一种防治黄芪根腐病的生物菌剂及其制备方法与流程

1.本发明涉及黄芪根腐病防治技术领域，具体是一种防治黄芪根腐病的生物菌剂及其制备方法。


背景技术：

2.黄芪具有补气的功效，对于气虚乏力、自汗、盗汗、久泻脱肛、失眠多梦等病症有一定的调理效果。黄芪还可以起到解毒排脓、敛疮生肌的作用，在中药领域广泛应用；黄芪产量和品质不仅影响药材的质量和药效，而且直接影响种植户的经济收益；随着人工种植面积的增加和连作年限的加长，近年来，在黄芪主产区，根腐病害的发病率持续居高不下；已然成为制约黄芪高产优质的主要因素之一；感染了根腐病害的黄芪植株一般表现为长势衰弱，植株弱小，叶色变淡，严重时叶片枯黄、脱落；根茎部表皮粗糙，发褐，长出横向或纵向纹络及龟裂纹，呈褐色腐朽，表皮易剥落；而通过生物菌剂对根腐病的防治具有积极作用，因此，得到了广泛的应用
3.中国专利公开了一种防治黄芪根腐病的复合菌群及其应用(授权公告号cn113913320b)，该专利技术在黄芪根部定殖，对黄芪根腐病的防治与促进黄芪生长具有协同增效的作用，但是其对黄芪根腐病的防治具有一定的作用，但是效果不甚明显，不能显著地改善根腐病地区黄芪的产量和品质。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种防治黄芪根腐病的生物菌剂及其制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
5.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
6.一种防治黄芪根腐病的生物菌剂，包括按重量份组成如下：
7.25～30份拮抗枯草芽孢杆菌、8～10份拮抗放线菌、8～10份拮抗地衣芽孢杆菌、15～20份拮抗木霉菌以及3～4份活性保护剂；所述活性保护剂由抗坏血酸钠、海藻糖、脱脂乳粉、蔗糖组成，其质量比为(1.5～2)：(4～5)：(7～8)：(3.5～4)。
8.一种防治黄芪根腐病的生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：
9.s1、拮抗枯草芽孢杆菌制备：将枯草芽孢杆菌接种到小米浸液培养基上，在28～37℃温度下，在摇床中振荡培养2～3d，过滤后，取滤液作为枯草芽孢杆菌发酵液，将根腐病菌按照1:(180～220)的质量比加入到枯草芽孢杆菌发酵液中，并混合均匀后，倒入到铺有拮抗菌培养基的培养皿上，在28～37℃温度下，培养5～7d后，在离心分离机中离心分离8～10min，取上清液，即得到拮抗枯草芽孢杆菌；
10.s2、拮抗放线菌制备：将放线菌接入到小米浸液培养基上，在25～30℃温度下，在摇床中振荡培养2～3d，过滤后，取滤液作为放线菌发酵液，将根腐病菌按照1:(180～220)的质量比加入到放线菌发酵液中，并混合均匀后，倒入到铺有拮抗菌培养基的培养皿上，在25～30℃温度下，培养5～7d后，在离心分离机中离心分离8～10min，取上清液，即得到拮抗
放线菌；
11.s3、拮抗地衣芽孢杆菌制备：将地衣芽孢杆菌接种到小米浸液培养基上，在25～32℃温度下，在摇床中振荡培养2～3d，过滤后，取滤液作为地衣芽孢杆菌发酵液，将根腐病菌按照1:(180～220)的质量比加入到地衣芽孢杆菌发酵液中，并混合均匀后，倒入到铺有拮抗菌培养基的培养皿上，在25～32℃温度下，培养5～7d后，在离心分离机中离心分离8～10min，取上清液，即得到拮抗地衣芽孢杆菌；
12.s4、拮抗木霉菌制备：将木霉菌接种到小米浸液培养基上，在28～35℃温度下，在摇床中振荡培养2～3d，过滤后，取滤液作为木霉菌发酵液，将根腐病菌按照1:(180～220)的质量比加入到木霉菌发酵液中，并混合均匀后，倒入到铺有拮抗菌培养基的培养皿上，在28～35℃温度下，培养5～7d后，在离心分离机中离心分离8～10min，取上清液，即得到拮抗木霉菌；
13.s5、混合冻干：取25～30份拮抗枯草芽孢杆菌、8～10份拮抗放线菌、8～10份拮抗地衣芽孢杆菌、15～20份拮抗木霉菌和3～4份活性保护剂，并均匀混合，在-20℃冰箱中预冷12h，再放到真空冷冻干燥机上冷冻24h；包装后低温保存即可。
14.作为本发明再进一步的方案：所述小米浸液培养基按重量份组成如下：
15.8～10份小米糊、4～6份麦芽粉、1～1.5份蛋白胨、18～20份乳糖、4～5份氯化钠、5～6份碳酸钙、0.4～0.6份谷氨酸钠、0.15～0.2份硫酸锌、800～1000份蒸馏水。
16.作为本发明再进一步的方案：所述小米浸液培养基的制备方法如下：
17.s211、取8～10份小米糊小米加水煮沸30min，使其充分糊化；
18.s12、冷却至55
±
2℃时加入4～6份麦芽粉，搅搅拌均匀，在55
±
2℃条件下，保温糖化50min，然后再加热至105
±
2℃，保持5min后加入800～1000份蒸馏水，并搅拌；
19.s13、冷却至室温后，依次加入1～1.5份蛋白胨、18～20份乳糖、4～5份氯化钠、5～6份碳酸钙、0.4～0.6份谷氨酸钠和0.15～0.2份硫酸锌，并搅拌均匀即可。
20.作为本发明再进一步的方案：所述拮抗菌培养基按重量份组成如下：
21.1～1.5份牛肉膏、4～5份蛋白胨、2～2.5份氯化钠、15～20份琼脂、200～300份麦芽汁、600～800份蒸馏水。
22.作为本发明再进一步的方案：在所述s1、s2、s3和s4中，摇床的转速均为160～200rpm，离心分离机的转速均为8500～9500rpm。
23.作为本发明再进一步的方案：在所述s5中，真空冷冻干燥机的真空度为0.006～0.008mbar、干燥温度为-55～-50℃，低温保存的温度为0～4℃。
24.与现有技术相比，本发明的有益效果：
25.本发明中生物菌剂的由拮抗枯草芽孢杆菌、拮抗放线菌、拮抗地衣芽孢杆菌、拮抗木霉菌以及活性保护剂组成，用于容易滋生根腐病的田地里，定植黄芪幼苗时，随肥料一起点施在黄芪幼苗的根部，可以大大减轻黄芪的病情指数，对黄芪根腐病的防治效果优异；提高黄芪的产量和品质。
具体实施方式
26.实施例一
27.本发明实施例中，一种防治黄芪根腐病的生物菌剂，包括按重量份组成如下：
28.25份拮抗枯草芽孢杆菌、8份拮抗放线菌、8份拮抗地衣芽孢杆菌、15份拮抗木霉菌以及3份活性保护剂；所述活性保护剂由抗坏血酸钠、海藻糖、脱脂乳粉、蔗糖组成，其质量比为1.5：4：7：3.5。
29.一种防治黄芪根腐病的生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：
30.s1、拮抗枯草芽孢杆菌制备：将枯草芽孢杆菌接种到小米浸液培养基上，在28℃温度下，在摇床中以160rpm的转速振荡培养3d，过滤后，取滤液作为枯草芽孢杆菌发酵液，将根腐病菌按照1:180的质量比加入到枯草芽孢杆菌发酵液中，并混合均匀后，倒入到铺有拮抗菌培养基的培养皿上，在28℃温度下，培养7d后，在离心分离机中以8500rpm的转速离心分离10min，取上清液，即得到拮抗枯草芽孢杆菌；其中小米浸液培养基按重量份组成如下：8份小米糊、4份麦芽粉、1份蛋白胨、18份乳糖、4份氯化钠、5份碳酸钙、0.4份谷氨酸钠、0.15份硫酸锌、800份蒸馏水；拮抗菌培养基按重量份组成如下：1份牛肉膏、4份蛋白胨、2份氯化钠、15份琼脂、200份麦芽汁、600份蒸馏水；
31.s2、拮抗放线菌制备：将放线菌接入到小米浸液培养基上，在25℃温度下，在摇床中以160rpm的转速振荡培养3d，过滤后，取滤液作为放线菌发酵液，将根腐病菌按照1:180的质量比加入到放线菌发酵液中，并混合均匀后，倒入到铺有拮抗菌培养基的培养皿上，在25℃温度下，培养7d后，在离心分离机中以8500rpm的转速离心分离10min，取上清液，即得到拮抗放线菌；
32.s3、拮抗地衣芽孢杆菌制备：将地衣芽孢杆菌接种到小米浸液培养基上，在25℃温度下，在摇床中以160rpm的转速振荡培养3d，过滤后，取滤液作为地衣芽孢杆菌发酵液，将根腐病菌按照1:180的质量比加入到地衣芽孢杆菌发酵液中，并混合均匀后，倒入到铺有拮抗菌培养基的培养皿上，在25℃温度下，培养7d后，在离心分离机中以8500rpm的转速离心分离10min，取上清液，即得到拮抗地衣芽孢杆菌；
33.s4、拮抗木霉菌制备：将木霉菌接种到小米浸液培养基上，在28℃温度下，在摇床中以160rpm的转速振荡培养3d，过滤后，取滤液作为木霉菌发酵液，将根腐病菌按照1:180的质量比加入到木霉菌发酵液中，并混合均匀后，倒入到铺有拮抗菌培养基的培养皿上，在28℃温度下，培养7d后，在离心分离机中以8500rpm的转速离心分离10min，取上清液，即得到拮抗木霉菌；
34.s5、混合冻干：取25份拮抗枯草芽孢杆菌、8份拮抗放线菌、8份拮抗地衣芽孢杆菌、15份拮抗木霉菌和3份活性保护剂，并均匀混合，在-20℃冰箱中预冷12h，再放到真空冷冻干燥机上，在真空度为0.006mbar、干燥温度为-55℃下，冷冻24h；包装后0℃下低温保存即可。
35.实施例二
36.本发明实施例中，一种防治黄芪根腐病的生物菌剂，包括按重量份组成如下：
37.30份拮抗枯草芽孢杆菌、10份拮抗放线菌、10份拮抗地衣芽孢杆菌、20份拮抗木霉菌以及4份活性保护剂；所述活性保护剂由抗坏血酸钠、海藻糖、脱脂乳粉、蔗糖组成，其质量比为2：5：8：4。
38.一种防治黄芪根腐病的生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：
39.s1、拮抗枯草芽孢杆菌制备：将枯草芽孢杆菌接种到小米浸液培养基上，在37℃温度下，在摇床中以200rpm的转速振荡培养2d，过滤后，取滤液作为枯草芽孢杆菌发酵液，将
根腐病菌按照1:220的质量比加入到枯草芽孢杆菌发酵液中，并混合均匀后，倒入到铺有拮抗菌培养基的培养皿上，在37℃温度下，培养5d后，在离心分离机中以9500rpm的转速离心分离8min，取上清液，即得到拮抗枯草芽孢杆菌；其中小米浸液培养基按重量份组成如下：10份小米糊、6份麦芽粉、1.5份蛋白胨、20份乳糖、5份氯化钠、6份碳酸钙、0.6份谷氨酸钠、0.2份硫酸锌、1000份蒸馏水；拮抗菌培养基按重量份组成如下：1.5份牛肉膏、5份蛋白胨、2.5份氯化钠、20份琼脂、300份麦芽汁、800份蒸馏水；
40.s2、拮抗放线菌制备：将放线菌接入到小米浸液培养基上，在30℃温度下，在摇床中以200rpm的转速振荡培养2d，过滤后，取滤液作为放线菌发酵液，将根腐病菌按照1:220的质量比加入到放线菌发酵液中，并混合均匀后，倒入到铺有拮抗菌培养基的培养皿上，在30℃温度下，培养5d后，在离心分离机中以9500rpm的转速离心分离8min，取上清液，即得到拮抗放线菌；
41.s3、拮抗地衣芽孢杆菌制备：将地衣芽孢杆菌接种到小米浸液培养基上，在32℃温度下，在摇床中以200rpm的转速振荡培养2d，过滤后，取滤液作为地衣芽孢杆菌发酵液，将根腐病菌按照1:220的质量比加入到地衣芽孢杆菌发酵液中，并混合均匀后，倒入到铺有拮抗菌培养基的培养皿上，在32℃温度下，培养5d后，在离心分离机中以9500rpm的转速离心分离8min，取上清液，即得到拮抗地衣芽孢杆菌；
42.s4、拮抗木霉菌制备：将木霉菌接种到小米浸液培养基上，在35℃温度下，在摇床中以200rpm的转速振荡培养2d，过滤后，取滤液作为木霉菌发酵液，将根腐病菌按照1:220的质量比加入到木霉菌发酵液中，并混合均匀后，倒入到铺有拮抗菌培养基的培养皿上，在35℃温度下，培养5d后，在离心分离机中以9500rpm的转速离心分离8min，取上清液，即得到拮抗木霉菌；
43.s5、混合冻干：取30份拮抗枯草芽孢杆菌、10份拮抗放线菌、10份拮抗地衣芽孢杆菌、20份拮抗木霉菌和4份活性保护剂，并均匀混合，在-20℃冰箱中预冷12h，再放到真空冷冻干燥机上，在真空度为0.008mbar、干燥温度为-50℃下，冷冻24h；包装后4℃下低温保存即可。
44.为了更好地说明本发明的技术效果，通过下述试验进行阐述：
45.选用中国专利公开的一种防治黄芪根腐病的复合菌群及其应用(公开日：2022-12-23，cn113913320b)作为对比例一；选用中国专利公开的一种复合微生物菌剂与利用复合微生物菌剂防治根腐病的方法(公开日：2023-02-24，cn115710562a)作为对比例二；
46.在一块含有根腐病菌的试验田中划分5个小区，小区试验面积为10m2，每个小区播种160粒黄芪种子；在4个小区内分别施加实施例一、实施例二、对比例一和对比例二的生物菌剂的拌和黄芪种子，再进行播种，播种后立即覆土，以防止生物菌剂长时间暴露在阳光下，导致其活性降低或失去活性；另一个小区作为对照例，不采取生物菌剂处理；其他管理同常规播种。
47.待黄芪成熟后，将5个小区内黄芪挖出，每个小区内随机抽取100株，观察生长情况和根腐病发病情况；其中，(1)、生长情况包括每个小区内黄芪的平均根长、根粗、鲜重和株高，并记录到下表1中。
48.(2)、根腐病发病情况包括每个小区内黄芪的病情指数及防治效果；其中，并记录到下表2中；
49.病情指数＝(∑各级病株总数
×
相应病级数)/(调查总株数
×
最高病级数)
×
100；
50.防治效果(％)＝(对照小区病情指数―防治后小区病情指数)/对照小区病情指数
×
100；
51.病级分为0～ⅳ级，具体分级标准如下，0级:无病斑，ⅰ级:1～2个病斑，ⅱ级:3～5个病斑3～5，ⅲ级:6～10个病斑；ⅳ级:10个以上病斑。
52.表1黄芪生长情况分析表
[0053][0054]
从上表1可以得出：实施例一、实施例二、对比例一和对比例二中黄芪的根长、根粗、鲜重和株高均显著优于对照例；同时实施例一、实施例二中黄芪的根长、根粗、鲜重和株高均优于对比例一和对比例二；进而可以得出：本发明制备的生物菌剂用在容易发生根腐病的田地里，可以提高黄芪的产量和品质。
[0055]
表2黄芪根腐病发病情况分析表
[0056][0057][0058]
从上表2可以得出：实施例一、实施例二、对比例一和对比例二对黄芪根腐病均具有一定的防治效果，其中对比例一和对比例二对黄芪根腐病的防治效果在30％左右，而实施例一、实施例二对黄芪根腐病的防治效果均超过50％；进而可以得出：本发明制备的生物菌剂可以大大减轻黄芪的病情指数，对黄芪根腐病的防治效果优异。
[0059]
以上所述的，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种防治黄芪根腐病的生物菌剂，其特征在于，包括按重量份组成如下：25～30份拮抗枯草芽孢杆菌、8～10份拮抗放线菌、8～10份拮抗地衣芽孢杆菌、15～20份拮抗木霉菌以及3～4份活性保护剂；所述活性保护剂由抗坏血酸钠、海藻糖、脱脂乳粉、蔗糖组成，其质量比为(1.5～2)：(4～5)：(7～8)：(3.5～4)。2.一种实现权利要求1所述的防治黄芪根腐病的生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：s1、拮抗枯草芽孢杆菌制备：将枯草芽孢杆菌接种到小米浸液培养基上，在28～37℃温度下，在摇床中振荡培养2～3d，过滤后，取滤液作为枯草芽孢杆菌发酵液，将根腐病菌按照1:(180～220)的质量比加入到枯草芽孢杆菌发酵液中，并混合均匀后，倒入到铺有拮抗菌培养基的培养皿上，在28～37℃温度下，培养5～7d后，在离心分离机中离心分离8～10min，取上清液，即得到拮抗枯草芽孢杆菌；s2、拮抗放线菌制备：将放线菌接入到小米浸液培养基上，在25～30℃温度下，在摇床中振荡培养2～3d，过滤后，取滤液作为放线菌发酵液，将根腐病菌按照1:(180～220)的质量比加入到放线菌发酵液中，并混合均匀后，倒入到铺有拮抗菌培养基的培养皿上，在25～30℃温度下，培养5～7d后，在离心分离机中离心分离8～10min，取上清液，即得到拮抗放线菌；s3、拮抗地衣芽孢杆菌制备：将地衣芽孢杆菌接种到小米浸液培养基上，在25～32℃温度下，在摇床中振荡培养2～3d，过滤后，取滤液作为地衣芽孢杆菌发酵液，将根腐病菌按照1:(180～220)的质量比加入到地衣芽孢杆菌发酵液中，并混合均匀后，倒入到铺有拮抗菌培养基的培养皿上，在25～32℃温度下，培养5～7d后，在离心分离机中离心分离8～10min，取上清液，即得到拮抗地衣芽孢杆菌；s4、拮抗木霉菌制备：将木霉菌接种到小米浸液培养基上，在28～35℃温度下，在摇床中振荡培养2～3d，过滤后，取滤液作为木霉菌发酵液，将根腐病菌按照1:(180～220)的质量比加入到木霉菌发酵液中，并混合均匀后，倒入到铺有拮抗菌培养基的培养皿上，在28～35℃温度下，培养5～7d后，在离心分离机中离心分离8～10min，取上清液，即得到拮抗木霉菌；s5、混合冻干：取25～30份拮抗枯草芽孢杆菌、8～10份拮抗放线菌、8～10份拮抗地衣芽孢杆菌、15～20份拮抗木霉菌和3～4份活性保护剂，并均匀混合，在-20℃冰箱中预冷12h，再放到真空冷冻干燥机上冷冻24h；包装后低温保存即可。3.根据权利要求2所述的一种防治黄芪根腐病的生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述小米浸液培养基按重量份组成如下：8～10份小米糊、4～6份麦芽粉、1～1.5份蛋白胨、18～20份乳糖、4～5份氯化钠、5～6份碳酸钙、0.4～0.6份谷氨酸钠、0.15～0.2份硫酸锌、800～1000份蒸馏水。4.根据权利要求3所述的一种防治黄芪根腐病的生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述小米浸液培养基的制备方法如下：s211、取8～10份小米糊小米加水煮沸30min，使其充分糊化；s12、冷却至55
±
2℃时加入4～6份麦芽粉，搅搅拌均匀，在55
±
2℃条件下，保温糖化50min，然后再加热至105
±
2℃，保持5min后加入800～1000份蒸馏水，并搅拌；
s13、冷却至室温后，依次加入1～1.5份蛋白胨、18～20份乳糖、4～5份氯化钠、5～6份碳酸钙、0.4～0.6份谷氨酸钠和0.15～0.2份硫酸锌，并搅拌均匀即可。5.根据权利要求2所述的一种防治黄芪根腐病的生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述拮抗菌培养基按重量份组成如下：1～1.5份牛肉膏、4～5份蛋白胨、2～2.5份氯化钠、15～20份琼脂、200～300份麦芽汁、600～800份蒸馏水。6.根据权利要求2所述的一种防治黄芪根腐病的生物菌剂的制备方法，其特征在于，在所述s1、s2、s3和s4中，摇床的转速均为160～200rpm，离心分离机的转速均为8500～9500rpm。7.根据权利要求2所述的一种防治黄芪根腐病的生物菌剂的制备方法，其特征在于，在所述s5中，真空冷冻干燥机的真空度为0.006～0.008mbar、干燥温度为-55～-50℃，低温保存的温度为0～4℃。

技术总结
本发明涉及黄芪根腐病防治技术领域，公开了一种防治黄芪根腐病的生物菌剂，由拮抗枯草芽孢杆菌、拮抗放线菌、拮抗地衣芽孢杆菌、拮抗木霉菌以及活性保护剂制备而成；其中活性保护剂由抗坏血酸钠、海藻糖、脱脂乳粉、蔗糖组成。还公开了一种防治黄芪根腐病的生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：S1、拮抗枯草芽孢杆菌制备：S2、拮抗放线菌制备；S3、拮抗地衣芽孢杆菌制备；S4、拮抗木霉菌制备；S5、混合冻干。本发明制备的生物菌剂用于容易滋生根腐病的田地里，使用本生物菌剂拌和黄芪种子，再进行播种，可以大大减轻黄芪的病情指数，对黄芪根腐病的防治效果优异；提高黄芪的产量和品质。提高黄芪的产量和品质。


技术研发人员：陈孟龙 陈振华 孙国强 曹月娥 马振国 张婷婷 齐欢欢 王立会
受保护的技术使用者：上药（宁夏）中药资源有限公司
技术研发日：2023.04.22
技术公布日：2023/7/13