一种沙门氏菌毒力基因及其应用

1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种沙门氏菌毒力基因及其应用。


背景技术：

2.沙门氏菌(salmonella)是人畜共患病和公共卫生学研究领域公认的严重危害养殖业和公众健康的食源性病原菌，目前已有2600多种血清型被发现，众多的血清型均可导致各种动物及人感染，感染严重者还能致其死亡。
3.沙门氏菌的致病能力取决于细菌的致病力和宿主的易感性。沙门氏菌携带有涉及粘附、侵入、细胞内存活、繁殖等的各种各样致病毒力因子，包括：毒力岛毒力因子、质粒毒力因子、结构性毒力因子(包括菌毛和鞭毛)、肠毒素毒力因子等。这些毒力因子的存在与细菌的毒力及致病性密切相关。其中，沙门氏菌毒力岛是(salmonella pathogenicity island，spi))一段含有毒力相关基因的、不稳定的位于染色体上的dna片段。目前为止已经发现24个spi，研究最广的为spi-1-spi-6以及spi-19，其参与沙门氏菌在宿主细胞内存活、菌毛表达、镁和铁摄取、多重抗生素耐药性和全身感染发展等生理学过程。沙门氏菌毒力质粒广泛存在于临床重要血清型沙门氏菌中，含有spvrabcd 5个基因，主要与血清抗性、黏附与定居、沙门氏菌在肠外组织细胞以及巨噬细胞内存活和生长等有关。
4.目前对于肠炎沙门氏菌侵袭相关毒力基因的研究主要集中在spi-1和鞭毛基因等。随着肠炎沙门氏菌耐药性不断增强、耐药谱变宽，侵染性感染发病率和死亡率呈上升趋势，由于侵染性感染具有发病隐匿、临床表现不明显、病死率高等特点，给临床治疗和合理用药带来了极大挑战。因此，对沙门氏菌新的毒力因子的鉴定，对于理解细菌的致病机制，寻找潜在治疗靶点，减毒疫苗的研发都具有重要意义。


技术实现要素：

5.针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种沙门氏菌毒力基因及其应用。
6.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
7.本发明的第一方面，提供基因stm14_1706作为毒力基因在调控沙门氏菌致病力中的应用；
8.所述基因stm14_1706的核苷酸序列如seq id no.1所示。
9.本发明的第二方面，提供基因stm14_1706作为毒力基因在制备沙门氏菌减毒疫苗中的应用；
10.所述基因stm14_1706的核苷酸序列如seq id no.1所示。
11.本发明的第三方面，提供基因stm14_1706编码的蛋白在调控沙门氏菌致病力中的应用。
12.上述应用中，所述基因stm14_1706编码的蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示。
13.本发明的第四方面，提供一种沙门氏菌减毒疫苗，所述沙门氏菌减毒疫苗是将沙门氏菌基因组内的基因stm14_1706缺失。
14.本发明的第五方面，提供一种降低沙门氏菌致病力的方法，包括以下步骤：
15.将沙门氏菌基因组内的基因stm14_1706缺失。
16.上述方法中，可以采用基于自杀性质粒的同源重组技术、crispr-cas9基因编辑技术、vigs技术、t-dna插入或rna干涉技术等将基因stm14_1706缺失或沉默。
17.本发明的有益效果：
18.本发明首次研究发现，stm14_1706基因是沙门氏菌中重要的毒力因子，它会促进沙门氏菌在宿主体内的增殖；将stm14_1706基因缺失，能够使沙门氏菌的致病力显著降低。本发明丰富了对沙门氏菌毒力因子的认识，为减毒疫苗以及疫苗载体的研发提供了重要策略；也为治疗沙门氏菌的感染提供了潜在的治疗靶点。
附图说明
19.图1：以同源重组为基础构建沙门氏菌基因缺失株δstm14_1706的原理示意图。
20.图2：pcr筛选基因缺失株结果；图中，画圈的泳道代表的是基因缺失株。
21.图3：沙门氏菌的体外lb中生长曲线的测定。
22.图4：沙门氏菌δstm14_1706株和野生株在raw264.7 cell中的增殖情况。
23.图5：沙门氏菌在小鼠肝脏(a)和脾脏(b)中的载量变化。
24.图6：感染沙门氏菌野生株和基因缺失株δstm14_1706后小鼠的精神状态。
25.图7：感染沙门氏菌野生株和基因缺失株δstm14_1706后小鼠存活曲线。
26.图8：感染沙门氏菌野生株和基因缺失株δstm14_1706后小鼠的肝脏形态。
27.图9：感染沙门氏菌野生株和基因缺失株δstm14_1706后小鼠肝脏病理学切片。
28.图10：感染沙门氏菌野生株和基因缺失株δstm14_1706后小鼠的脾脏形态。
29.图11：感染沙门氏菌野生株和基因缺失株δstm14_1706后小鼠脾脏病理学切片。
30.图12：沙门氏菌诱导的小鼠肝脏脾脏中相关细胞因子的表达情况。
具体实施方式
31.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本技术提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本技术所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
32.如前所述，沙门氏菌是一种重要的人畜共患革兰氏阴性菌，威胁人类健康，每年给畜禽养殖业带来巨大的危害。沙门氏菌的致病性源于它的致病毒力因子，对沙门氏菌的毒力因子的鉴定，对于理解细菌的致病机制，寻找潜在治疗靶点，减毒疫苗的研发都具有重要意义。
33.基于此，本发明对沙门氏菌的致病毒力因子进行了深入研究，其中，前期基于转录组学的筛选，筛选到沙门氏菌在感染宿主后表达量显著上升的一个沙门氏菌三型分泌系统t3ss-ii编码的基因stm14_1706，提示可能是沙门氏菌感染宿主时发挥重要作用的毒力因子。
34.基因stm14_1706所在基因组为salmonella enterica subsp.enterica serovar typhimurium str.14028s，genbank:cp001363.1
35.stm14_1706在基因组的位置为1501020-1501568bp，共包含549个核苷酸，核苷酸
subsp.enterica serovar typhimurium str.14028s)设计，其全序列可由genbank下载，编号为cp001363.1。所设计的pcr扩增引物的序列具体如下：
[0045][0046][0047]
实施例1：stm14_1706基因缺失株的构建与筛选
[0048]
本发明利用自杀性质粒pre112，基于同源重组原理(图1)构建stm14_1706基因缺失株。具体过程如下：
[0049]
1、细菌的活化：
[0050]
从-80℃冰箱取出用甘油保存的菌株，用接种环小心蘸取少许冻存液在相应抗生素的固体培养基上划线，将划线后的培养基倒置于37℃恒温培养箱过夜培养(约8-12h)。次日可用无菌白枪头挑取活化好的菌落，转接于相应的液体培养基中，在恒温摇床(37℃，220rpm)振荡培养，备用。
[0051]
2、重组自杀性质粒的构建：
[0052]
以pbluescript ii sk(+)为模板，使用pblue-gj-u/l将pblue载体扩增使之线性化，以pre112质粒为模板，用pre112-gj-u/l将pre112载体线性化；以鼠伤寒沙门氏菌atcc14028株基因组为模板，分别用stm14_1706-f-u/l，stm14_1706-r-u/l扩增出stm14_1706基因上游和下游片段f和r，将f，r和线性化载体用同源重组试剂盒连接，转化escherichia coli top10感受态细胞，筛选阳性克隆，获取重组质粒pblue-δstm14_1706；以质粒pblue-δstm14_1706为模板，用stm14_1706-f-u和stm14_1706-r-l扩增出δstm14_1706片段，然后用同源重组试剂盒将δstm14_1706和线性化pre112载体连接，转化大肠杆菌χ7232，筛选鉴定阳性克隆，获取重组自杀性质粒pre112-δstm14_1706。
[0053]
3、stm14_1706基因缺失株的构建：
[0054]
(1)将重组自杀性质粒pre112-δstm14_1706转化进菌株χ7213，筛选鉴定得到供体菌株χ7213-pre112-δstm14_1706。
[0055]
(2)将χ7213-pre112-δstm14_1706接种于5ml液体lb(cm
+
,25μg/ml；二氨基庚二酸(dap)，50μg/ml)，将s.typhimurium(atcc 14028)接种于5ml无抗性液体lb，37℃，220rpm的恒温水平摇床中培养过夜。
[0056]
(3)取1mlχ7213-pre112-δstm14_1706菌液，5000rpm离心5min，弃上清，向菌体沉淀中加入500μl s.typhimurium，混匀后滴于lb(dap,50μg/ml)固体培养基，缓慢摇匀菌液，小心平放于37℃培养箱，静置培养，确保形成菌苔便于质粒的接合转移。
[0057]
(4)用接种环挑取菌落，小心划线接种到xld(cm
+
,25μg/ml)固体培养基，37℃培养箱培养12h-24h。
[0058]
(5)接种环挑取黑色单菌落，划线接种到lb(cm
+
,25μg/ml)固体培养基，将固体培养基倒置放在37℃培养箱中培养大约12h。
[0059]
(6)用无菌白枪头挑取单克隆若干，分别接种于含有1ml无抗液体lb的ep管中，在条件为37℃，220rpm的水平摇床中培养大约3-4h，直到菌液微混(od
600
约为0.3-0.4)。
[0060]
(7)梯度稀释10
2-103倍，取100μl涂布于lb(含5％蔗糖，无nacl)固体培养基，室温平放静置培养24h-48h。
[0061]
(8)将单克隆同时patch在lb和lb(cm
+
,25μg/ml)固体培养基，将培养基倒置放于37℃培养箱中培养10h-12h，挑选lb固体培养基上生长而lb(cm
+
，25μg/ml)固体培养基上不生长的菌落，以check-14_1706-u/l为引物进行pcr鉴定。纯化3-5次后，再次pcr鉴定，pcr产物送至上海生工生物工程有限公司进行测序，测序结果与genbank中的公布的s.typhimurium的基因序列进行比对、分析。
[0062]
pcr鉴定结果如图2所示，结果显示：本实施例成功筛选到了基因缺失株。进一步经过测序鉴定，成功构建了沙门氏菌基因缺失株δstm14_1706。
[0063]
实施例2：stm14_1706基因缺失株增殖能力鉴定
[0064]
1、体外生长测定：
[0065]
在超净台中，用无菌白枪头分别挑取s.typhimurium(atcc 14028)野生型菌株和实施例1构建的沙门氏菌基因缺失株δstm14_1706的单菌落，接种于含有lb液体培养基的ep管，在条件为37℃，220rpm的水平摇床中培养过夜，次日，分别将菌液按照1:100转接到50ml lb液体培养基的摇瓶中。将恒温摇床的条件设置为37℃，220rpm进行振摇培养，不同的时间点取样，用紫外分光光度计测od
600
，直至细菌生长至平台期，并绘制生长曲线。
[0066]
结果如图3所示，结果表明：野生型沙门氏菌和stm14_1706缺失株在lb中生长无显著的差异。
[0067]
2、巨噬细胞胞内增殖测定：
[0068]
分别挑取s.typhimurium(atcc 14028)野生型菌株和实施例1构建的沙门氏菌基因缺失株δstm14_1706的单菌落，接种于含有lb液体培养基的ep管，在条件为37℃，220rpm的水平摇床中培养过夜，将过夜培养的菌液按照1：100转接到新鲜的lb培养基，直至od
600
约为1.0。将细菌用以10的moi加入raw264.7细胞单层。将细胞板以1000rpm的转速离心5min，在温度设为37℃的5％co2恒温细胞培养箱中孵育30min后，将感染的细胞用pbs溶液洗涤3次，随后加入含有100μg/ml庆大霉素的dmem培养基温育1h，然后pbs洗涤3次，在剩余时间内用含有10μg/ml庆大霉素的培养基继续孵育。感染后的2h和20h，分别弃掉培养基，每孔用预冷的pbs溶液洗涤3次，用0.1％triton x-100裂解细胞。将裂解液的10倍比连续稀释液涂布
在lb琼脂上，以计算细胞内的菌量。将感染20h的细胞内细菌数目除以2h的细菌数目，从而计算细菌在巨噬细胞内复制的倍数。各组进行至少三次独立的生物学重复。
[0069]
通过平板计数法测定了沙门氏菌野生株(wt)和δstm14_1706在raw264.7细胞中的增殖能力，结果如图4所示，在2hpi-20hpi之间，沙门氏菌δstm14_1706株的增殖倍数显著低于野生株的增殖倍数(p《0.001)，表明stm14_1706对沙门氏菌在巨噬细胞内的增殖具有重要促进作用。
[0070]
3、脏器内增殖测定：
[0071]
分别挑取s.typhimurium(atcc 14028)野生型菌株和实施例1构建的沙门氏菌基因缺失株δstm14_1706的单菌落，接种于lb液体培养基中，在37℃、220rpm的条件下培养至od
600
约为1.0，通过涂板计数，调整菌落个数为5
×
103cfu/ml，各组按照200μl/只的剂量腹腔注射balb/c小鼠20只，每隔24h后剖杀5只，取脾脏、肝脏称重，用0.1％triton x-100定容至1ml，60hz研磨3min，用pbs倍比稀释，涂板计数(按比例计算出每克组织的载菌量)。
[0072]
通过测定沙门氏菌野生株和δstm14_1706在小鼠肝脏、脾脏中的载菌量变化以确定细菌在体内的增殖情况。细菌在肝脏和脾脏中的载菌量变化曲线如图5a和5b所示，可以得出，在感染细菌24hpi，野生株和δstm14_1706在肝脏和脾脏中的载量无明显差别，从2dpi开始，δstm14_1706在肝脏和脾脏中的载量显著低于野生株(p《0.001)，且δstm14_1706增殖速率显著低于野生株。表明stm14_1706对沙门氏菌在动物体内的增殖具有重要促进作用。
[0073]
实施例3：stm14_1706基因缺失株对小鼠致病力的鉴定
[0074]
1、致死性试验：
[0075]
分别挑取s.typhimurium野生型菌株和stm14_1706缺失株的单菌落，转于lb液体培养基中在37℃，220rpm的条件下培养细菌至od
600
约为1.0；随后通过倍比稀释以及涂板计数的方法，调整菌落个数为5
×
103cfu/ml，各组按照200μl/只的剂量腹腔注射balb/c小鼠6只，用无菌的pbs溶液作为阴性对照，每天观察小鼠的状态并记录小鼠的死亡情况，然后绘制致死曲线。
[0076]
感染沙门氏菌后小鼠的精神状态如图6所示；小鼠的存活曲线如图7所示。结果表明，在感染了1000cfu/只剂量野生菌株之后，在第三天开始出现被毛矗立，精神沉郁，行动迟缓，寒颤，食欲不振，第5天开始出现死亡，第7天全部死亡；在感染相同剂量的δstm14_1706细菌之后，小鼠精神状态正常，行动饮食情况也并未出现异常，在观察的16天内未发生死亡。表明δstm14_1706株对小鼠毒力显著降低(p《0.001)。
[0077]
2、脏器组织病理学检测和脏器细胞因子表达水平检测：
[0078]
分别挑取s.typhimurium野生型菌株和stm14_1706缺失株的单菌落，转于lb液体培养基中在37℃，220rpm的条件下培养细菌至od
600
约为1.0；随后通过倍比稀释以及涂板计数的方法，调整菌落个数为5
×
103cfu/ml，各组按照200μl/只的剂量腹腔注射balb/c小鼠，用无菌的pbs溶液作为阴性对照。
[0079]
感染细菌4天后，取小鼠肝脏、脾脏于4％甲醛内固定24h以上。经过脱水、包埋、切片和he染色后制备成组织病理学切片，显微镜下进行观察。
[0080]
感染细菌4天后，取小鼠肝脏、脾脏提取总rna，rna经过反转录后，用qpcr鉴定il-1b、il-6、il-12b和tnf的mrna表达水平。以gapdh作为内参。
[0081]
我们对肝脏的形态以及组织病理学进行了检测分析，肝脏形态学表明，野生沙门氏菌感染后，肝脏发生了肉眼可见的明显的变性，而感染了δstm14_1706缺失株，肝脏肉眼未见明显的病变(图8)。病理学切片观察显示，阴性对照的肝细胞索排列整齐，肝细胞未见异常病变(图9a)；感染s.typhimurium野生型的肝细胞严重颗粒变性，肝细胞局部坏死，巨噬细胞浸润增生(图9b、c)；感染stm14_1706缺失株的肝细胞颗粒变性，肿胀，有些区域肝细胞未见明显病变(图9d)，肝细胞颗粒变性，肿胀，有的肝细胞核变淡或消失(图9e)。上述结果表明：感染了野生沙门氏菌，肝脏发生严重的颗粒变性，肝细胞局灶性坏死，巨噬细胞浸润增生，感染了δstm14_1706缺失株组，肝脏发生明显的颗粒变性。
[0082]
我们对脾脏的形态以及组织病理学进行了检测分析，脾脏形态学表明，野生沙门氏菌感染后，肝脏发生了肉眼可见的明显的充血肿大，而感染了δstm14_1706缺失株，脾脏肉眼未见明显的病变(图10)。病理学切片观察显示，阴性对照的脾脏白髓结构清晰，红髓轻度充血，未见异常病变(图11a)；感染s.typhimurium野生型的脾脏严重充血、出血，淋巴细胞坏死(图11b)，脾脏充血、出血，淋巴细胞弥漫性坏死，巨噬细胞浸润(图11c)，脾脏充血、出血，淋巴细胞局灶性坏死(图11d)；感染stm14_1706缺失株的脾脏充血、出血，并见少量淋巴细胞坏死(图11e、f)。上述结果表明：感染野生沙门氏菌后，脾脏发生充血、出血，淋巴细胞弥漫性或局灶性坏死，巨噬细胞浸润，感染δstm14_1706缺失株后，脾脏发生充血、出血病变，并见少量淋巴细胞坏死。
[0083]
我们采取qpcr的方法检测野生沙门氏菌和δstm14_1706缺失株感染后，小鼠肝脏脾脏中的相关细胞因子的表达水平。结果表明，δstm14_1706诱导肝脾中炎症因子表达量较野生株低，其中il-1b，il-6表达水平相较于野生株组显著降低(图12)。
[0084]
综上所述，基因stm14_1706缺失之后，沙门氏菌对小鼠的毒力显著降低，在一定量内并不能对小鼠致死，但保留一定的致病力。主要肝脾免疫器官的病变程度明显减轻，免疫器官相关的细胞因子表达水平显著降低。体内实验表明，stm14_1706缺失株在肝脾中的增殖能力显著降低，体外增殖实验表明缺失株在细胞内增殖能力显著降低。
[0085]
基于以上结果可以得出，stm14_1706基因是沙门氏菌中重要的毒力因子，它会促进沙门氏菌在宿主体内的增殖。
[0086]
以上所述仅为本技术的优选实施例而已，并不用于限制本技术，对于本领域的技术人员来说，本技术可以有各种更改和变化。凡在本技术的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本技术的保护范围之内。

技术特征：
1.基因stm14_1706作为毒力基因在调控沙门氏菌致病力中的应用；所述基因stm14_1706的核苷酸序列如seq id no.1所示。2.基因stm14_1706作为毒力基因在制备沙门氏菌减毒疫苗中的应用；所述基因stm14_1706的核苷酸序列如seq id no.1所示。3.基因stm14_1706编码的蛋白在调控沙门氏菌致病力中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述基因stm14_1706编码的蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示。5.一种沙门氏菌减毒疫苗，其特征在于，所述沙门氏菌减毒疫苗是将沙门氏菌基因组内的基因stm14_1706缺失。6.一种降低沙门氏菌致病力的方法，其特征在于，包括以下步骤：将沙门氏菌基因组内的基因stm14_1706缺失。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，采用基于自杀性质粒的同源重组技术将基因stm14_1706缺失。

技术总结
本发明公开了一种沙门氏菌毒力基因及其应用，属于生物技术领域。本发明首次研究发现，STM14_1706基因是沙门氏菌中重要的毒力因子，它会促进沙门氏菌在宿主体内的增殖；将STM14_1706基因缺失，能够使沙门氏菌的致病力显著降低。本发明丰富了对沙门氏菌毒力因子的认识，为减毒疫苗以及疫苗载体的研发提供了重要策略；也为治疗沙门氏菌的感染提供了潜在的治疗靶点。靶点。靶点。


技术研发人员：王方昆 刘聪 商营利
受保护的技术使用者：山东农业大学
技术研发日：2023.02.28
技术公布日：2023/7/13