与单纯法洛四联症相关的TBX1基因非编码突变及其应用

与单纯法洛四联症相关的tbx1基因非编码突变及其应用
技术领域
1.本发明属于基因工程医学领域，涉及tbx1基因非编码区突变及其在单纯法洛四联症辅助诊断中的应用。


背景技术：

2.先天性心脏病(congenitalheartdisease,chd)，是由于心脏或者胸腔内大血管在胚胎发育过程中的障碍所致的先天性结构异常。先心病是一种最为常见的先天性疾病，占所有出生缺陷的28％左右，是造成婴幼儿死亡或残疾的主要原因之一。在我国，据卫生部2012年出生缺陷防治报告统计，2011年出生的先心患儿约24万，占所有监测出生缺陷的26.7％，先心病已成为我国围产儿第一高发出生缺陷。青紫型先心病是先心病中最严重的类型，而法洛四联症(tetralogyoffallot,tof)是其中最常见的一种亚型，患儿自然预后不佳，若未及时诊治则大多在成年期前死亡，即使手术治疗仍有部分患儿出现术后并发症，或终生伴随心律失常、心室功能障碍等后遗症，严重危害婴幼儿生存和生活质量，造成潜在寿命减少和巨大的社会经济负担。
3.目前，通过新一代的测序技术，直接对整个外显子组或者基因组进行测序，越来越多的先心相关基因被发现，如心脏发育相关转录因子基因(nkx2-5，gata4，tbx1，irx4等)，发育相关信号通路基因(zic3，nodal，lefty2等)以及心脏结构蛋白相关基因(myh6，myh7等)。以往家系研究和流行病学研究发现了一些法洛四联症的遗传致病因素，例如1q21.1区域的拷贝数变异，或转录因子基因上的显性突变等。最近有研究表明，已知或新发的先天性心脏病突变均存在一定程度的不完全显性，其中染色体22q11.2区域(tbx1)拷贝数缺失被认为是法洛四联症的致病因素之一，但其在正常人群中频率约为1/4000，家系样本中的无症状成员也会携带该拷贝数变异。而携带tbx1基因非编码区突变的个体极有可能发展为法洛四联症患者，尤其是有先心病家族史者。针对突变携带者采取一系列的预防措施，例如较早的进入先心病筛查，并提高筛查频率，以及预防性手术的实施将早期发现法洛四联症而取得较好的干预和治疗效果。若能筛选出法洛四联症发病相关的突变位点作为生物标志物，并研制相应的诊断试剂盒，对我国先心病筛查和早期诊断必将是一次有力的推动。


技术实现要素：

4.在该研究中，发明人筛选出人群中tbx1增强子区域与单纯法洛四联症发生相关的新突变，本发明的目的在于公开了一种tbx1基因增强子区域突变序列。
5.本发明的第二个目的是提供上述突变位点可以作为分子标志物用于产前筛查单纯法洛四联症发生的高危人群的辅助诊断。
6.本发明的目的是通过下列技术方案实现的：
7.一种与单纯法洛四联症相关的tbx1基因突变序列，该突变后的序列为seq id no.2，所述tbx1突变序列与正常基因序列(grch37.p13)相比具有g.19737694c》t，或g.19737957a》c，或g.19738665g》c突变。
8.用于检测所述tbx1基因突变序列的引物组合为：
9.检测g.19737694c》t的引物：上游引物为seq id no.3，下游引物为seq id no.4；
10.检测g.19737957a》c的引物：上游引物为seq id no.3，下游引物为seq id no.4；
11.检测g.19738665g》c的引物：上游引物为seq id no.5，下游引物为seq id no.6。
12.一种检测所述tbx1基因突变序列的检测方法：采用sanger测序方法，使用pcr扩增引物，对tbx1基因增强子区域进行突变检测。
13.所述的检测方法，其中pcr扩增引物为seq id no.3-seq id no.6所示的核苷酸序列。
14.所述的引物组合在制备单纯法洛四联症辅助诊断试剂盒的应用
15.一种单纯法洛四联症辅助诊断所述的试剂盒，该试剂盒含有检测所述tbx1基因突变序列的引物组合。该试剂盒包含的引物组合为下列引物对的一对或几对：
16.检测g.19737694c》t的引物：上游引物为seq id no.3，下游引物为seq id no.4；
17.检测g.19737957a》c的引物：上游引物为seq id no.3，下游引物为seq id no.4；
18.检测g.19738665g》c的引物：上游引物为seq id no.5，下游引物为seq id no.6。
19.采用sanger测序技术在302例单纯法洛四联症患者和1000例无心脏缺陷家族史对照人群中，我们发现有9例患者存在tbx1基因上游增强子区域g.19737694c》t，g.19737957a》c，g.19738665g》c重复出现的突变，并且与单纯法洛四联症的发生显著相关(g.19737694c》t，or＝6.66，p＝3.67
×
10-03
；g.19737957a》c，or＝6.66，p＝3.67
×
10-03
；g.19738665g》c，or＝3.34，p＝7.96
×
10-03
)。随后通过功能实验证实，这3个突变将导致tbx1基因的表达显著下降，动物实验也证实该区域敲除将导致先天性心脏缺陷发生。随后在另外的516例单纯法洛四联症病例样本和2276例正常对照样本中进行验证。验证结果显示，g.19737694c》t在病例与对照中均不存在。而g.19737957a》c(or＝4.42，p＝2.22
×
10-02
)和g.19738665g》c(or＝2.95，p＝3.18
×
10-02
)分别均与单纯tof发生显著相关。
20.以上研究所发现的与单纯法洛四联症辅助诊断相关的突变位点分别为g.19737694c》t，g.19737957a》c，g.19738665g》c，该突变发生于第22号染色体(ncbi参考序列grch37.p13)，数据库中该3个突变位点及其所在区域的碱基序列如seq id no:1所示(grch37.p13)，突变序列对应的序列如seq id no:2所示。
21.seq id no:1
22.cctagaggatccagggatggcccaggtgctcctgccccacctgttccaggccagctgtgtcaggggtactgcctccgtttctccaggctgggacctccactgcagtgggtacattggacactcagaccagccccagggcctggcagttcctggtgaagactgagacagcccgacacccgtccacacccccgcccaggatggggtggctgctgggtcactcggtcctggcaaacacgctggagggaggggctggattgactttagggcactggtaaaagctcacatccatctgtccacccagaacagctggtgccaagcacccacttagcaggacagggcagcccgcgcctccacactgcccatgccccctcccgtctcccaggacgtccacacaggagccacatgtgtcctggacccacgccaccccccgctctgtccctctgttccctgagctgggctggcaggggaagctgaggtgtacagggatggccaaggcctcctccctcccccctgcaccccctagccccattggcattacctcagagcagacaacagcttagtggggacccaagtgagggggtgtcagtggcccaggccctgccctgcccagtcactcaggcagctaagagagcaggaagggcccagacgacacccccacagacatatgccagcccctccgggtgaccaaaatcatctcagtaaaggcagatgaggccaagcgaaaaggggtgggtggaagaaccggctctgagtctcagcccacagacactcggacactcgtcggcccggtaggcaggggttcctggtggcctcaggctgtcaggcccggccccctcccg
cagctgtctccagctcccacctcccccgcccaccccccaggactcctatttcactgaggagattaagaccacctggcgagaacccctcccacccctcccctctccccagccctccctcctaaccctgtcggccccttgaggtgccctcccggccccggccctcctctcccatccccacgttcctccacggcagcctccacgccctgccctgccctgccctgccatgggcctgaggatgtccccacccgctctgatggccacctcgggtcacttctcctcagcccataccctggcctaacccccaccctgagcctccagtccctccaatcctcaccctttatgtcccccagccctgcatagatacaggcatcgtcaccagccacggcaatggatcccgtccacctcccacccggccactccagacccaaattcagcactggcttcagcctcctgccattcttgctgggtctcaggagggaaccgggccagccaggtgctgtctgggactgtaggctctgagcctggtccctgctcagttccagcagccagtgggccaggggtgctcagctgaggacccccactccatccagcctgccgtggggcagccggcctggcctgatgctggctcagacagactcatgaggaatctgagctctgaaaaccgcagctccgagcttgcctgtttgtttgctt
23.seq id no:2(三个突变单独出现)
24.cctagaggatccagggatggcccaggtgctcctgccccacctgttccaggccagctgtgtcaggggtactgcctccgtttctccaggctgggacctccactgcagtgggtacattggacactcagaccagccccagggcctggcagttcctggtgaagactgagacagcccgacacccgtccacacccccgcccaggatggggtggctgctgggtcactcggtcctggcaaacacgctggagggaggggctggattgactttagggcactggtaaaagctcacatccatctgtccacccagaacagctggtgccaagcacccacttagcaggacagggcagcccgtgcctccacactgcccatgccccctcccgtctcccaggacgtccacacaggagccacatgtgtcctggacccacgccaccccccgctctgtccctctgttccctgagctgggctggcaggggaagctgaggtgtacagggatggccaaggcctcctccctcccccctgcaccccctagccccattggcattacctcagagcagacaacagcttagtggggacccaagtgagggggtgtcagtggcccaggccctgccctgccccgtcactcaggcagctaagagagcaggaagggcccagacgacacccccacagacatatgccagcccctccgggtgaccaaaatcatctcagtaaaggcagatgaggccaagcgaaaaggggtgggtggaagaaccggctctgagtctcagcccacagacactcggacactcgtcggcccggtaggcaggggttcctggtggcctcaggctgtcaggcccggccccctcccgcagctgtctccagctcccacctcccccgcccaccccccaggactcctatttcactgaggagattaagaccacctggcgagaacccctcccacccctcccctctccccagccctccctcctaaccctgtcggccccttgaggtgccctcccggccccggccctcctctcccatccccacgttcctccacggcagcctccacgccctgccctgccctgccctgccatgggcctgaggatgtccccacccgctctgatggccacctcgggtcacttctcctcagcccataccctggcctaacccccaccctgagcctccagtccctccaatcctcaccctttatgtcccccagccctgcatagatacaggcatcgtcaccagccacggcaatggatcccgtccacctcccacccggccactccagacccaaattcagcactggcttcagcctcctgccattcttgctgggtctcaggaggcaaccgggccagccaggtgctgtctgggactgtaggctctgagcctggtccctgctcagttccagcagccagtgggccaggggtgctcagctgaggacccccactccatccagcctgccgtggggcagccggcctggcctgatgctggctcagacagactcatgaggaatctgagctctgaaaaccgcagctccgagcttgcctgtttgtttgctt
25.所述的突变位点的特异性测序引物，该引物为：
26.g.19737694c》t，g.19737957a》c的引物序列为seq id no:3和seq id no:4；
27.g.19738665g》c的引物序列为seq id no:5和seq id no:6。
28.所述诊断试剂盒，该试剂盒还可以包括pcr反应常用的酶和试剂，如taq酶、dntp混合液、mgcl2溶液、去离子水等；还可以含有标准品和/或对照品。
29.具体地说，本发明解决问题的技术方案包括：(1)筛选出与中国汉族人群单纯法洛四联症发病风险相关联的新突变，提供位点的突变后碱基序列；(2)建立统一标准的标本库和数据库：以标准操作程序(sop)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料和临床资料；(3)突变筛选和验证其作用：采用sanger测序技术在302例单纯法洛四联症患者
和1000例无心脏缺陷家族史对照人群中，我们发现有9例患者存在tbx1基因上游增强子区域g.19737694c》t，g.19737957a》c，g.19738665g》c重复出现的突变，并且与单纯法洛四联症的发生显著相关(g.19737694c》t，or＝6.66，p＝3.67
×
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；g.19737957a》c，or＝6.66，p＝3.67
×
10-03
；g.19738665g》c，or＝3.34，p＝7.96
×
10-03
)。随后通过功能实验证实，这3个突变将导致tbx1基因的表达显著下降，动物实验也证实该区域敲除(sscrofa11.a/susscr11(feb.2017)，chr14:51281844-51283216)将导致先天性心脏缺陷发生。并且在另外的516例单纯法洛四联症病例样本和2276例正常对照样本中进行验证。验证结果显示，g.19737694c》t在病例与对照中均不存在。而g.19737957a》c(or＝4.42，p＝2.22
×
10-02
)和g.19738665g》c(or＝2.95，p＝3.18
×
10-02
)分别均与单纯tof发生显著相关。
30.本发明人以标准操作程序(sop)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料、临床资料等，并采用sanger测序技术对tbx1基因上游增强子区域进行扫描。
31.具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分：
32.1、研究对象的选择
33.(1)病例：经心脏超声或手术明确诊断为单纯法洛四联症病例302例。排除标准：合并其他畸形，染色体异常，母亲孕期患糖尿病、苯丙酮尿症、麻疹、或曾暴露于致畸物。
34.(2)对照：1000例无心脏缺陷家族史的健康对照。
35.本研究共采用1302例符合标准的样本进行研究。
36.2.酚-氯仿法提取外周血基因组dna，按常规方法操作。通常能得到20-50ng/μldna，纯度(紫外260od与280od比值)在1.6-2.0。
37.3.sanger测序技术筛选突变位点
38.(1)取受试者全基因组dna样本；
39.(2)采用primer 3软件在线设计引物；
40.(3)采用sanger测序对tbx1基因的上游增强子区域进行扫描；
41.(4)检测并比较各基因型在单纯法洛四联症病例与健康对照中的分布差异。
42.4.荧光素酶报告基因实验证实突变位点调控功能
43.(1)合成携带突变的目标片段并构建质粒；
44.(2)进行感受态细胞转化并且进行重组质粒验证；
45.(3)完成细胞转染并培养；
46.(4)进行荧光素酶报告基因检测。
47.5.突变位点区域(grch37.p13，chr22:19737651-19738734)敲除证实区域调控功能
48.(1)设计crispr/cas9基因编辑系统引物；
49.(2)应用crispr/cas9系统对突变所在区域进行编辑；
50.(3)筛选验证得到目标细胞，进行基因表达检测。
51.6.单个突变位点采用sanger测序平台进行基因分型
52.(1)取受试者dna样本；
53.(2)采用primer 3软件在线设计引物；
54.(3)采用sanger测序对tbx1基因的上游增强子区域进行扫描；
55.(4)检测并比较单纯法洛四联症病例与健康对照中不同基因型的分布差异。
56.7.诊断试剂盒制备方法
57.采用sanger测序对tbx1基因的上游增强子区域进行扫描和单个突变位点检测后确定单纯法洛四联症病例与健康对照中基因型分布差异的突变位点，作为单纯法洛四联症诊断的指标。最后将筛选出的与单纯法洛四联症发病有关的突变位点的检测引物组成辅助诊断试剂盒(g.19737694c》t，g.19737957a》c，g.19738665g》c)。诊断试剂可以包括该突变位点的特异性引物中的一对或几对以及taq酶、dntp等试剂。
58.8.统计分析方法
59.运用卡方检验(用于分类变量)或者t检验(用于连续性变量)比较人口学特征等在研究对象组间分布的差异。
60.统计学分析均通过专门的统计学分析软件完成(r3.0.3)。统计学显著性水平p值设为0.05，所有统计学检验均为双侧检验。
61.以下是本发明进一步的说明：
62.在上述302例符合条件的单纯法洛四联症病例中我们采用sanger测序对tbx1基因上游非编码区进行扫描的相关结果。
63.根据sanger测序检测结果，本发明人检测到在“单纯法洛四联症病例”组中的2名，2名，5名患者分别存在g.19737694c》t，g.19737957a》c，g.19738665g》c突变。
64.随后通过功能实验证实，这3个突变将导致tbx1基因的表达显著下降，动物实验也证实该区域敲除将导致先天性心脏缺陷发生。
65.并且在另外的516例单纯法洛四联症病例样本和2276例正常对照样本中进行验证。验证结果显示，g.19737694c》t在病例与对照中均不存在。而g.19737957a》c(or＝4.42，p＝2.22
×
10-02
)和g.19738665g》c(or＝2.95，p＝3.18
×
10-02
)均与单纯tof发生显著相关。
66.根据上述实验结果，本发明人发现了三个能用于单纯法洛四联症辅助诊断的突变位点。
67.具体而言，这三个突变位点的碱基序列的改变有助于单纯法洛四联症的辅助诊断，为临床医生快速准确掌握患者的疾病状态和病情严重程度，及时采取更具个性化的防治方案提供支持。
68.本发明有益效果：
69.本发明提供的突变位点序列改变作为单纯法洛四联症辅助判断的标志物的优越性在于：
70.(1)突变位点是一种新型基因生物标志物，区别于传统生物标志物，稳定、微创、易于检测，该类生物标志物的成功开发将为单纯法洛四联症的辅助诊断和治疗开创全新局面，为其他疾病生物标志物的研制提供借鉴。
71.(2)采用严密的验证和评价体系，本发明人初期采用sanger测序对tbx1基因非编码区进行扫描以获取疾病相关的突变位点谱，并应用sanger测序方法在大样本单纯法洛四联症患者中进行了验证；以上方法和策略的应用加速和保证了突变位点生物标志物和诊断试剂盒在临床上的应用，也为其他疾病生物标志物的研制提供方法和策略上的借鉴。
72.本发明通过研究突变位点在单纯法洛四联症辅助诊断的应用前景，阐述突变位点对于单纯法洛四联症进展的影响，揭示其诊断价值。因此，本发明获得了单纯法洛四联症发病相关突变位点谱；通过突变位点序列的改变进行相关辅助诊断试剂盒的研制和应用，可
使得单纯法洛四联症的诊断更加方便易行，为临床医生快速准确掌握患者病情，为临床治疗效果评价奠定基础，并为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物靶标提供帮助。
附图说明
73.图1：荧光素酶报告基因结果。
74.图2：目标区域的敲除及tbx1表达结果
具体实施方式
75.以下通过实施例对本发明作进一步的阐述，实验过程中未详细描述的操作步骤为本领域技术人员公知的相关操作步骤，采用的试剂为与检测方法相适应的设备厂商提供的配套试剂及常规试剂，均可从市售获得，不再进行特别说明。
76.实施例1样品的收集和样品资料的整理
77.发明人于2008年开始至2014年从南京医科大学第一附属医院、第二附属医院和附属儿童医院及社区正常人群中收集了大量的单纯法洛四联症患者及正常人群的血标本，通过对样品资料的整理，发明人从中选择了符合下列标准的样本sanger测序扫描分型的实验样品：
78.1、心脏超声或手术明确诊断为单纯法洛四联症病例302例。
79.2、未合并其他畸形，染色体异常，母亲孕期未患糖尿病、苯丙酮尿症、麻疹、或曾暴露于致畸物；
80.3、社区来源的全人群队列中的样本1000例。
81.并系统采集了这些样本的人口学资料和临床资料等情况。
82.实施例2外周血dna中突变位点的测序扫描
83.在上述符合条件的单纯法洛四联症患者和健康对照中，采用sanger测序检测获得相关结果，测序过程遵循sanger测序的标准操作，人工设计sanger测序引物，引物序列为上游引物i，5
’‑
cctagaggatccagggatgg-3’，上游引物ii，5
’‑
agatgaggccaagcgaaaa-3’，下游引物i，5
’‑
cacagacactcggacactcg-3’，下游引物ii，5
’‑
gcttgcctgtttgtttgctt-3’，引物序列由南京金斯瑞公司合成。
84.具体步骤为：
85.1、向储存于2ml冻存管中的白细胞加入溶血试剂(每1000ml含蔗糖109.86g，mgcl
2 1.01g，triston x-100 10ml，0.1m tris-hcl(ph8.0)液定容至1000ml，下同)，颠倒混匀后完全转入。
86.2、去除红细胞：用溶血试剂将5ml离心管补至4ml，颠倒混匀，4000rpm离心10分钟，弃上清。向沉淀中加入4ml溶血试剂，再次颠倒混匀清洗一次，4000rpm离心10分钟，弃上清。
87.3、抽提dna：向沉淀中加1ml抽提液(每300ml中含有122.5ml 0.2m氯化钠，14.4ml 0.5m乙二胺四乙酸，15ml 10％十二烷基硫酸钠，148.1ml双蒸水，下同)和8μl蛋白酶k，震荡器上充分震荡混匀，37℃水浴过夜。
88.4、去除蛋白质：加1ml饱和酚充分混匀(手轻摇15分钟)，4000rpm离心10分钟，取上清转入新的5ml离心管中。在上清液中加入等体积氯仿与异戊醇混合液(氯仿:异戊醇＝24:1，v/v，下同)，充分混匀后(手摇15分钟)，4000rpm离心10分钟，取上清(分入两个1.5ml的离
心管)。
89.5、dna沉淀：在上清液中加入3m的醋酸钠60μl，再加入与上清液等体积的冰无水乙醇，上下轻摇，可见白色絮状沉淀物，再以12000rpm离心10min。
90.6、dna洗涤：在沉淀中加入冰无水乙醇1ml，12000rpm离心10min，弃上清后真空抽干或置于清洁干燥环境中蒸干。
91.7、测量浓度：通常能得到20-50ng/μl dna，纯度(紫外260od与280od比值)在1.6-2.0。
92.8、pcr反应体系30微升，包括：模板50ng；引物f：1微升和引物r：1微升；2
×
mix 15微升；h2o补足至30微升。(不同突变位点检测分别加入相关引物)
93.9、pcr反应程序：95℃ 5min；(95℃ 30s；tm℃ 30s；72℃ 30s)
×
40个循环；72℃ 6min；4℃保持。
94.10、采用abi3730平台进行sanger测序；
95.11、使用chromas2软件进行序列比较和分析。
96.12、sanger测序结果的分析与处理：在“单纯法洛四联症病例”组中发现分别有2名，2名，5名患者分别存在g.19737694c》t，g.19737957a》c，g.19738665g》c突变。
97.实施例3突变位点的荧光素酶报告基因功能实验验证
98.采用荧光素酶报告基因实验检测突变对非编码区元件功能的影响。根据pgl4.26载体的工作原理，分别设计并合成携带或不携带突变的目标区域片段，并将它们分别克隆至pgl4.26质粒中，构建野生型与突变型两种重组载体质粒，然后将这两种质粒转染至h293t细胞，加入荧光素酶底物，通过检测荧光值的强度来判断突变对目标片段功能的影响。
99.具体实验步骤如下：
100.(1)目的片段的合成：本研究直接合成潜在调控区域的序列(wt)，并通过定点突变产生分别包含突变位点的序列(g.19737694c》t，g.19737957a》c，g.19738665g》c)。目标序列的合成和定向突变由南京新科元生物技术公司完成。
101.(2)pgl4.26-目标片段载体构建：
102.a)目的片段和pgl4.26空载体双酶切反应，体系分别为40μl和20μl，37℃酶切过夜；具体体系如下：
[0103][0104]
b)酶切产物切胶纯化：将目的片段和空载体酶切产物用1％琼脂糖进行凝胶电泳，
然后在紫外灯下快速切取含dna的胶块，采用takara凝胶纯化试剂盒回收目的片段dna，测定浓度和纯度，待用；
[0105]
c)酶切产物连接：采用takara dna连接试剂盒，将空载体与目的片段(1:6)混合，总体积10μl，加入等体积solution i，混匀后16℃孵育2小时；
[0106]
(3)感受态细胞转化：
[0107]
a)将上一步骤中连接产物加入感受态细胞中，混匀，冰上孵育30分钟；
[0108]
b)42℃孵育90秒后，立即置于冰上孵育3分钟；
[0109]
c)加入900μl不含抗生素的lb培养基，37℃孵育10分钟，然后37℃振荡培养45分钟，150转/每分钟；
[0110]
d)2,500g离心5分钟，去除900μl上清后重悬，均匀涂布于含有氨苄青霉素(60μg/ml)的lb培养基上，室温正置10分钟，待菌液干后，37℃倒置培养12-16小时；
[0111]
(4)重组质粒验证：
[0112]
a)每皿随机挑取8-10个单克隆菌落，置于装有5ml lb液体培养基(含amp)的15ml ep管中，37℃振荡培养过夜；
[0113]
b)16小时后用质粒小量抽取试剂盒抽取质粒；
[0114]
c)提取的质粒用mlu i酶和hind iii酶进行双酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，确定阳性克隆，然后将相应质粒送南京金斯瑞生物科技公司进行测序，挑选仅目的突变处碱基不同，其余位置均与参考序列一致的重组质粒抽提后用于后续研究；
[0115]
(5)细胞转染：
[0116]
a)转染前准备：转染前一天用胰酶消化细胞，并用完全培养液重悬，均匀铺入24孔细胞培养板，密度在70-80％左右；
[0117]
b)制备转染混合液：包括目的质粒、prl-sv40质粒和lipofectamine 2000转染试剂，根据预实验选择荧光值在1000-99999之间的质粒用量，lipofectamine 2000用量与目的质粒的质量比为2:1，三者终体积均为25μl/孔，不足者以无抗生素、无血清培养液补足，将三者混匀后室温孵育5分钟；
[0118]
c)取出步骤a)中24孔培养板，换液，每孔加入425μl完全培养液，然后每孔加入75μl转染混合液，培养24小时；
[0119]
(6)报告基因检测(采用promega报告基因检测试剂盒)：
[0120]
a)取出24孔板，弃掉培养基，用pbs清洗细胞2次，每孔加入120μl1
×
plb；
[0121]
b)振荡15分钟，60转/分钟；
[0122]
c)将luciferase assay substrate与luciferase assay bufferⅱ混匀分装，50μl/
[0123]
孔，备用；
[0124]
d)稀释50
×
stop&gld substrate至1
×
，分装，50μl/孔；
[0125]
e)轻轻吹打细胞，将细胞裂解液移入一新1.5ml ep管中；
[0126]
f)取20μl/孔样本，采用lb960 centro xs3化学发光仪检测样本萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶活性。
[0127]
实验及统计结果显示，相对于携带野生型序列的质粒，携带3个突变质粒的荧光素酶活性均显著低于野生型，提示这3个突变均可以导致tbx1表达降低，其可能是通过破坏了
增强子的结构，使转录因子不能与之结合而导致tbx1表达降低
[0128]
(图1)。
[0129]
实施例4突变位点所在区域的基因调控功能实验验证
[0130]
crispr/cas9系统由核酸内切酶cas9和单向导rna(single guide rna,sgrna)两部分组成。sgrna能够结合cas9蛋白，通过互补配对识别目标区域序列，从而介导cas9蛋白对目标dna进行切割，引入dna双链断裂(double-strand breaks,dsbs)。而非同源末端结合(non-homologous end joining,nhej)方式修复dsbs易发生基因突变从而实现特定基因或者目标序列的敲除。具体实验过程及步骤如下：
[0131]
(1)采用vector nti 11.5.1软件设计sgrna，采用primer3(v 0.4.0)在线引物设计软件设计pcr引物，用于验证crispr/cas9系统的编辑结果。
[0132]
(2)将上述for/rev sgrna稀释，然后用高保真酶进行pcr，模板为puc57-u6-grna(kana抗性)质粒，具体反应条件如下：
[0133][0134]
(3)对得到的pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测条带的单一性；
[0135]
(4)纯化回收pcr产物，并测定回收产物的浓度；
[0136]
(5)配制切连体系，以pgl3-ccdb-ef1a-puroem+83(amp抗性)为基础构建sgrna载体，具体反应体系和条件如下：
[0137][0138][0139]
反应条件：
2.0。
[0157]
8、采用sanger测序平台对于tbx1基因上游调控区域进行基因分型。
[0158]
9、pcr反应体系30微升，包括：模板50ng；引物f：1微升和引物r：1微升；2
×
mix 15微升；h2o补足至30微升。
[0159]
10、pcr反应程序：95℃ 5min；(95℃ 30s；tm℃ 30s；72℃ 30s)
×
40个循环；72℃ 6min；4℃保持。
[0160]
11、采用abi3730平台进行sanger测序；
[0161]
12、使用chromas2软件进行序列比较和分析，并且在另外的516例单纯法洛四联症病例样本和2276例正常对照样本中进行验证。验证结果显示，g.19737694c》t在病例与对照中均不存在。而g.19737957a》c(or＝4.42，p＝2.22
×
10-02
)和g.19738665g》c(or＝2.95，p＝3.18
×
10-02
)均与单纯tof发生显著相关。
[0162]
实施例6用于单纯法洛四联症辅助诊断突变位点试剂盒的制作
[0163]
突变位点试剂盒的制作和操作流程是基于sanger测序扫描检测分型技术。试剂盒含有一批突变位点特异性引物(包括下列引物：g.19737957a》c，g.19737694c》t突变位点的引物序列为seq id no:3和seq id no:4；g.19738665g》c突变位点的引物序列为seq id no:5和seq id no:6)，还可以有相应pcr技术所需的常用试剂，如：dntps，mgcl2，双蒸水等，这些常用试剂都是本领域技术人员熟知的，另外还可以有标准品和对照(如确定基因型的标准品和空白对照等)。此试剂盒的价值在于只需要外周血而不需要其它组织样品，通过最精简和特异的引物对检测突变位点，再通过突变位点谱辅助判断单纯法洛四联症，不仅稳定，检测方便，且精确，大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，因此将此试剂盒投入实践，可以帮助指导诊断和更有效的个体化治疗。
[0164]
表1.相关突变位点引物和探针信息
[0165]

技术特征：
1.一种与单纯法洛四联症相关的tbx1基因突变序列，其特征在于：突变后的序列为seq id no.2，所述tbx1突变序列与正常基因序列(grch37.p13)相比具有g.19737694c>t，或g.19737957a>c，或g.19738665g>c突变。2.用于检测权利要求1所述tbx1基因突变序列的引物组合，其特征在于：检测g.19737694c>t的引物：上游引物为seq id no.3，下游引物为seq id no.4；检测g.19737957a>c的引物：上游引物为seq id no.3，下游引物为seq id no.4；检测g.19738665g>c的引物：上游引物为seq id no.5，下游引物为seq id no.6。3.一种检测权利要求1所述tbx1基因突变序列的检测方法，其特征在于：采用sanger测序方法，使用pcr扩增引物，对tbx1基因增强子区域进行突变检测。4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于：所述的pcr扩增引物为seq id no.3-seq id no.6所示的核苷酸序列。5.权利要求2所述的引物组合在制备单纯法洛四联症辅助诊断试剂盒的应用。6.一种单纯法洛四联症辅助诊断所述的试剂盒，其特征在于该试剂盒含有检测权利要求1所述tbx1基因突变序列的引物组合。7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于该试剂盒包含权利要求2所述的引物组合的一对或几对。

技术总结
本发明属于基因工程医学领域，公开了与单纯法洛四联症相关的TBX1基因非编码突变及其应用。该TBX1基因突变序列为SEQ ID NO.2，其与正常基因序列(GRCh37.p13)相比具有g.19737694C>T，或g.19737957A>C，或g.19738665G>C突变。检测该突变位点的引物对可用于制备单纯法洛四联症辅助诊断试剂盒。可用于制备单纯法洛四联症辅助诊断试剂盒。可用于制备单纯法洛四联症辅助诊断试剂盒。


技术研发人员：沈洪兵 胡志斌 靳光付 戴俊程 蒋涛 江玥
受保护的技术使用者：南京医科大学
技术研发日：2023.04.26
技术公布日：2023/7/13