一种鸭茅分蘖相关基因及其应用

1.本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及一种鸭茅分蘖相关基因及其应用。


背景技术：

2.为了实现国内牧草的自给自足，牧草学家一直致力于培育出高产优质的饲草以满足高产出的畜牧业需求，从而逐步走出国外饲草依赖的困局。禾本科牧草因其碳水化合物含量高，单株产量优于豆科，广泛用于鲜饲和混合青贮，在饲草中占有重要地位。尽管禾本科牧草单株产量优于豆科，但在土地紧缺的现状下，其单位面积产量仍难以满足畜牧业需求。目前牧草育种学家主要通过挖掘禾本科优质牧草的单产潜力来快速选育高产优质饲草新品种。而分蘖能力作为禾本科牧草产量的重要决定性因素之一，也是单产潜力的重要决定因素之一，一直受到科学家们的广泛关注。
3.鸭茅(dactylisglomerata l.)又名果园草(orchardgrass)，属禾本科(poaceae)早熟禾亚科(festucoideae)鸭茅属(dactylis)，是一种世界范围内广泛栽培的多年生冷季型丛生牧草。鸭茅具有生长速度快，生物产量高，糖分含量高，耐荫性强和适应范围广等特点。作为经济价值排名前四的多年生牧草，鸭茅对于世界温带地区草食动物肉类和乳制品生产有重要意义。除作为优良的牧草外，鸭茅也是我国林下草地和人工草地重要的优良混播禾草之一，主要适合于西部退耕还草和草场建设，对退耕还林还草和林-草复合建植等具有重要的积极意义。因此，通过改变鸭茅分蘖调控基因，提高鸭茅分蘖能力，培育高产优质品种，在有限的土地上收获更高产量，以解决国内土地紧缺和饲草缺口问题显得尤为紧要。
4.独角金内酯是一类新型植物激素，在抑制植物分蘖方面发挥了重要作用。而ccd7是独角金内酯合成中重要基因之一，目前为止，鸭茅中的dgccd7基因的研究还处于空白状态。因此验证鸭茅中dgccd7的功能，并据此改良鸭茅，对提高其分蘖能力和产量具有重要理论和应用价值。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种鸭茅分蘖相关基因及其应用，该基因为鸭茅dgccd7-1基因，研究发现，在拟南芥中过表达该基因，拟南芥的分蘖能力降低，提示该基因对分蘖具有调控作用，通过这种特性改良鸭茅，对提高其分蘖能力和产量具有重要理论和应用价值。
6.为了达到上述目的，本发明提供了一种鸭茅分蘖相关基因，该基因为dgccd7-1，该基因的核苷酸序列如seq id no.3如示，该基因对拟南芥的分蘖具有调控作用，该基因表达会降低拟南芥的分蘖能力；该基因编码的蛋白的氨基酸序列如seq id no.4如示。
7.本发明还提供了一种包含上述鸭茅分蘖相关基因为了达到上述目的，本发明提供了一种鸭茅分蘖相关基因，该基因为dgccd7-1的重组载体。
8.优选地，上述的重组载体采用pcambia1300-35s。
9.本发明还提供了一种包含上述重组载体的重组菌。
10.优选地，上述的重组菌采用根癌农杆菌gv3101。
11.本发明还提供了上述鸭茅分蘖相关基因dgccd7-1的应用，包含创制多分蘖的鸭茅株系或创制多分枝的拟南芥株系。
12.本发明提供的鸭茅分蘖相关基因dgccd7-1，首次公开了鸭茅中的分蘖调控基因，明确了该基因的功能，具有以下优点：
13.针对传统牧草改良技术见效慢、周期长的缺点，利用转基因技术将dgccd7-1在鸭茅中沉默或者敲除，可以针对性的提高鸭茅的分蘖能力和繁殖能力，缩短育种时间，提高育种效率，促进优质禾本科牧草鸭茅的开发与利用。
附图说明
14.图1为本发明中的dgccd7-1基因克隆电泳鉴定结果。
15.图2为本发明中的dgccd7-1基因在不同组织中的表达情况。
16.图3为本发明中的dgccd7-1基因过表达的重组质粒转化后的菌落pcr鉴定结果。
17.图4为本发明中的dgccd7-1基因过表达的拟南芥阳性植株pcr鉴定结果。
18.图5为本发明中的dgccd7-1基因过表达的拟南芥与野生型拟南芥幼苗期表型对比结果。
19.图6为本发明中的dgccd7-1基因过表达的拟南芥与野生型拟南芥抽薹期表型对比结果。
具体实施方式
20.下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
21.说明：本实验例中用到的试剂如未见说明，则均为本领域常规试剂；所用到的技术和方法未见具体说明的，均为本领域常规技术和操作方法。
22.实验例1dgccd7-1基因的获取
23.1.实验材料准备
24.本实验选择的材料为鸭茅品种
‘
d20170203’，种植于四川农业大学温江校区。取其幼嫩茎基为材料提取总rna。选用天根(北京)生化科技有限公司的植物总rna提取试剂盒进行rna提取，操作参考内附说明书进行。
25.rna提取后利用1％琼脂糖凝胶电泳进行完整性检测，使用超微量分光光度计测定rna浓度和纯度，再采用primescript ii 1st strand cdna synthesis kit(takara)对提取的rna进行反转录，操作流程参考内附说明书，得实验材料的全基因组cdna。
26.2.目的基因的扩增
27.以v1.1版本的鸭茅参考基因组为模板，通过对鸭茅中ccd7基因与水稻和其他物种blast获取其在基因组中位置，从而提取鸭茅中该基因的序列，通过序列全长设计扩增引物，包括上游引物f和下游引物r，其核苷酸序列分别如下所示，以设计的该引物对上述提取的cdna进行pcr扩增，扩增试剂盒为primestar max dnapolymerase(takara)试剂盒，具体操作参考内附说明书进行。
28.设计的引物如下所示(5
’→3’
)：
29.f(seq id no.1)：atggcgatatgcgcgatc；
30.r(seq id no.2)：tcattcatcagcccagaagcc。
31.pcr扩增的体系如下表1所示，扩增的反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s，60℃退火15s，72℃延伸2min，35个循环；72℃运行10min。对扩增所得的pcr产物通过0.8％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，其电泳检测结果如图1所示，其中，m为dna ladder，泳道1和2为扩增产物的两次重复样。
32.表1pcr扩增体系
[0033][0034]
3.ta克隆
[0035]
将上述凝胶电泳的胶块置于紫外灯下，对扩增的条带进行切胶，用minibestagarose gel dna extraction kit(takara)回收纯化目的片段，具体操作参考内附说明书。取上述回收的dna溶液4μl，加入1μl的pmd19-t载体和5μl的solution(含连接酶)混匀，在16℃反应30min。反应完成后将上述反应产物加入100μl的dh5α感受态细胞中，冰浴30分钟后，于42℃加热45s，再在冰上放置2min。在转化好的感受态细胞中加入800μl的lb培养基，37℃培养60分钟，涂于含有氨苄(amp)的lb培养基平板上倒置37℃培养。挑选培养后平板上的单菌落进行培养，并对培养的菌液送公司测序，测序引物为pmd19-t载体的通用测序引物m13，以验证是否克隆成功。
[0036]
经测序鉴定，该基因成功扩增，且通过测序可知，该基因的核苷酸序列如下所示，将该基因命名为dgccd7-1。
[0037]
dgccd7-1基因的核苷酸序列(seq id no.3)如下(5
’→3’
)：
[0038]
atggcgatatgcgcgatcgcaacaacgcacgccgccgtgcaccaccgtcaccatcctctcctccccgtcccaccgccagcaccgcgccaccgcgtccgcatcgtcgtccgcgggacggccggcaccaccgccgcggcggtgacgtccgagccggacacgatgtccaatgccttttgggactacaacctcctcttccggtcgcagcgcgccgagacgtcagaccccgtgcagctccgcgtcgtcgagggcgcgatgccggcggacttcccggcgggcacctactacctcgccgggcccggcatgttttccgacgaccacggctccatcgtccaccccctcgacggccacggctacctccgctccttccggttccaccccaaccacggcgtccactactccgcacggtacgtggagacggcggcgaagagcgaggagaaaggggacggggcgtcgtggaggttcacgcaccgtggccccttctcggtgctgcagggcgggcacagggtgggcaacgtgaaggtgatgaagaacgtggccaacacgagcgtgctctggtggggcggccggctgctctgcctctgggagggcggcatgccgtacgagctcgaccccaacacgctggacaccatcggccccttcgacctgctcgggttcgccgacgaggctgcagcggcagcacatggtcgggtggctgcacggcggtggcagcggcggccgtggccggtggaggccgcgctcgacgtggccacccgcctgctgcgcccagttctcagtggcgtgttcagcatgccgcccaagcggctcctggcgcactacaaggtcgacccgaagcggaaccggctgctcatggtggcctgcaacgccgaggacatgctcctcccgcgagccaacttcactttctacg
agttcgacgccggcttcgggctggtgcagaagcgggagttcgtgctgccggcgcacctcatgatccacgactgggcgttcaccgactcccactacgtcgtcctcggcaacaggatcaagctcgacatccccgggtcgatgatggcgatgacgggcacctacccgatgataggggcgctgcagctggacccgagcaaggagacgacgccggtctacctgctgccgcgctccacggaggccgtggcgagcggccgcgactggaccatgcccgtggaggcgccggcgcagatgtggtcgatgcacgtgggcaacgccttcgaggaggacctcggccgcggtggcacggacatacggctgcacatgtcgggctgctcttacgactggttccacttccacagaatgtttggttacaattggaagaacaagaagctggacccttcgttcatgaacgcggccaaggggaaggaactgctgcctcgcctcgtgcaggtggcaattgagcttgacaagagaggagcatgccgaagatgctctgtgaagagaatgtcccatcagtggaacaaacctgcagacttcccagcgataaacccaacctttgccaacaagaggagcaggttcatctatgcaggcgggtcatccggttcgcgcaaattccttccgtattttccatttgacagcatcgtgaaggtcgacgtctccgatgggacagcgaggcggtggtcttgtgaggggcgcaagttcgtcggggagccggtcttcatcccgaccggtggtggggaggatcatggctatgttattcttgtagagtatgcagtatctgaagacaggtgcaacctggtggtgttggatgcaagaaaaataggcaaaagaagtgcacttgtggcaaaacttgcggttccaaagaacctcacattcccaatgggattccatggcttctgggctgatgaatga。
[0039]
dgccd7-1基因表达的蛋白，其氨基酸序列(seq id no.4)如下所示：
[0040]
maicaiatthaavhhrhhpllpvpppaprhrvrivvrgtagttaaavtsepdtmsnafwdynllfrsqraetsdpvqlrvvegampadfpagtyylagpgmfsddhgsivhpldghgylrsfrfhpnhgvhysaryvetaakseekgdgaswrfthrgpfsvlqgghrvgnvkvmknvantsvlwwggrllclweggmpyeldpntldtigpfdllgfadeaaaaahgrvaarrwqrrpwpveaaldvatrllrpvlsgvfsmppkrllahykvdpkrnrllmvacnaedmllpranftfyefdagfglvqkrefvlpahlmihdwaftdshyvvlgnrikldipgsmmamtgtypmigalqldpskettpvyllprsteavasgrdwtmpveapaqmwsmhvgnafeedlgrggtdirlhmsgcsydwfhfhrmfgynwknkkldpsfmnaakgkellprlvqvaieldkrgacrrcsvkrmshqwnkpadfpainptfankrsrfiyaggssgsrkflpyfpfdsivkvdvsdgtarrwscegrkfvgepvfiptgggedhgyvilveyavsedrcnlvvldarkigkrsalvaklavpknltfpmgfhgfwade。
[0041]
实验例2dgccd7-1基因功能分析
[0042]
一、该基因在鸭茅不同组织表达量
[0043]
将45个大小、形态相似的单分蘖鸭茅植株
‘
d20170203’种植在石英砂中，随机分为三组，每组共15个重复，每天对其施加定量霍格兰营养液以保证营养供应充足。所有植株都放在生长室中进行培养，设置生长条件为光照14小时22℃、黑暗10小时15℃以及相对湿度为70％。当新生分蘖芽长到0.5cm时，同时收集每组内的芽(b)、茎基(s)、根(r)和叶(l)四种组织，同组内每种组织的混合样品作为1个生物学重复，3组材料共收集3个重复。收集好的组织样品立即液氮冷冻，再转入-80℃冰箱保存备用。通过qrt-pcr检测dgccd7-1基因的表达情况。其中，dgccd7-1基因在不同组织中的表达情况如图2所示，可知，dgccd7-1在鸭茅茎基中表达量最高。
[0044]
二、过表达重组载体的构建
[0045]
先对实验例1中的目的基因dgccd7-1进行扩增，根据载体pcambia1300-35s的图谱，以ecori、bamhi为插入位点设计扩增引物并合成引物，以实验例1中测序验证正确的单菌落为模板进行pcr，其中合成的扩增引物核苷酸序列如下所示(5
’→3’
)；
[0046]
上游引物p71-f(seq id no.5)：
[0047]
cggggatcctctagagtcgacatggcgatatgcgcgatc；
[0048]
下游引物p1254-r(seq id no.6)：
[0049]
aatgtttgaacgatcctgcagtcattcatcagcccagaagcc。
[0050]
其中，pcr扩增使用高保真酶，其扩增反应的体系如下表2所示：
[0051]
表2pcr扩增体系
[0052][0053]
pcr反应程序为95℃预变性3min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸5min。将pcr产物在1.8％琼脂糖凝胶中进行电泳，电压150v，电泳15min，照相记录电泳结果，在紫外灯下观察，迅速切下目的条带。用胶回收试剂盒(omega)回收目的片段，具体方法按试剂盒说明书进行，得到含ecori、bamhi酶切位点的目的基因序列，与用ecori、bamhi双酶切后的载体pcambia1300-35s进行体外连接，构建包含dgccd7-1基因的重组载体，连接体系见表下3：
[0054]
表3重组质粒的连接体系
[0055][0056][0057]
1.连接产物的转化，具体步骤如下：
[0058]
a.超净工作台灭菌30min，从-70℃超低温冰箱中取出100μl的感受态细胞，放于冰上，预冷10min。
[0059]
b.取出一个ep管，标上记号，置于冰上，加入80μl的dh5α感受态细胞(冰上操作)。
[0060]
c.加入10μl上述的连接产物，用移液枪吸打混匀后冰浴30min；
[0061]
d.冰浴结束后，放在42℃的恒温水浴锅中热激90s，然后迅速放入冰块中，冰浴
2min；
[0062]
e.吸500μl不含kan
+
的lb液体培养液到ep管中，混匀，置于摇床中160rpm/min、37℃摇1h；
[0063]
f.取出摇床结束的ep管，2000～3000rpm/min离心5min，弃上清300μl，剩余的菌液轻柔吸打混匀后加在含kan
+
的lb固体培养皿中，用玻璃涂棒涂匀，涂干；37℃恒温培养箱中培养16～20h。
[0064]
对培养皿中的克隆随机挑选10个单克隆进行菌落pcr鉴定，所用引物(d-f和d-r)的核苷酸序列如下所示，菌落pcr鉴定结果如图3所示，其中，m为dnaladder，泳道1～10分别为10个单克隆的菌液pcr结果，可知，挑取的单菌落均为阳性菌落，选取其中任意一个进行培养，提取质粒后于-80℃保存。
[0065]
其中，菌落鉴定的引物如下所示(5
’→3’
)；
[0066]
d-f(seq id no.7):atggcgatatgcgcgatcgc；
[0067]
d-r(seq id no.8):agcacgctcgtgttggccac。
[0068]
菌落鉴定的pcr扩增体系如下表4所示，pcr反应程序为：98℃预变性5min；循环为98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸5min。
[0069]
表4扩增反应体系
[0070][0071][0072]
2.拟南芥转化
[0073]
(1)农杆菌转化：-80℃冰箱取出农杆菌gv3101感受态，冰上解冻2min加入3-5μl上述鉴定成功的菌落所提取的重组质粒，冰上放置5min。将ep管置于液氮中速冻1min，37℃水浴5min，冰浴2min，加入800μl无抗液体lb培养基，28℃摇床150rpm/min培养3h。8000rpm/min离心1min，弃上清600μl后，悬浮后涂于固体lb培养基上(含50μg/ml的kan
+
和50μg/ml的利福平)，28℃培养箱倒置培养48h。挑取单克隆。
[0074]
(2)拟南芥种植：选择吸水性好，土质松软的蛭石配合基质(2:1)作为拟南芥种植土壤。选择直径9cm的花盆，每盆播种50-100颗。播种以后浇水并覆膜，给植株的生长提供一个湿润的环境。拟南芥室生长条件为光照强度为2000-3000lx，光照时间14h/day，湿度40-60％。
[0075]
(3)移栽：播种10-15天，待拟南芥幼苗长至四叶时期开始移栽，每盆4-5棵。
[0076]
(4)去顶：移栽后每3天浇一次水，每两周添加一次营养液，约25-30天后，在拟南芥初次开花时将花蕾剪掉，可以促进侧枝更多的花枝的增生。适合转化植株的花卉并没有成
熟，也没有产生已受精的角果。
[0077]
(5)配制浸染液：在5％的蔗糖溶液中重悬农杆菌使od＝0.8，蔗糖溶液现配现用，无需灭菌。100-200ml浸染2-3个小盆植株，400-500ml浸染2-3个花盆(9cm)植株。在浸染之前加入表面活性剂silwet-77至浓度0.05％(500μl/l)。
[0078]
(6)浸染：将盛花期拟南芥的花表面部分浸泡在农杆菌悬浮液中20-30s，同时轻轻旋转。
[0079]
(7)暗培养：将浸染后植株套袋保持高度的湿润状态暗室培养24h。
[0080]
(8)浸染后培养：隔天浇水，保证水分充足即可。
[0081]
(9)种子收集：种子成熟，角果自然开裂后可以收种子。
[0082]
(10)转基因种子筛选：在含有潮霉素抗生素的平板上培养浸染后所得种子。40mg的种子大约200颗于含潮霉素10-50μg/ml的0.5
×
ms培养基上春化2天，之后在持续光照条件下培养7-10天。根据生长状况判断是否为转基因种子。成功转入重组质粒的种子能够在抗性培养及上正常生长出4片以上真叶。非转基因种子不能正常生长，仅能长出2片子叶，根的生长也受到严重抑制，一般萌发10天以后死亡。
[0083]
(11)转基因植株转土栽培：转基因种子在ms
+
潮霉素平板上萌发2周以后，将阳性植株转入土壤继续培养。具体方法如下：取阳性植株叶片进行基因组dna的提取并使用上述的扩增引物(seq id no.7和seq id no.8)进行pcr验证。对上述获得的阳性植株，随机选择5个进行pcr鉴定，鉴定结果如图4所示，其中，泳道oc-1、oc-2、oc-3、oc-4、oc-5分别为5个阳性植株；质粒为上述构建的过表达阳性质粒；空白为空质粒；野生型为未转化过表达质粒的野生型植株，可知，构建的阳性植株是可靠的。
[0084]
将上述鉴定成功的阳性植株连续种植3代收种获得t3种子，待t3代转基因植物生长至抽薹时期，分别对拟南芥转基因植株和未转基因野生型拟南芥植株进行分蘖计数，其幼苗期表型对比结果如图5所示，其中，图中第一列的
‘
wt-max3’为野生型拟南芥的三个重复植株，第二列为过表达了
‘
dgccd7-1’的三个重复植株。结果表明，与野生型拟南芥对照相比，本研究所获得的转dgccd7-1基因的拟南芥株系分蘖能力明显低于野生型拟南芥对照。dgccd7-1基因过表达的拟南芥和野生型拟南芥在抽薹期表型对比结果如图6所示，表明鸭茅dgccd7-1基因的表达可以抑制植物尤其是拟南芥的分蘖能力，可以预测得出，沉默或敲除该基因可创制多分支的拟南芥植株。
[0085]
综上可知，基因dgccd7-1对分蘖具有调控作用，基于这种特性，利用转基因技术将dgccd7-1在鸭茅中沉默或者敲除，可以针对性的提高鸭茅的分蘖能力和繁殖能力，可用于创制多分蘖的鸭茅株系，缩短育种时间，提高育种效率，促进优质禾本科牧草鸭茅的开发与利用。
[0086]
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

技术特征：
1.一种鸭茅分蘖相关基因，其特征在于，该基因为dgccd7-1，该基因的核苷酸序列如seq id no.3如示，该基因对拟南芥的分蘖具有调控作用，该基因的表达会降低拟南芥的分蘖能力。2.一种如权利要求1所述鸭茅分蘖相关基因编码的蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如seq id no.4如示。3.包含如权利要求1所述鸭茅分蘖相关基因的重组载体。4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体采用pcambia1300-35s。5.包含如权利要求3所述重组载体的重组菌。6.根据权利要求5所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌采用农杆菌gv3101。7.如权利要求1所述的鸭茅分蘖相关基因的应用，其特征在于，该应用包含在创制多分蘖的鸭茅株系或创制多分枝的拟南芥株系中的应用。

技术总结
本发明公开了一种鸭茅分蘖相关基因及其应用，涉及植物基因工程领域。本发明提供的基因为DgCCD7-1，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3如示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。通过将该基因的过表达载体转入拟南芥后发现，该基因的过表达会降低拟南芥的分蘖能力，提示该基因对分蘖具有调控作用，基于这种特性，利用转基因技术将DgCCD7-1在鸭茅中沉默或者敲除，可以针对性的提高鸭茅的分蘖能力和繁殖能力，缩短育种时间，提高育种效率，促进优质禾本科牧草鸭茅的开发与利用。促进优质禾本科牧草鸭茅的开发与利用。促进优质禾本科牧草鸭茅的开发与利用。


技术研发人员：张新全 许肖恒 冯光燕 王成 焦永娟 杨忠富 李丹丹
受保护的技术使用者：四川农业大学
技术研发日：2023.01.10
技术公布日：2023/7/12