的受试样品dna(样品7至样品11)在区间一至区间十的cpg位点甲基化水平的均值为正常个体集合的平均值的4.1至4.9倍，首诊为cca患者的受试样品dna(样品12和样品13)在区间一至区间十的cpg位点甲基化水平的均值为正常个体集合的平均值的1.7至5.0倍，首诊为ccs患者的受试样品dna(样品14至样品18)在区间一至区间十的cpg位点甲基化水平的均值为正常个体集合的平均值的5.5倍至6.2倍。相较于正常个体，罹患宫颈上皮内瘤样病变(cin1至cin3)、cca和ccs的患者的受试样品dna中区间一至区间十的cpg位点甲基化水平的均值均显著升高。
[0101]
另外，seq id no.11至seq id no.20所示核苷酸序列分别对应区间十一至区间二十，通过步骤s1.1至s1.6获得各个受试样品/对照样品在区间十一至区间二十的cpg位点甲基化水平，具体详见下表4：
[0102]
表4 18例受试样品和5例对照样品的全基因组dna中区间十一至区间二十的cpg位
点甲基化水平
[0103]
[0104][0105]
由表4可知，对照1至对照5组成正常个体集合，正常个体集合在区间一至区间十的甲基化水平的平均值为0.80((0.81+0.79+0.79+0.81+0.81)/5)，首诊为cin1患者的受试样品dna(样品1至样品6)在区间十一至区间二十的cpg位点甲基化水平的均值为正常个体集合的平均值的41％至66％，首诊为cin3患者的受试样品dna(样品7至样品11)在区间十一至区间二十的cpg位点甲基化水平的均值为正常个体集合的平均值的39％至51％，首诊为cca患者的受试样品dna(样品12和样品13)在区间十一至区间二十的cpg位点甲基化水平的均值为正常个体集合的平均值的56％至68％，首诊为ccs患者的受试样品dna(样品14至样品18)在区间十一至区间二十的cpg位点甲基化水平的均值为正常个体集合的平均值的12.5％至29％。相较于正常个体，罹患宫颈上皮内瘤样病变(cin1至cin3)、cca和ccs的患者的受试样品dna中区间十一至区间二十的cpg位点甲基化水平的均值均显著降低。
[0106]
综上所述，当受试样品dna中区间一至区间十的cpg位点甲基化水平的均值为正常个体集合的平均值的4.1倍至6.2倍，且受试样品dna中区间十一至区间二十的cpg位点甲基化水平的均值为正常个体集合的平均值的12.5％至51％时，受试样品dna所对应的受试者罹患有cin1、或cin3、或ccs。
[0107]
实施例2
[0108]
对seq id no.1～10进行公共数据验证，所获得的公共数据包括：srr12768832(ccs)、srr12768834(cin3)、srr12768835(cin3)、srr12768836(cin2)、srr12768837(cin2)、srr12768840(cin1)、srr12768851(cin1)以及srr12768860(ccs)。其中，上述公共数据是从美国sra数据库中获取到的样本数据，数字代表样本的编号，数据库地址为：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra。根据本技术的方法对上述公共数据进行验证，结果如下表5所示。根据表5计算得出的灵敏度(sensitivity)数值为1，特异性(specificity)数值为1。本实施例的灵敏度数值和特异性数值的验证结果针对上述所获取的公共数据负责。roc曲线如图1所示。
[0109]
表5公共数据对seq id no.1～10的验证结果一览表
rate)。所以图1中横坐标false positive rate等价于100％-specificity％，纵坐标true positive rate等价于sensitivity％。
[0117]
如上，公共数据的验证结果表明：seq id no.1～10在宫颈上皮内瘤样病变患者和宫颈鳞状细胞癌患者间具有良好的区分度。
[0118]
实施例3
[0119]
对seq id no.11～20进行公共数据验证，所获得的公共数据包括：srr12768832(ccs)、srr12768834(cin3)、srr12768835(cin3)、srr12768836(cin2)、srr12768837(cin2)、srr12768840(cin1)、srr12768851(cin1)以及srr12768860(ccs)，本实施例的灵敏度数值和特异性数值的验证结果针对前述所获取的公共数据负责。验证结果如下表7所示：
[0120]
表7公共数据对seq id no.11～20的验证结果一览表
[0121]
公共数据编号样本的预测概率srr12768832(ccs)0.68srr12768834(cin3)0.06srr12768835(cin3)0.04srr12768836(cin2)0.46srr12768837(cin2)0.32srr12768840(cin1)0.26srr12768851(cin1)0.49srr12768860(ccs)0.98
[0122]
表7中样本的预测概率是根据表4的甲基化指标训练出癌症检测模型，然后对测试样本进行分类所得到的患癌概率。表7中的样本的预测概率与表4的甲基化水平指标不同。具体而言，表7中样本预测概率的来源为：根据实施例1中seq id no.11～20的甲基化数值训练出癌症检测模型，然后输入测试样本(即上述获取到的公共数据)的seq id no.11～20的甲基化指标至预训练的癌症检测模型中，从而获得样本预测概率。
[0123]
根据表7计算得出的灵敏度(sensitivity)数值为1，特异性(specificity)数值为1，roc曲线如图2所示。具体的计算方法和roc曲线的绘制方法参见实施例2。
[0124]
如上，公共数据的验证结果表明：seq id no.11～20在宫颈上皮内瘤样病变患者和宫颈鳞状细胞癌患者间具有良好的区分度。
[0125]
实施例4
[0126]
对seq id no.1～20进行公共数据验证，所获得的公共数据包括：srr12768832(ccs)、srr12768834(cin3)、srr12768835(cin3)、srr12768836(cin2)、srr12768837(cin2)、srr12768840(cin1)、srr12768851(cin1)以及srr12768860(ccs)，本实施例的灵敏度数值和特异性数值的验证结果针对前述所获取的公共数据负责。验证结果如下表8所示：
[0127]
表8公共数据对seq id no.1～20的验证结果一览表
[0128]
[0129][0130]
表8中样本的预测概率是根据表3和表4的甲基化指标训练出癌症检测模型，然后对测试样本进行分类所得到的患癌概率。表8中的样本的预测概率与表3、表4中的甲基化水平指标不同。具体而言，表8中样本预测概率的来源为：根据实施例1中seq id no.1～20的甲基化数值训练出癌症检测模型，然后输入测试样本(即上述获取到的公共数据)的seq id no.1～20的甲基化指标至预训练的癌症检测模型中，从而获得样本预测概率。
[0131]
根据表8计算得出的灵敏度(sensitivity)数值为1，特异性(specificity)数值为1，roc曲线如图3所示。具体的计算方法和roc曲线的绘制方法参见实施例2。
[0132]
如上，公共数据的验证结果表明：seq id no.1～20在宫颈上皮内瘤样病变患者和宫颈鳞状细胞癌患者间具有良好的区分度。
[0133]
在上述实施例中，对各个实施例的描述都各有侧重，某个实施例中没有详述的部分，可以参见其他实施例的相关描述。需要说明的是，表3和表4中存在null数据，在训练模型之前，先针对上述表中的缺失值null进行填充，填充方法包括但不限于是mice或missforest。本技术实施例通过mice利用序列之间的相关性对缺失值null进行填补，然后进行下一步计算。
[0134]
上述实施例2至实施例4所采用的预测模型如下式(ⅰ)：
[0135]
y＝f(w1，x1，......，w
20
x
20
)+δ
ꢀꢀ
(ⅰ)
[0136]
在式(ⅰ)中，y表示样本标签向量，xi，(i＝1，...，20)表示序列i的甲基化水平，δ为预测误差。以实施例2为例，先根据表3的样本甲基化水平训练模型，得出估计的序列i效应值wi，(i＝1，...，20)，针对待测样本输入其序列的甲基化水平，并输出预测概率。
[0137]
以上对本技术实施例所提供的一种用于检测宫颈上皮内瘤样病变和宫颈鳞状细胞癌的核酸分子与试剂盒，进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本技术的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本技术的技术方案及其核心思想；本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本技术各实施例的技术方案的范围。

技术特征：
1.一种用于检测宫颈上皮内瘤样病变和宫颈鳞状细胞癌的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包括：(1)第一核酸分子，seq id no.1至seq id no.10所示核苷酸序列中的一种或几种的组合；和/或(2)第二核酸分子，seq id no.11至seq id no.20所示核苷酸序列中的一种或几种的组合。2.根据权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包括：(1)第一核酸分子，seq id no.1至seq id no.10所示核苷酸序列中的至少五种的组合；和/或(2)第二核酸分子，seq id no.11至seq id no.20所示核苷酸序列中的至少五种的组合。3.根据权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包括：(1)第一核酸分子，seq id no.1至seq id no.10所示核苷酸序列的全部组合；和/或(2)第二核酸分子，seq id no.11至seq id no.20所示核苷酸序列的全部组合。4.一种用于检测宫颈上皮内瘤样病变和宫颈鳞状细胞癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：能够特异性检测受试样品的dna中seq id no.1至seq id no.20所示的任意一种或其中几种的核苷酸序列中甲基化水平的试剂，所述甲基化水平是每一核苷酸序列中甲基化cpg位点的数量占该核苷酸序列中cpg位点总数量的比例。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：(a)修饰试剂，用于差异修饰所述受试样品的dna中甲基化cpg位点和非甲基化cpg位点；以及(b)检测试剂，用于确定或辅助确定所述受试样品的dna中seq id no.1至seq id no.20所示的任意一种或其中几种的核苷酸序列的每一cpg位点是甲基化的还是非甲基化的。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述修饰试剂包括重亚硫酸盐及其衍生物；和/或，所述检测试剂包括pcr试剂，所述pcr试剂包括特异性扩增seq id no.1至seq id no.20所示的任意一种或其中几种的核苷酸序列的引物对和/或特异性探针；和/或，所述试剂盒还包括阳性对照物和/或阴性对照物；其中，所述阳性对照物包括如seq id no.1至seq id no.20所示的任意一种核苷酸序列或其中几种核苷酸序列的组合，并且所述任意一种核苷酸序列或所述组合中的每一核苷酸序列分别含有甲基化cpg位点；所述阴性对照物包括如seq id no.1至seq id no.20所示的任意一种核苷酸序列或其中几种核苷酸序列的组合，并且所述任意一种核苷酸序列或所述组合中的每一核苷酸序列均不含有甲基化cpg位点。7.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dna提取试剂，用于从所述受试样品中提取和/或纯化dna。8.根据权利要求4至7任一项中所述的试剂盒，其特征在于，所述受试样品为血液、尿液、宫颈刮片、阴道分泌物、阴道冲洗物、子宫颈上皮细胞、手术后的离体组织或经纯化处理
后的dna样品。9.如权利要求4至8所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，所述使用方法包括步骤：提供受试样品，采用所述修饰试剂处理所述受试样品或所述受试样品的dna，获得修饰处理的dna样本；选择所述dna样本的检测序列组，所述检测序列组包括第一检测序列子组和/或第二检测序列子组，所述第一检测序列子组包含如seq id no.1至seq id no.10所示的任意一种核苷酸序列或至少两种核苷酸序列的组合，所述第二检测序列子组包含如seq id no.11至seq id no.20所示的任意一种核苷酸序列或至少两种核苷酸序列的组合；以及采用所述检测试剂与所述dna样本反应，并测定所述检测序列组中各个核苷酸序列的cpg甲基化水平。10.根据权利要求9所述的使用方法，其特征在于，所述使用方法还包括步骤：比较检测序列组中每一核苷酸序列的甲基化水平与对应的预设阈值的大小。11.根据权利要求9所述的使用方法，其特征在于，所述使用方法还包括步骤：比较所述第一检测序列子组的cpg甲基化水平的均值与第一参考值的大小，和/或比较所述第二检测序列子组的cpg甲基化水平的均值与第二参考值的大小；其中，若所述第一检测序列子组的cpg甲基化水平的均值大于或等于第一参考值，和/或所述第二检测序列子组的cpg甲基化水平的均值小于或等于第二参考值时，则判定所述受试样品为阳性；若所述第一检测序列子组的cpg甲基化水平的均值小于第一参考值，且所述第二检测序列子组的cpg甲基化水平的均值大于第二参考值时，则判定所述受试样品为阴性。12.根据权利要求11所述的使用方法，其特征在于，所述第一参考值为：正常个体集合的dna中所述第一检测序列子组的cpg甲基化水平的均值的特定倍数，所述特定倍数为4.1至6.2之间的任意一个数值，所述正常个体集合包括三个或三个以上正常个体；和/或，所述第二参考值为：正常个体集合的dna中所述第二检测序列子组的cpg甲基化水平的均值的特定百分比数，所述特定百分比数为12.5％至51％之间的任意一个数值，所述正常个体集合包括三个或三个以上正常个体。

技术总结
本申请公开了一种用于检测宫颈上皮内瘤样病变和宫颈鳞状细胞癌的核酸分子与试剂盒，所述核酸分子包括SEQ ID No.1至SEQ ID No.20所示核苷酸序列中的任意一种或几种，所述核酸分子可作为宫颈上皮内瘤样病变和宫颈鳞状细胞癌筛查、监测及诊断的分子标志物，所述试剂盒是通过检测DNA样本中检测序列组的CpG甲基化水平来筛查、监测及诊断宫颈上皮内瘤样病变和宫颈鳞状细胞癌，具有特异性强、准确率高、稳定性理想的优点，可以应用于临床实践以指导宫颈上皮内瘤样病变和宫颈鳞状细胞癌的治疗/预防方案。防方案。


技术研发人员：孙德强
受保护的技术使用者：浙江高美生物科技有限公司
技术研发日：2023.03.03
技术公布日：2023/7/12