一种微生物抗干扰快速检测方法及试剂与流程

1.本发明涉及微生物检测技术领域，具体为一种微生物抗干扰快速检测方法及试剂。


背景技术：

2.微生物因为体积小、质量轻、适应性强、繁殖能力强等特点，广泛分布于自然界中。它们存在于食品、化妆品、饲料、环境等人们能触及的各个角落中。某些微生物对产品的污染，不仅影响到产品本身的质量，更严重的是它危及消费者的健康和安全。
3.人类在生活和生产活动中都离不开水，水质的优劣与人类健康密切相关，随着社会经济发展、科学进步和人民生活水平的提高，水质标准也相应地不断发展和完善。水质标准除有物理指标、化学指标外，还有微生物指标。急性水体污染早期预警对于保障生态安全和人民健康具有重要意义。
4.现有的水体微生物检测方法主要有理化分析法和生物学方法。理化法是通过物理或化学的分析来估测水质的毒性。它可以定量地分析某种污染物，对单一物质测量精度及灵敏度较高，但不能直接反映出各种污染物的生物毒性，而且操作复杂，测试时间长，不适合进行现场快速检测和连续在线分析。
5.生物学方法是基于生物与环境相适应的原理，当水体中进入有毒污染物时，有毒污染物会对水体中正常生长生物的运动、生长发育、呼吸活动等产生抑制或促进作用，通过检测生物活动、代谢等的变化来评估水质。常用的指示生物如藻类、发光细菌等。但因受基准藻类培养质量的影响，存在着重复性差的缺点。而发光细菌法检测过程中需要复杂的信号转导过程导致其成本较高，且发光细菌对cl-较敏感，对ph也有较严格的要求，实验条件较为苛刻，容易出现误报警。总的来说，传统的生物学测试手段发展已比较成熟，一定程度上弥补了理化分析方法的不足，但存在周期长、操作复杂、重复性差、容易误报警等不足，也不能满足水质急性毒性监测的需要，所以我们提出了一种微生物抗干扰快速检测方法及试剂，以便于解决上述中提出的问题。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种微生物抗干扰快速检测方法及试剂，以解决上述背景技术提出的目前市场上的问题。
7.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种微生物抗干扰快速检测方法及试剂，包括以下步骤：
8.s1获取待测样本：将水体样品中的dna和rna分别进行提取，混合所得dna和rna得到总核酸，作为待测样本；
9.s2反应准备：准备扩增缓冲液、dntp混合物、引物和dna聚合酶；
10.s3第一轮pcr扩增：以s1所述的总核酸为模板dna，用带通用序列的特异性引物，进行pcr扩增，经加热一定时间后，使模板dna双链或经pcr扩增形成的双链dna解离，使之成为
单链；
11.s4第二轮pcr扩增：用s3获得的第一轮pcr产物为模板进行pcr扩增，温度降低，使引物与模板dna单链的互补序列配对结合；
12.s5引物的延伸：s4中引物与模板dna的结合物在dna聚合酶的作用下，以dntp为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板dna链互补的半保留复制链，这种新链即成为下次循环的模板；
13.s6测序接头的连接：用磁珠纯化s5中的产物，纯化完成后进行qubit浓度测定，将准备同批进行测序的样本混合，连接反应后得到测序文库；
14.s7测序并获取检测结果：利用测序平台对文库进行测序，获取核酸序列信息，根据所述核酸序列信息，获取所述待测样本的检测结果。
15.优选的，所述的s1中水样采集过程中应确保所采集水量为容量瓶容量的80％，采样过程中应保证水样的清澈，采集上层水样，所有采集的水样均需要在有效固定条件下低温冷藏保存，并在采集后立即运至实验室进行实验检测。
16.优选的，所述的s1中的总核酸需去除人源基因组。
17.优选的，所述的s3中加热温度为90～96℃。
18.优选的，所述的s4中温度降低至55～65℃。
19.优选的，所述的s5中dna聚合酶采用taqdna聚合酶或pfudna聚合酶，作用温度为70～75℃。
20.优选的，所述的s5中每完成一个循环需2～4分钟。
21.优选的，所述的扩增缓冲液在反应过程中辅助使用以保持酶的活性和帮助dna解除缠绕结构。
22.一种微生物抗干扰快速检测试剂，所述的试剂包括：第一轮pcr扩增试剂和第二轮pcr扩增试剂，所述的第一轮pcr扩增试剂包括多重扩增酶混合液和带通用序列的特异性引物，所述的第二轮pcr扩增试剂包括快速扩增酶混合液和带标签序列的引物。
23.优选的，两个所述的引物之间不存在互补序列且引物内部不出现互补序列。
24.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
25.(1)本发明通过pcr技术使dna集聚，确保dna可以和酶发生反应，使其在高温环境下发生异变或者在低温环境下发生裂变，最终加速模板dna的反应速度，从而检测水体中含有的污染物质浓度，通过引物退火和引物延伸同时进行，以减少升降温过程，提高了反应速度，缩短了实验周期。
26.(2)本发明利用微生物聚合酶链式反应来帮助技术人员进行检测，不仅能够对水质进行快速检测，还能在高效率的基础上提升检测准确度，具备高灵敏度、高产量以及快速简单等优势，可以满足水质急性毒性监测的需要。
附图说明
27.图1为本发明检测方法流程示意图。
具体实施方式
28.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完
整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
29.本发明提供一种微生物抗干扰快速检测方法，包括以下步骤：
30.s1获取待测样本：将水体样品中的dna和rna分别进行提取，混合所得dna和rna得到总核酸，作为待测样本；
31.s2反应准备：准备扩增缓冲液、dntp混合物、引物和dna聚合酶；
32.s3第一轮pcr扩增：以s1总核酸为模板dna，用带通用序列的特异性引物，进行pcr扩增，经加热一定时间后，使模板dna双链或经pcr扩增形成的双链dna解离，使之成为单链；
33.s4第二轮pcr扩增：用s3获得的第一轮pcr产物为模板进行pcr扩增，温度降低，使引物与模板dna单链的互补序列配对结合；
34.s5引物的延伸：s4中引物与模板dna的结合物在dna聚合酶的作用下，以dntp为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板dna链互补的半保留复制链，这种新链即成为下次循环的模板；
35.s6测序接头的连接：用磁珠纯化s5中的产物，纯化完成后进行qubit浓度测定，将准备同批进行测序的样本混合，连接反应后得到测序文库；
36.s7测序并获取检测结果：利用测序平台对文库进行测序，获取核酸序列信息，根据所述核酸序列信息，获取所述待测样本的检测结果。
37.s1中水样采集过程中应确保所采集水量为容量瓶容量的80％，采样过程中应保证水样的清澈，采集上层水样，所有采集的水样均需要在有效固定条件下低温冷藏保存，并在采集后立即运至实验室进行实验检测。
38.s1中的总核酸需去除人源基因组。
39.s3中加热温度为90～96℃。
40.s4中温度降低至55～65℃。
41.s5中dna聚合酶采用taqdna聚合酶或pfudna聚合酶，作用温度为70～75℃。
42.s5中每完成一个循环需2～4分钟。
43.扩增缓冲液在反应过程中辅助使用以保持酶的活性和帮助dna解除缠绕结构。
44.一种微生物抗干扰快速检测试剂，试剂包括：第一轮pcr扩增试剂和第二轮pcr扩增试剂，第一轮pcr扩增试剂包括多重扩增酶混合液和带通用序列的特异性引物，第二轮pcr扩增试剂包括快速扩增酶混合液和带标签序列的引物。
45.两个引物之间不存在互补序列且引物内部不出现互补序列。
46.实施例一
47.请参阅图1，一种微生物抗干扰快速检测方法，包括以下步骤：
48.s1获取待测样本：将水体样品中的dna和rna分别进行提取，混合所得dna和rna得到总核酸，作为待测样本，需要注意的是，水样采集过程中应确保所采集水量为容量瓶容量的80％，采样过程中应保证水样的清澈，采集上层水样，所有采集的水样均需要在有效固定条件下低温冷藏保存，并在采集后立即运至实验室进行实验检测。
49.样品处理的基本要求是除去杂质，并部分纯化样品中的核酸，经过sds和蛋白酶k处理，难以破碎的细菌，可用溶菌酶加edta处理，所得到的粗制dna，经酚、氯仿抽提纯化，再
用乙醇沉淀，总核酸需去除人源基因组。
50.s2反应准备：准备扩增缓冲液
×
10、dntp混合物100～250μmol/l、检测试剂，试剂包括：第一轮pcr扩增试剂和第二轮pcr扩增试剂，第一轮pcr扩增试剂包括多重扩增酶混合液和带通用序列的特异性引物，第二轮pcr扩增试剂包括快速扩增酶混合液和带标签序列的引物。
51.pcr反应中有两条引物，即5
′
端引物和3
′
引物，两个引物之间不存在互补序列且引物内部不出现互补序列，设计引物时以一条dna单链为基准，5
′
端引物与位于待扩增片段5
′
端上的一小段dna序列相同，3
′
端引物与位于待扩增片段3
′
端的一小段dna序列互补，引物长度：15-30bp。
52.扩增缓冲液在反应过程中辅助使用以保持酶的活性和帮助dna解除缠绕结构，提供合适的酸碱度与镁离子浓度总量应比dntps的浓度高，常用1.5mmol/l。
53.s3第一轮pcr扩增：以s1总核酸为模板dna，用带通用序列的特异性引物，进行pcr扩增，经加热至93℃，使模板dna双链或经pcr扩增形成的双链dna解离，使之成为单链；
54.s4第二轮pcr扩增：用s3获得的第一轮pcr产物为模板进行pcr扩增，温度降低至55℃，使引物与模板dna单链的互补序列配对结合；
55.s5引物的延伸：s4中引物与模板dna的结合物在taqdna聚合酶的作用下，作用温度为72℃，以dntp为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板dna链互补的半保留复制链，这种新链即成为下次循环的模板，每完成一个循环需2～4分钟；
56.s6测序接头的连接：用磁珠纯化s5中的产物，纯化完成后进行qubit浓度测定，将准备同批进行测序的样本混合，连接反应后得到测序文库；
57.s7测序并获取检测结果：利用测序平台对文库进行测序，获取核酸序列信息，根据所述核酸序列信息，获取所述待测样本的检测结果。
58.实施例二
59.请参阅图1，一种微生物抗干扰快速检测方法，包括以下步骤：
60.s1获取待测样本：将水体样品中的dna和rna分别进行提取，混合所得dna和rna得到总核酸，作为待测样本，需要注意的是，水样采集过程中应确保所采集水量为容量瓶容量的80％，采样过程中应保证水样的清澈，采集上层水样，所有采集的水样均需要在有效固定条件下低温冷藏保存，并在采集后立即运至实验室进行实验检测。
61.样品处理的基本要求是除去杂质，并部分纯化样品中的核酸，经过sds和蛋白酶k处理，难以破碎的细菌，可用溶菌酶加edta处理，所得到的粗制dna，经酚、氯仿抽提纯化，再用乙醇沉淀，总核酸需去除人源基因组。
62.s2反应准备：准备扩增缓冲液
×
10、dntp混合物100～250μmol/l、检测试剂，试剂包括：第一轮pcr扩增试剂和第二轮pcr扩增试剂，第一轮pcr扩增试剂包括多重扩增酶混合液和带通用序列的特异性引物，第二轮pcr扩增试剂包括快速扩增酶混合液和带标签序列的引物。
63.pcr反应中有两条引物，即5
′
端引物和3
′
引物，两个引物之间不存在互补序列且引物内部不出现互补序列，设计引物时以一条dna单链为基准，5
′
端引物与位于待扩增片段5
′
端上的一小段dna序列相同，3
′
端引物与位于待扩增片段3
′
端的一小段dna序列互补，引物
长度：15-30bp。
64.扩增缓冲液在反应过程中辅助使用以保持酶的活性和帮助dna解除缠绕结构，提供合适的酸碱度与镁离子浓度总量应比dntps的浓度高，常用1.5mmol/l。
65.s3第一轮pcr扩增：以s1总核酸为模板dna，用带通用序列的特异性引物，进行pcr扩增，经加热至94℃，使模板dna双链或经pcr扩增形成的双链dna解离，使之成为单链；
66.s4第二轮pcr扩增：用s3获得的第一轮pcr产物为模板进行pcr扩增，温度降低至60℃，使引物与模板dna单链的互补序列配对结合；
67.s5引物的延伸：s4中引物与模板dna的结合物在pfudna聚合酶的作用下，作用温度为70℃，以dntp为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板dna链互补的半保留复制链，这种新链即成为下次循环的模板，每完成一个循环需2～4分钟；
68.s6测序接头的连接：用磁珠纯化s5中的产物，纯化完成后进行qubit浓度测定，将准备同批进行测序的样本混合，连接反应后得到测序文库；
69.s7测序并获取检测结果：利用测序平台对文库进行测序，获取核酸序列信息，根据所述核酸序列信息，获取所述待测样本的检测结果。
70.需要注意的是，taq扩增效率高但易发生错配，pfu扩增效率弱但有纠错功能。实际使用时根据需要做不同的选择。
71.尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

技术特征：
1.一种微生物抗干扰快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：s1获取待测样本：将水体样品中的dna和rna分别进行提取，混合所得dna和rna得到总核酸，作为待测样本；s2反应准备：准备扩增缓冲液、dntp混合物、引物和dna聚合酶；s3第一轮pcr扩增：以s1所述的总核酸为模板dna，用带通用序列的特异性引物，进行pcr扩增，经加热一定时间后，使模板dna双链或经pcr扩增形成的双链dna解离，使之成为单链；s4第二轮pcr扩增：用s3获得的第一轮pcr产物为模板进行pcr扩增，温度降低，使引物与模板dna单链的互补序列配对结合；s5引物的延伸：s4中引物与模板dna的结合物在dna聚合酶的作用下，以dntp为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板dna链互补的半保留复制链，这种新链即成为下次循环的模板；s6测序接头的连接：用磁珠纯化s5中的产物，纯化完成后进行qubit浓度测定，将准备同批进行测序的样本混合，连接反应后得到测序文库；s7测序并获取检测结果：利用测序平台对文库进行测序，获取核酸序列信息，根据所述核酸序列信息，获取所述待测样本的检测结果。2.根据权利要求1所述的一种微生物抗干扰快速检测方法，其特征在于：所述的s1中水样采集过程中应确保所采集水量为容量瓶容量的80％，采样过程中应保证水样的清澈，采集上层水样，所有采集的水样均需要在有效固定条件下低温冷藏保存，并在采集后立即运至实验室进行实验检测。3.根据权利要求1所述的一种微生物抗干扰快速检测方法，其特征在于：所述的s1中的总核酸需去除人源基因组。4.根据权利要求1所述的一种微生物抗干扰快速检测方法，其特征在于：所述的s3中加热温度为90～96℃。5.根据权利要求1所述的一种微生物抗干扰快速检测方法，其特征在于：所述的s4中温度降低至55～65℃。6.根据权利要求1所述的一种微生物抗干扰快速检测方法，其特征在于：所述的s5中dna聚合酶采用taqdna聚合酶或pfudna聚合酶，作用温度为70～75℃。7.根据权利要求1所述的一种微生物抗干扰快速检测方法，其特征在于：所述的s5中每完成一个循环需2～4分钟。8.根据权利要求1所述的一种微生物抗干扰快速检测方法，其特征在于：所述的扩增缓冲液在反应过程中辅助使用以保持酶的活性和帮助dna解除缠绕结构。9.一种如权利要求1～8任一项所述的方法的微生物抗干扰快速检测试剂，其特征在于，所述的试剂包括：第一轮pcr扩增试剂和第二轮pcr扩增试剂，所述的第一轮pcr扩增试剂包括多重扩增酶混合液和带通用序列的特异性引物，所述的第二轮pcr扩增试剂包括快速扩增酶混合液和带标签序列的引物。10.根据权利要求9所述的一种微生物抗干扰快速检测试剂，其特征在于：两个所述的引物之间不存在互补序列且引物内部不出现互补序列。

技术总结
本发明公开了一种微生物抗干扰快速检测方法及试剂，涉及微生物检测。本发明包括以下步骤，S1获取待测样本；S2反应准备；S3第一轮PCR扩增；S4第二轮PCR扩增；S5引物的延伸；S6测序接头的连接；S7测序并获取检测结果。本发明通过PCR技术使DNA集聚，确保DNA可以和酶发生反应，使其在高温环境下发生异变或者在低温环境下发生裂变，最终加速模板DNA的反应速度，从而检测水体中含有的污染物质浓度，通过引物退火和引物延伸同时进行，以减少升降温过程，提高了反应速度，缩短了实验周期。缩短了实验周期。缩短了实验周期。


技术研发人员：王荃生
受保护的技术使用者：王荃生
技术研发日：2023.05.23
技术公布日：2023/7/12