一种用于芸薹属植物B基因组染色体特异识别检测的探针及其制备方法和应用

一种用于芸薹属植物b基因组染色体特异识别检测的探针及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明属于生物信息学与分子细胞遗传学领域，尤其涉及一种芸薹属植物b基因组染色体特异序列及其识别探针。


背景技术：

2.芸薹属是十字花科中非常具有经济价值的一个属，包含物种众多，如大白菜、小白菜、甘蓝等常见的蔬菜植物，油料作物如甘蓝型油菜、白菜型油菜和芥菜型油菜，以及其他用作调味品、饲料等用途的植物。芸薹属植物与人类生产、生活密切相关。从遗传组成上看，芸薹属包含6个栽培种，由三个二倍体基本种，白菜(b.rapa,aa,2n＝20)，甘蓝(b.oleracea,cc,2n＝18)，黑芥(b.nigra,bb,2n＝16)，以及由二倍体种间杂交后经自然加倍形成的三个异源四倍体种，即甘蓝型油菜(b.napus,aacc,2n＝38)，芥菜型油菜(b.juncea,aabb,2n＝36)和埃塞俄比亚芥(b.carinata,bbcc,2n＝34)。nagaharuu在1935年提出了用一个三角模型来描述这六个物种之间的遗传和染色体倍性关系，后人将它命名为“禹氏三角”。
3.在芸薹属植物中利用种间杂交进行远源杂交育种是获得新种质的一种有效途径。而荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,fish)技术是植物细胞遗传学常见的方法，通过构建不同的重复序列探针或者bac克隆探针可以对不同染色体进行区分和鉴定，可用于核型以及染色体进化分析。因此，开发不同亚基因组染色体特异识别探针，可以快速、准确的检测和跟踪染色体的行为与变化，在远源杂交育种工作中有重要应用。
4.着丝粒是真核生物染色体上必不可少的结构元件。其在功能上高度保守，在细胞分裂过程中对染色体形态的维持与准确配对、分离起到至关重要的作用。着丝粒染色质由dna缠绕在组蛋白上形成，与常规染色质不同的是，该区域的h3组蛋白被一种变异的组蛋白cenh3(哺乳动物称作cenp-a)替代。研究发现，这一变异组蛋白cnh3几乎存在于所有真核生物着丝粒区，已被认为是功能着丝粒区域的标记蛋白。因此，研究人员可以借助染色质免疫共沉淀技术(chromatinimmunoprecipitation,chip)，通过cenh3特异抗体来捕获着丝粒区dna序列。进一步结合高通量测序技术(chip-seq)可以在全基因组水平高效地分离着丝粒dna序列，目前已被广泛应用于着丝粒的研究中。真核生物着丝粒dna主要由串联重复序列、反转录转座子以及其他低拷贝序列组成，且表现出很高的变异性。研究表明，不同物种、乃至亲缘关系较近的种间着丝粒重复序列也可能存在很大差异。
5.本发明利用cenh3蛋白抗体进行chip-seq分析，获得了芸薹属植物黑芥的功能着丝粒区重复序列，进一步通过比较分析筛选出2条黑芥着丝粒特异重复序列。通过fish实验验证该序列确实定位于着丝粒区，在芸薹属6个栽培种的比较分析中，fish信号点仅出现在芸薹属植物b基因组染色体上。为了方便应用，本发明根据其序列开发了相应的引物，用于构建芸薹属植物b基因组染色体特异识别探针。该方法将为芸薹属植物染色体工程及远源杂交育种工作的开展提供有力的工具。


技术实现要素：

6.本发明的目在于提供一种用于芸薹属植物b基因组染色体特异识别检测的探针及其制备方法和应用，该探针的开发可以为芸薹属植物染色体工程以及远源杂交育种工作提供一种简便、高效的鉴定方法。
7.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种用于芸薹属植物b基因组染色体特异识别检测的探针，所述探针具有如seq id no.1或seq id no.2所示的核苷酸序列，所述探针为地高辛标记探针。
8.上述一种用于芸薹属植物b基因组染色体特异识别检测的探针的制备方法为：依据seq id no.1或seq id no.2所示的核苷酸序列设计pcr扩增引物，以黑芥基因组dna为模板，利用所设计的引物进行pcr扩增，pcr产物经纯化后采用缺口平移法进行地高辛标记，得到地高辛标记探针，即为用于芸薹属植物b基因组染色体特异识别检测的探针；其中，所述pcr扩增的反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸40s，30个循环；72℃终延伸10min。
9.其中，所述seq id no.1和seq id no.2所示核苷酸序列对应的pcr扩增引物如下所示：所述缺口平移法的反应体系为：1μg纯化pcr产物，50mm tris-hcl(ph7.5)，50mm mgcl2，0.05mm datp，0.05mm dctp，0.05mm dgtp，0.05mm dttp，0.05mm dig-dutp，0.1u/μl dna polymerase i(dna聚合酶i)，0.005u/μl dnase i(脱氧核糖核酸酶i)；所述缺口平移法的反应条件为：15℃反应1.5h后，加入1μl 0.5m ph8.0 edta或于65℃温浴10min以终止反应。
10.上述探针在芸薹属植物染色体工程和远源杂交育种中的应用，所述芸薹属植物为黑芥。
11.本发明的有益效果在于：1.根据功能着丝粒的定义，是否与cenh3蛋白结合是判定dna序列是否为功能着丝粒序列的核心条件。因此，以利用cenh3特异抗体的chip实验所获得的序列必将是来自功能着丝粒的dna序列。本发明采用chip-seq的方法获得序列确来自功能着丝粒区，fish实验也证明了该方法的有效性和序列的着丝粒定位。
12.2.来源于着丝粒区域的重复序列可以在染色体上产生明亮、清晰的fish信号，本发明公布的芸薹属b基因组染色体特异探针是根据着丝粒重复序列开发的，杂交信号相较于其他类型的探针更易观察，从而可以高效、准确地识别芸薹属b基因组染色体。
13.3.芸薹属物种中已报道的染色体特异探针多数为a、b、c三基因组共有序列，因此在芸薹属物种三套染色体上均能产生信号。目前，已公布的黑芥基因组着丝粒特异序列非
常少，因此针对b基因组特异的探针也非常少。本发明利用chip-seq结合生物信息学的方法筛选获得b基因组特异的着丝粒序列，根据该序列制备的探针仅在芸薹属b基因组染色体上产生信号，证明了该探针是特异的，该鉴定方法是有效的。
14.4.本发明公布探针来源于着丝粒重复序列，设计pcr因为特异性良好，可以扩增出单一的条带，pcr产物序列短，仅500bp左右，易于扩增和回收，操作简便。fish杂交结果表明本发明开发的探针可以在芸薹属植物b基因组(包含黑芥b基因组及异源四倍体b亚基因组)上产生明亮、专一的信号。
15.5.本发明公布的一种芸薹属植物b基因组染色体特异序列及其探针制备方法可用于进行芸薹属植物染色体遗传分析、种质资源鉴定等，可为染色体工程、远源杂交育种等工作的开展提供重要途径，操作简便、快捷。
附图说明
16.图1为本发明对黑芥着丝粒重复序列1(seq id no.1)和2(seq id no.2)的pcr扩增结果。
17.图2为本发明利用黑芥着丝粒重复序列1探针(seq id no.1)对不同芸薹属植物物种进行fish杂交的结果。
18.图3为本发明利用黑芥着丝粒重复序列2探针(seq id no.2)对不同芸薹属植物物种进行fish杂交的结果。
具体实施方式
19.下面结合附图将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以使本领域的技术人员能够更好的理解本发明的优点和特征，从而对本发明的保护范围做出更为清楚的界定。本发明所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
20.实施例1：chip-seq技术的实施chip-seq技术是一种将免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation,chip)与高通量测序相结合的技术方法，此处利用cenh3蛋白特异抗体免疫共沉淀功能着丝粒区染色质，然后提取dna片段并进行高通量测序。本发明所用chip-seq基本流程如下：1)取黑芥幼嫩叶片组织于液氮中研磨成粉末，并提取细胞核制备成悬浮液；2)向细胞核悬浮液中加入适量微球菌核酸酶裂解染色质；3)从裂解后的染色质溶液中取100μl作为内参(input)；剩余样品平均分成两份，一份加入免疫前血清(mock)，另一份加入芸薹属cenh3蛋白特异性抗体(chip)，4℃翻转杂交过夜。
21.4)向过夜杂交后的mock和chip样品中加入rproteina，继续4℃翻转杂交2～3h。
22.5)杂交后的样品经离心、清洗，去除非特异性结合。清洗步骤为：依次加入低盐、高盐等溶液，4000rpm离心1.5min，冰上静置1min，去除上清。
23.6)清洗完毕后，洗脱回收目标蛋白-dna蛋白复合物。洗脱步骤为：每管加入400μl的eb溶液，65℃金属浴15min，每5min混匀一次。
24.7)向洗脱得到的溶液中加入等体积酚氯仿，12000rpm离心8min，再经过乙醇沉淀，回收目标dna片段。
25.8)以上chip得到的dna片段经过末端修复、加测序接头后，经低循环数的pcr扩增构建测序文库。
26.9)利用illuminahiseq-2500测序仪进行测序。
27.10)测序后的数据经质控、序列拼接，获得重复序列contigs，即功能着丝粒序列。
28.11)进一步通过fish杂交实验，验证序列的着丝粒定位，以及在各个亚基因组染色体中的分布，从而筛选出两条黑芥基因组(即芸薹属植物b基因组)特异的着丝粒序列，其核酸序列如seq id no.1～2所示。
29.实施例2：引物设计与pcr扩增利用引物设计软件primer premier 5.0对seq id no.1～2所示的黑芥着丝粒特异序列进行引物设计。扩增seq id no.1所示黑芥着丝粒特异序列的引物为5
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gccatgtctcaacagaagca-3’，扩增seq id no.2所示黑芥着丝粒特异序列的引物为5
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agattttgcccatgctgttc-3’。以黑芥基因组dna为模板，利用所设计的引物对2条黑芥着丝粒特异序列分别进行pcr扩增，pcr扩增的条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸40s，30个循环；72℃终延伸10min。采用omega试剂盒进行pcr产物纯化回收(扩增结果如图1所示)，得到纯化pcr产物。
30.实施例3：荧光原位杂交(fish)鉴定荧光原位杂交技术是一项检测目的序列在染色体上分布的技术，该方法的检测结果真实且可靠，不仅适用于单拷贝基因在染色体上的鉴定研究，还适用于多拷贝重复序列在染色体上的鉴定研究。
31.芸薹属植物b基因组染色体特异识别探针的荧光原位杂交鉴定包含以下步骤：1)将芸薹属6个栽培种(黄籽：b.rapa,aa；黑芥：b.nigra,bb；甘蓝：b.oleracea,cc；2598：b.juncea,aabb；darmor：b.napus,aacc；dodolla：b.carinata,bbcc)种植于温室，2周后，采集幼嫩根尖，置于2mm 8-羟基喹啉溶液中室温处理2h；2)处理后的根尖浸泡在预冷的卡诺氏固定液中固定过夜；3)取固定好的根尖，用刀片切取根尖分生组织，置于含有4％纤维素酶和2％果胶酶的酶解液中充分酶解；4)吸取酶解后的根尖分生区组织块，用火焰干燥法制备中期染色体玻片；5)利用缺口平移法标记探针，将从黑芥基因组dna中pcr扩增得到的着丝粒特异dna片段纯化后用于标记探针，具体的探针制备反应体系为：1μg黑芥着丝粒重复序列1纯化pcr产物或1μg黑芥着丝粒重复序列2纯化pcr产物，50mm tris-hcl(ph7.5)，50mm mgcl2，0.05mm datp，0.05mm dctp，0.05mm dgtp，0.05mm dttp，0.05mm dig-dutp，0.1u/μl dna聚合酶i(dna polymerase i)，0.005u/μl脱氧核糖核酸酶i(dnase i)；将上述反应体系于15℃水浴中反应1.5h，通过加入1μl 0.5m edta(ph8.0)或65℃温浴10min来终止反应，即可获得含有地高辛半抗原标记物的探针；6)配制含50％甲酰胺(v/v)、10％硫酸葡聚糖、2
×
ssc溶液(每升溶液中含17.53g nacl、8.82g柠檬酸钠，ph 7.0)、100ng地高辛标记探针的20μl杂交液，将杂交液于90℃变性
5min后，迅速放于冰水中10min；染色体玻片在70℃变性1min后，将杂交液滴加到染色体制片上，放入湿盒37℃杂交过夜；7)杂交后进行探针洗脱，在室温下依次用2
×
ssc溶液洗脱3次，再用1
×
pbs(ph7.5)洗脱1次，洗脱时间均为3min；8)探针洗脱后加入能与地高辛半抗原标记物特异结合的红色荧光抗体，37℃孵育1h；9)孵育后进行抗体洗脱，在室温下用1
×
pbs(ph7.5)洗脱3次，每次5min；10)空气干燥玻片后，在玻片上加入含有dapi的抗褪色剂进行染色体复染；11)利用荧光显微镜进行图像采集，鉴定出与b染色体特异结合的探针信号。
32.从图2和图3中可以看到，本发明探针仅在含有b基因组的黑芥(bni,bb,2n＝16)染色体上产生信号，而在含有a基因组的黄籽(bra,aa,2n＝20)、含有c基因组的甘蓝(bol,cc,2n＝18)以及含有a、c基因组的四倍体物种darmor(bna,aacc)染色体上均没有产生信号，进一步在异源四倍体物种2598(bju,aabb,2n＝36)和dodolla(bca,bbcc,2n＝34)中仅产生与b基因组染色体数目相同的信号点，说明其在四倍体物种中也仅在b基因组染色体上产生信号，验证了本发明探针可用于特异识别芸薹属植物b基因组染色体。
33.本发明中披露的说明和实践，对于本技术领域的普通技术人员来说，都是易于思考和理解的，且在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的修改或改进，也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种用于芸薹属植物b基因组染色体特异识别检测的探针，其特征在于：所述探针具有如seq id no.1或seq id no.2所示的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的用于芸薹属植物b基因组染色体特异识别检测的探针，其特征在于：所述探针为地高辛标记探针。3.根据权利要求2所述的用于芸薹属植物b基因组染色体特异识别检测的探针，其特征在于：所述探针的制备方法为：依据seq id no.1或seq id no.2所示的核苷酸序列设计pcr扩增引物，以黑芥基因组dna为模板，利用所设计的引物进行pcr扩增，pcr产物经纯化后采用缺口平移法进行地高辛标记，得到地高辛标记探针，即为用于芸薹属植物b基因组染色体特异识别检测的探针。4.根据权利要求3所述的用于芸薹属植物b基因组染色体特异识别检测的探针，其特征在于：扩增seq id no.1所示黑芥着丝粒特异序列的引物为5
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gccatgtctcaacagaagca-3’，扩增seq id no.2所示黑芥着丝粒特异序列的引物为5
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gctctccattacccctcctc-3’和5
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agattttgcccatgctgttc-3’。5.根据权利要求3所述的用于芸薹属植物b基因组染色体特异识别检测的探针，其特征在于：所述缺口平移法的反应体系为：1μg纯化pcr产物，50mm ph7.5 tris-hcl，50mm mgcl2，0.05mm datp，0.05mm dctp，0.05mm dgtp，0.05mm dttp，0.05mm dig-dutp，0.1u/μl dna聚合酶i，0.005u/μl脱氧核糖核酸酶i。6.根据权利要求5所述的用于芸薹属植物b基因组染色体特异识别检测的探针，其特征在于：所述缺口平移法的反应条件为：15℃反应1.5h后，加入1μl 0.5m ph8.0 edta或于65℃温浴10min以终止反应。7.如权利要求3所述的探针在芸薹属植物染色体工程和远源杂交育种中的应用。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述芸薹属植物为黑芥。

技术总结
本发明公开了一种用于芸薹属植物B基因组染色体特异识别检测的探针及其制备方法和应用。所述探针具有如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，为地高辛标记探针。本发明提供的探针仅能在芸薹属植物B基因组染色体上产生清晰明亮的信号，而在A、C基因组染色体上无任何信号，说明该探针是芸薹属植物B组染色体特异识别探针。本发明的芸薹属植物B基因组染色体特异识别探针可用于快速准确地检测和跟踪芸薹属植物B基因组染色体行为，为芸薹属植物染色体工程及远源杂交育种工作的开展提供一种简便、高效的鉴定方法。高效的鉴定方法。


技术研发人员：李占杰 秦源 梁启富
受保护的技术使用者：福建农林大学
技术研发日：2023.05.25
技术公布日：2023/7/12