一种表面展示脂肪酶的肉葡萄球菌及构建方法和应用

1.本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种表面展示脂肪酶的肉葡萄球菌及构建方法和应用。


背景技术：

2.肉葡萄球菌(staphylococcus carnosus)属于葡萄球菌属，无鞭毛和无芽孢，它不产生毒素、溶血素、凝固酶和聚集因子，是一种公认的安全性食品级革兰氏阳性菌。其对发酵肉制品的风味和颜色的形成发挥着重要的作用，是重要的肉制品发酵剂且应用年限已超60年。肉葡萄球菌胞外蛋白酶水解活性极低，故可以用作良好的基因工程宿主菌。它作为选择性克隆宿主菌，不仅可以在分子遗传学方面来研究肉葡萄球菌相关代谢途径，而且还用于异源蛋白的表达和分泌。
3.细菌表面展示技术是指利用基因工程手段将目的蛋白或短肽与细菌外膜蛋白以融合蛋白的形式呈现在细胞表面的技术。细菌的表面展示系统主要是由三个部分组成，包括：目的蛋白或短肽、载体蛋白和目的细菌。细菌表面展示技术是继噬菌体表面展示技术之后又一重要的微生物表面展示系统，能够很好的克服展示的目的蛋白的偏性问题。噬菌体表面展示系统虽发现较早，发展较成熟，但是其在展示一些目的蛋白尤其是来源于真核生物的蛋白时存在缺陷，如目的蛋白存在不可预测的偏性等，而细菌表面展示系统则能够很好的克服展示的目的蛋白的偏性问题。细菌表面展示技术发展前期，研究者们主要利用的是革兰氏阴性菌，其具有分泌内毒素、致病性等缺点，所以越来越多的应用于食品工业中的革兰氏阳性菌被挖掘，同时开发革兰氏阳性菌作为表面展示系统越来越受到学者们的关注。革兰氏阳性菌细胞壁含有大量磷酸壁，它带有大量负电荷，是表面抗原的主要成分。因此，革兰氏阳性菌细胞壁有很强的抗原性，葡萄球菌a蛋白和链球菌表面蛋白m6是革兰氏阳性菌表面展示系统中常用的载体蛋白。
4.细胞固定化技术是将微生物细胞或具有生理功能的动植物细胞通过特定方法(吸附、共价键合、交联等)固定在特定的载体上，以整个细胞为生物催化剂加以利用的一项技术。与酶固定化技术相比，细胞固定化技术具有以下优点：
①
不需对酶进行分离纯化，减少酶活损失，降低成本；
②
多酶反应无需辅因子，固定化后，细胞可作为单一酶发挥作用，细菌复杂酶系统也能完成一系列反应。而且辅因子易再生；
③
对活细胞而言，维持酶原状态有更高的稳定性和更强的抗污染能力；
④
细胞生长停滞时间短，细胞数量多，反应快；
⑤
操作方便，重复使用率高，抗毒能力强，可连续运行。正是固定化细胞的以上优势，其虽比固定化酶出现的晚，但比固定化酶的应用范围更广。细胞固定化技术中常用的方法有包埋法、吸附法、共价结合法、交联法以及多种固定化方法的组合。
5.生物柴油通常从动植物油中提炼获得，是指油料作物、水生植物油、等为原料制成的用于代替石油柴油的可再生柴油燃料。环境友好型的生物柴油则是能够代替石化柴油的可再生性的“绿色资源”。与石化柴油相比，生物柴油的生产以弃油脂中的脂肪酸甘油三酯为原料，制备所得的生物柴油中几乎不含有硫元素，尾气当中颗粒的含量少，一氧化碳的排
放量少，具有良好的生物降解性能，不仅对环境无污染亦对人体健康无伤害；生物柴油中的氧含量较高，十六烷值的含量也高，具有优良的燃烧性能，能够燃烧的更加彻底；另外，生物柴油具有更高的闪点，使生物柴油更易于运输和储存。因此，生物柴油作为一种环保、可再生的“绿色燃料”，具有广阔的应用前景，是优质石化柴油的替代品。目前，生物柴油的制备方法主要有化学法、生物酶法和超临界法，其中，最成熟的方法是利用酯交换法制备生物柴油，因为与化学法相比较，生物酶法制备生物柴油有反应条件温和、醇用量少、产品易分离、无环境污染等优点，受到了国内外很多国家的关注。目前，已有研究者利用脂肪酶催化大豆油来生产合成生物柴油，但存在脂肪酶使用量高、酶的无法重复利用及反应周期长等问题。


技术实现要素：

6.本发明为了解决上述技术问题，提供一种表面展示脂肪酶的肉葡萄球菌及构建方法和应用。
7.第一方面，本发明提供一种表面展示脂肪酶的重组质粒，是采用以下技术方案得以实现的。
8.一种表面展示脂肪酶的重组质粒：所述重组质粒为质粒pbt2-spp-lip-cbd-xm，包括脂肪酶基因和纤维素结合结构域基因。
9.进一步的，所述脂肪酶基因如seq id no.1所示；纤维素结合结构域基因如seq id no.2所示。
10.更进一步的，所述脂肪酶基因的上下游扩增引物如seq id no.3、seq id no.4所示；纤维素结合结构域基因的上下游扩增引物如seq id no.5、seq id no.6所示。
11.第二方面，本发明提供一种表面展示脂肪酶的重组质粒的构建方法，是采用以下技术方案得以实现的。
12.一种上述表面展示脂肪酶的重组质粒的构建方法：包括以下步骤：
13.s1.以脂肪酶基因为模板，使用脂肪酶基因上下游引物扩增得到lip基因；以纤维素结合结构域基因为模板，使用纤维素结合结构域基因上下游引物扩增得到cbd基因；
14.s2.以纯化后的lip基因和cbd基因为模板，使用脂肪酶基因上游引物和纤维素结合结构域基因下游引物扩增融合片段lip-cbd基因；
15.s3.利用限制性内切酶分别对质粒pbt2-spp-xm和融合片段lip-cbd基因进行双酶切，并通过连接酶构建得到重组质粒pbt2-spp-lip-cbd-xm。
16.第三方面，本发明提供了一种表面展示脂肪酶的肉葡萄球菌，是采用以下技术方案得以实现的。
17.一种表面展示脂肪酶的肉葡萄球菌，包括上述表面展示脂肪酶的重组质粒。
18.第四方面，本发明提供了一种表面展示脂肪酶的肉葡萄球菌的构建方法，是采用以下技术方案得以实现的。
19.一种上述表面展示脂肪酶的肉葡萄球菌的构建方法，包括以下步骤：
20.将重组质粒pbt2-spp-lip-cbd-xm电转至肉葡萄球菌s.carnosus tm300感受态，于抗生素抗性tsb平板上进行培养，验证后得到s.carnosus tm300/p-spp-lip-cbd-xm重组菌株。
21.第五方面，本发明提供了一种表面展示脂肪酶的肉葡萄球菌的用途，是采用以下
技术方案得以实现的。
22.一种上述表面展示脂肪酶的肉葡萄球菌在制备生物柴油中的应用。
23.进一步的，所述制备生物柴油的方法如下：
24.s1.菌种活化及菌体培养：将s.carnosus tm300/p-spp-lip-cbd-xm进行菌种活化，并将活化后的菌种进行扩大培养；
25.s2.固定化细胞的制备：对培养液进行离心，收集菌体并洗涤，取适量菌体重悬于pbs缓冲液中至od600＝1.0；在培养皿中加入上述菌悬液，再加入一张纤维素滤纸振荡孵育；
26.s3.将大豆油、甲醇和磷酸盐缓冲液混合，向所得混合物中加入步骤s2制备得到的固定化细胞，震荡反应一段时间得到生物采油。
27.更进一步的，步骤s3中，甲醇和大豆油的质量比为(3-6):1；固定化细胞和大豆油的质量比为(0.8-1.2):4.585；反应时间为3-8h，反应温度为37-55℃。
28.优选的，甲醇和大豆油的质量比为3:1；固定化细胞和大豆油的质量比为0.8:4.585；反应时间为5h，反应温度为50℃。
29.本技术具有以下有益效果。
30.本技术将脂肪酶基因和纤维素结合域的基因融合表达展示在肉葡萄球菌的表面，根据肉葡萄球菌蛋白表面展示原理，将表面展示蛋白锚定在细胞壁肽聚糖结构上。利用纤维素进行细胞固定化后，细胞表面展示的脂肪酶最适温度可达到45℃，比游离细胞的脂肪酶更能够耐受高温，并且在40℃保温3h后仍能保留80％左右的酶活，温度稳定性较好；也更能够耐受甲醇的毒害作用。另外，利用固定化后的全细胞酶制备生物柴油，其在连续使用了10次之后全细胞酶酶活仍能剩余65％；且生物柴油转化率能够达到77％。
附图说明
31.图1为本发明lip-cbd基因的验证结果图(其中，m：dl5000bp dna marker；1、2、3：随机挑选的转化子)；
32.图2是本发明构建得到的pbt2-spp-lip-cbd-xm的质粒图谱；
33.图3是本发明s.carnosus tm300/p-spp-lip-cbd-xm菌株的分子水平验证，m：蛋白marker；1：s.carnosus tm300；2-6：随机挑选的s.carnosus tm300/p-spp-lip-cbd-xm的转化子；
34.图4是本发明固定化全细胞酶最适反应ph(a)及其稳定性(b)结果图；
35.图5是本发明固定化全细胞酶最适反应温度(a)及其稳定性(b)结果图。
36.图6是本发明固定化全细胞酶的半衰期分析结果图；
37.图7是本发明时间(a)、醇油比(b)、固定化细胞用量(c)及温度(d)对甘油得率的影响结果图。
具体实施方式
38.以下结合实施例对本专利申请进行进一步的说明。
39.以下制备例和实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；以下制备例和实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
40.实施例1
41.重组质粒pbt2-spp-lip-cbd-xm以及s.carnosus tm300/p-spp-lip-cbd-xm的构建：
42.(1)以s.carnosus tm300基因组为模板，使用引物s-l/s-r和x-l/x-r分别扩增spp(序列参见seq id no.1)和xm(序列参见seq id no.2)序列，以合成的lip基因(序列参见seq id no.3)为模板，使用引物l-f和l-r扩增大小为864bp的lip基因；使用引物c-f和c-r扩增由苏州金唯智生物技术有限公司进行全基因合成的全长为573bp的cbd基因(序列参见seq id no.4)；以胶回收纯化后的lip和cbd片段为模板，使用引物l-f和c-r扩增融合片段lip-cbd基因(pcr结果验证见图1)，使用s-l和x-r扩增融合片段spp-lip-cbd-xm，用限制性内切酶bamhi和xbai分别对质粒pbt2和融合片段spp-lip-cbd-xm进行双酶切连接构建得到质粒pbt2-spp-lip-cbd-xm(质粒图谱见图2)。pcr反应体系见表1，pcr反应条件见表2，双酶切体系见表3。
43.引物和序列信息如下：
44.spp基因(seq id no.1)：
45.atgaaagaaacaaaacatcaacacacattttctatccgtaagtcggcttatggtgccgcgtcggttatggtcgcatcatgtatatttgtcatcggtgggggcgtggcagaggcaaatgattcgacaacacaaacaacgacaccactagaagtcgctcaaacgtcgcagcaagaaacacatacacatcaaacacctgttacatcattacatactgcaacacctgaacatgttgatgactctaaagaagcaacacctttacctgaaaaagcagagtcaccaaaaaccgaagtgacagttcaaccttcatcgcatacacaggaagtacctgcgttacataaaaaaacacagcaacaaccggcgtataaggataaaacggtaccagagtcaacgatagcatcaaagtcggttgaatcaaataaagcaacagaaaatgagatgtcacctgttgaacatcatgcttcaaatgtggaaaaacgtgaagatagattggagactaatgagacaacaccgccatcagtggaccgtgaatttagccataaaatcatcaataatgcgcacgtaaatccaaaaacggatggacaaacaaacgttaatgttgatacgaaaacgatagacaccgtttcaccgaaagatgacagaatagatacggcgcaaccgaaacaagtcgacgctcctaaagaaaatacaacggcacaaaataaatttacatcacaagcgagcgacaaaaaaccaaca
46.xm基因(seq id no.2)：
47.agcttcgctcaagcaccaaaagaggaagacaataacaagcctggcaaagaagacaataacaagcctggcaaagaagacaataacaagcctggcaaagaagacaacaacaagcctggcaaagaagacaacaacaagcctggtaaagaagacaacaacaagcctggcaaagaagacggcaacaagcctggtaaagaagacaacaaaaaacctggtaaagaagatggcaacaagcctggtaaagaagacaacaaaaaacctggtaaagaagacggcaacaagcctggcaaagaagatggcaacaaacctggtaaagaagatggtaacggagtacatgtcgttaaacctggtgatacagtaaatgacattgcaaaagcaaacggcactactgctgacaaaattgctgcagataacaaattagctgataaaaacatgatcaaacctggtcaagaacttgttgttgataagaagcaaccagcaaaccatgcagatgctaacaaagctcaagcattaccagaaactggcgaagaaaatccattcatcggtacaactgtatttggtggattatcattagccttaggtgcagcgttattagctggacgtcgtcgcgaacta
48.lip基因(seq id no.3)：
49.atgagcacgaaatacccgattgttcttgtccacggacttgccggattcaacgagatcgtcggcttcccgtatttctatggcatcgctgacgcccttcgccaagatggccatcaagttttcacagcctctctttccgccttcaattccaacgaggtccgcggcaaacaactttggcagttcgtccagacgctgctgcaagaaacgcaagccaagaaggtcaacttcattggccactcccaaggcccactggcttgtcgctatgtcgctgccaattatccggactccgttgcctccgtcacg
agcatcaatggcgtcaatcacggcagcgagatcgccgatctttaccgccgcattatgcgcaaggactccattccggagtacatcgtcgaaaaggttcttaacgccttcggcacgatcatcagcacattttccggccacagaggcgatccgcaagatgctatcgccgctctggaatcccttacgacggagcaagttacggagttcaacaacaagtacccgcaagcccttccaaaaacaccgggaggcgaaggagacgagatcgtcaatggcgtccactactactgcttcggcagctacatccaaggccttatcgctggcgagaagggcaatcttcttgatccgacacacgctgccatgcgcgttcttaacacgttcttcacggagaagcagaacgatggccttgttggccgcagcagcatgcgccttggcaagctgattaaggatgactacgcccaagatcacatcgatatggtcaatcaagttgccggacttgttggctacaacgaggacatcgtcgccatctatacacagcacgccaagtatcttgcctccaaacagctttag
50.cbd基因(seq id no.4)：
51.atgtccacccgcagaaccgccgcagcgctgctggcggccgcggccgtcgccgtcggcggtctgaccgccctcaccaccaccgccgcgcaggcggctcccggctgccgcgtcgactacgccgtcaccaaccagtggcccggcggcttcggcgccaacgtcacgatcaccaacctcggcgaccccgtctcgtcgtggaagctcgactggacctacaccgcaggccagcggatccagcagctgtggaacggcaccgcgtcgaccaacggcggccaggtctccgtcaccagcctgccctggaacggcagcatcccgaccggcggcacggcgtcgttcgggttcaacggctcgtgggccgggtccaacccgacgccggcgtcgttctcgctcaacggcaccacctgcacgggcaccgtgccgacgaccagccccacgccgaccccgacgccgacgacccccacgccgacgccgaccccgacccccacccccacgccgacggtcacgccgcagccgaccagcggcttctacgtcgacccgacgacgcagggctaccgc
52.s-l：atgaaagaaacaaaacatcaa(seq id no.5)
53.s-r：tgttggttttttgtcgtcg(seq id no.6)
54.x-l：agcttcgctcaagcaccaaaag(seq id no.7)
55.x-r：tagttcgcgacgacgtccag(seq id no.8)
56.l-f:ccaagcttatgagcacgaaatacccgatt(seq id no.9)
57.l-r:tgcggcctaatggtgatggtgatgatgaagctgtttggaggcaagat act(seq id no.10)
58.c-f:atgtccacccgcagaaccgccgca(seq id no.11)
59.c-r:cagatctgcttatcgtcg tcatccttgt aatcg(seq id no.12)
60.表1pcr扩增体系
[0061][0062][0063]
表2pcr扩增程序
[0064][0065]
表3双酶切体系
[0066][0067]
(2)质粒的转化与鉴定
[0068]
将连接产物热激转化至e.coli dh5α感受态细胞，于氨苄青霉素抗性lb平板上培养12h。之后进行菌落pcr及其产物测序，得到e.coli dh5α/p-spp-lip-cbd-xm，使用质粒提取试剂盒得到稳定的质粒。
[0069]
(3)质粒电转至肉葡萄球菌
[0070]
将测序正确的质粒pbt2-spp-lip-cbd-xm电转至肉葡萄球菌s.carnosus tm300感受态，于氯霉素抗性tsb平板(酪蛋白胨17g/l，大豆蛋白胨3g/l，葡萄糖2.5g/l，氯化钠5g/l，磷酸二氢钾2.5g/l，琼脂20g/l)上培养16h，之后进行pcr及其产物测序验证，得到s.carnosus tm300/p-spp-lip-cbd-xm重组菌株。
[0071]
(4)脂肪酶成功展示在细胞表面的验证
[0072]
提取目的蛋白：挑取单菌落s.carnosus tm300/p-spp-lip-cbd-xm接种到5ml含有氯霉素的lb试管中过夜培养，按1％(v/v)的接种量将培养液转接至含有相同抗性的50ml的lb液体培养基中，37℃、180r/min培养18-24h。收集发酵后的菌体，用液氮将菌体研磨至粉末，用pbs缓冲液溶解粉末，离心后收集上清，向所得上清液中加tca溶液，过夜后离心，向沉淀中加入pbs缓冲液和sds-page专用loading buffer，样品进行沸水浴，得到总蛋白样品。
[0073]
镍柱纯化目的蛋白：将镍柱中20％乙醇放出至上膜，当乙醇快流完时，用0.45μm的膜加入超纯水3-5个柱体积，当超纯水快流完时，用0.45μm的膜加入pbs 3-5个柱体积，当pbs快流完时，用0.45μm的膜加入蛋白样品，收集流出液，当样品快流完时，用0.45μm的膜加入80mmol/l的咪唑洗脱杂蛋白，当80mmol/l的咪唑快流完时，用0.45μm的膜加入300mmol/l的咪唑，收集目的蛋白。
[0074]
目的蛋白sds-page电泳检测：向胶孔中加入蛋白样品20-40μl，进行电泳。电泳结束后进行染色和脱色，在全自动凝胶成像仪中拍照存档分析。
[0075]
结果如图3所示，实验组(2-6泳道)均只在50kda左右出现单一条带，而对照组(1泳道)则未出现任何条带，实验结果表明，本技术成功将脂肪酶展示在细胞表面。
[0076]
实施例2
[0077]
固定化细胞的制备
[0078]
挑取单菌落s.carnosus tm300/p-spp-lip-cbd-xm接种到5ml含有氯霉素的lb试管中过夜培养。将上述培养液按1％(v/v)的接种量转接至含有相同抗性的50ml的lb液体培养基中，37℃、180r/min培养18-24h。对培养液进行离心收集菌体，用pbs洗涤2次，取适量菌体重悬于缓冲液中至od600＝1.0。在一次性培养皿中加入10ml上述菌悬液，再加入一张纤维素滤纸振荡孵育，得到固定化细胞。
[0079]
(1)固定化细胞最适反应ph及其稳定性
[0080]
将获得的固定化细胞使用不同ph的缓冲液洗涤三次后，40℃下选取ph6.0-11.0缓冲液中反应10min测定酶活，确定细胞固定化后酶活的最适ph，与游离细胞进行比对。在不同的ph下反应3h，每隔30min取样测定酶活，确定细胞固定化后的ph稳定性，每个样品做三组平行。
[0081]
实验结果如图4所示，与游离的菌相比，全细胞酶固定化后最适ph则由10.0变为9.0，因为在ph》9.0的缓冲液里，部分纤维素结合域被碱性环境破坏，因此ph》9.0的酶活力显著下降，但其在ph 8.0-9.0之间稳定性较好，处理3h后仍能保留70％左右的酶活。
[0082]
(2)固定化细胞最适反应温度及其稳定性
[0083]
将获得的固定化细胞在最适ph9.0下，于30-55℃反应10min测定酶活，确定细胞固定后的最适温度，与游离细胞进行比对。在不同温度下反应3h，每隔30min取样测定酶活，确定细胞固定化后的温度稳定性，每个样品做三组平行。
[0084]
实验结果如图5所示，与游离的菌相比，全细胞酶固定化后其脂肪酶的最适温度可达到45℃，比游离细胞的脂肪酶更能够耐受高温，并且在40℃保温3h后仍能保留80％左右的酶活，温度稳定性较好。
[0085]
(3)固定化细胞半衰期分析
[0086]
按照酶活的测定方法，将固定化细胞加入反应体系中测定酶活，然后离心倒去上清液，用pbs缓冲液将固定化细胞多次离心洗涤过滤，去除表面剩余的未反应底物和产物，然后重新加入反应体系中，测量剩余的酶活性，反复操作10次，以初始酶活为100％，分析随着使用次数的增加，固定化细胞表面酶活力的保留情况。
[0087]
实验结果如图6所示，在连续使用了10次之后全细胞酶酶活仍能剩余65％。
[0088]
实施例3
[0089]
肉葡萄球菌表面展示脂肪酶菌株生产生物柴油：
[0090]
称取4.585g的大豆油于50ml带塞锥形瓶内，加入适量的甲醇和微量的磷酸盐缓冲液，向所得混合物中实施例2制备得到的固定化细胞，分别在反应时间为3h、4h、5h、6h、7h和8h；醇油比为3：1、4：1、5：1和6：1；固定化细胞用量为0.8g、1.0g和1.2g；反应温度为37℃、40℃、45℃、50℃和55℃的条件下进行单因素实验，在180r/min的速度下，测定生物柴油转化率。
[0091]
实验结果如图7所示，当反应时间小于6h时，甘油的得率随着时间的延长而增加，6h时最高达60.6％。当反应时间为5h，醇油比为3:1时，甘油的得率达到最高值61.12％，随着醇油比增加，甘油的得率有所降低。当固定化细胞用量为1.0g时，甘油的得率达到最高值为69.07％，随着固定化细胞用量的增加，甘油得率并未显著增加；当反应温度为45℃时，甘油的得率达到最高值为75.3％，与之前固定化后全细胞酶的最适温度一致。
[0092]
为了进一步确定制备生物柴油的最佳条件，在单因素实验的基础上进行正交实验，以反应时间、醇油比、固定化细胞用量和反应温度作为自变量，以甘油得率作为指标，采用l9(34)正交表组合实验。其中反应时间的三水平为5h、6h、7h，反应温度的三水平为40℃、45℃、50℃，醇油比的三水平为3、4、5，固定化细胞用量的三水平为0.8、1.0、1.2。结果见表4，r为极差，数字越大说明此因素对响应值也就是甘油的得率越显著。由结果中r可以看出，四个因素对甘油得率的显著顺序为b》a》d》c，即醇油比对转化率的影响是最为显著的，固定化细胞用量的影响最小。固定化条件的最优组合为a1b1c1d3，即最优条件为反应5h，醇油比为3:1，固定化细胞用量0.8g，反应温度50℃时，甘油得率最高。本技术进一步检测正交实验最优组合条件下的甘油得率，结果显示，最优组合下的甘油得率即生物柴油转化率为77％。
[0093]
表4正交实验设计结果及极差分析
[0094][0095]
本具体实施方式的实施例均为本发明的较佳实施例，并非依此限制本发明的保护范围，故：凡依本发明的结构、形状、原理所做的等效变化，均应涵盖于本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种表面展示脂肪酶的重组质粒：其特征在于：所述重组质粒为质粒pbt2-spp-lip-cbd-xm，包括脂肪酶基因和纤维素结合结构域基因。2.根据权利要求1所述的一种表面展示脂肪酶的重组质粒：其特征在于：所述脂肪酶基因如seq id no.1所示；纤维素结合结构域基因如seq id no.2所示。3.根据权利要求2所述的一种表面展示脂肪酶的重组质粒：其特征在于：所述脂肪酶基因的上下游扩增引物如seq id no.3、seq id no.4所示；纤维素结合结构域基因的上下游扩增引物如seq id no.5、seq id no.6所示。4.一种权利要求1-3任一所述表面展示脂肪酶的重组质粒的构建方法：其特征在于：包括以下步骤：s1.以脂肪酶基因为模板，使用脂肪酶基因上下游引物扩增得到lip基因；以纤维素结合结构域基因为模板，使用纤维素结合结构域基因上下游引物扩增得到cbd基因；s2.以纯化后的lip基因和cbd基因为模板，使用脂肪酶基因上游引物和纤维素结合结构域基因下游引物扩增融合片段lip-cbd基因；s3.利用限制性内切酶分别对质粒pbt2-spp-xm和融合片段lip-cbd基因进行双酶切，并通过连接酶构建得到重组质粒pbt2-spp-lip-cbd-xm。5.一种表面展示脂肪酶的肉葡萄球菌，其特征在于：包括权利要求1-3任一所述表面展示脂肪酶的重组质粒。6.一种权利要求5所述表面展示脂肪酶的肉葡萄球菌的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：将重组质粒pbt2-spp-lip-cbd-xm电转至肉葡萄球菌s.carnosustm300感受态，于抗生素抗性tsb平板上进行培养，验证后得到s.carnosus tm300/p-spp-lip-cbd-xm重组菌株。7.一种权利要求5所述表面展示脂肪酶的肉葡萄球菌在制备生物柴油中的应用。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述制备生物柴油的方法如下：s1.菌种活化及菌体培养：将s.carnosustm300/p-spp-lip-cbd-xm进行菌种活化，并将活化后的菌种进行扩大培养；s2.固定化细胞的制备：对培养液进行离心，收集菌体并洗涤，取适量菌体重悬于pbs缓冲液中至od600＝1.0；在培养皿中加入上述菌悬液，再加入一张纤维素滤纸振荡孵育；s3.将大豆油、甲醇和磷酸盐缓冲液混合，向所得混合物中加入步骤s2制备得到的固定化细胞，震荡反应一段时间得到生物采油。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：步骤s3中，甲醇和大豆油的质量比为(3-6):1；固定化细胞和大豆油的质量比为(0.8-1.2):4.585；反应时间为3-8h，反应温度为37-55℃。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：甲醇和大豆油的质量比为3:1；固定化细胞和大豆油的质量比为0.8:4.585；反应时间为5h，反应温度为50℃。

技术总结
本发明公开了一种表面展示脂肪酶的肉葡萄球菌及构建方法和应用。所述表面展示脂肪酶的肉葡萄球菌为含有重组质粒pBT2-SPP-LIP-CBD-XM的S.carnosus TM300菌株。利用纤维素进行细胞固定化后，细胞表面展示的脂肪酶最适温度可达45℃，比游离细胞的脂肪酶更能够耐受高温，并且在40℃保温3h后仍能保留80％左右的酶活，温度稳定性较好。另外，本申请构建得到的S.carnosus TM300/P-SPP-LIP-CBD-XM重组菌株能够用于生产生物柴油，生物柴油转化率能够达到77％。本申请为生物柴油的制备提供了新思路和有应用价值的实验材料，具有较好的应用前景。景。景。


技术研发人员：薛鲜丽 王德培 王宇 胡娜 王华敏 高强
受保护的技术使用者：天津科技大学
技术研发日：2023.03.20
技术公布日：2023/7/12