猪星状病毒ORF2蛋白在制备猪腹泻病的试剂盒中的应用

猪星状病毒orf2蛋白在制备猪腹泻病的试剂盒中的应用
技术领域
1.本发明属于免疫技术领域，具体涉及一种猪星状病毒orf2蛋白在制备猪腹泻病的试剂盒中的应用。


背景技术：

2.星状病毒（astrovirus, astv）是引起人类和许多动物腹泻的最重要的病原之一。据报道，它已成为引起婴幼儿腹泻的第二常见病因，具有很大的变异性和宿主适应性。已证实，不同血清型或不同物种之间存在基因重组，意味着astv可在动物之间、动物和人类之间发生种间传播。猪星状病毒（porcine astrovirus,pastv）最早由briger于1980年在3周龄腹泻仔猪粪便样品中发现，目前pastv在世界范围内分布广泛。根据星状病毒orf2基因的遗传变异，可将pastv分为5种基因亚型，pastv1-pastv5。报道显示，加拿大健康猪群中pastv感染率达80%，美国pastv阳性猪群中pastv4占比97.2%。欧洲主要流行pastv4亚型（70.4%），亚洲主要流行pastv-2和pastv-4。提示，pastv4可能是世界范围内的优势流行基因型。
3.星状病毒基因组含有3个不同的重叠开放阅读框（open reading frames, orf）：orf1a、orf1b和orf2。其中，orf1a和orf1b编码非结构蛋白，orf2编码病毒衣壳蛋白，是基因组中的高变区域。orf2蛋白主要决定细胞的异嗜性，是参与调控细胞基因的转录表达及病毒受体结合的重要成分，在病毒粒子成熟和包装过程中发挥重要作用。与非结构蛋白orf1b相比，orf2遗传变异较大，其作为病毒衣壳蛋白，含有丰富的抗原区域，可诱导与宿主相互作用的中和性抗体的产生，是疫苗制备和临床诊断技术开发的主要候选抗原。目前，市场上尚未有猪星状病毒疫苗及临床诊断试剂盒，鉴于该病原在猪腹泻病中扮演重要角色，因此orf2蛋白的体外表达，对于该病原诊断与防控技术产品的开发具有重要意义。


技术实现要素：

4.本发明针对现有技术中的不足，目的是提供一种猪星状病毒orf2蛋白在制备猪腹泻病的试剂盒中的应用。
5.为达到上述目的，本发明的解决方案是：猪星状病毒orf2蛋白在制备猪腹泻病的试剂盒中的应用。
6.进一步地，猪星状病毒orf2蛋白的氨基酸序列如seq id no.4所示。
7.进一步地，猪星状病毒orf2蛋白由重组质粒pgex-orf2转化rosetta表达菌株，离心，分别在37℃和15℃诱导得到。
8.进一步地，离心的转速为10000r/min，离心的时间为2min。
9.进一步地，重组质粒pgex-orf2包括orf2基因和pgex-4t-1载体。
10.进一步地，orf2基因以pastv/sh/2022/cm1病毒液总rna反转录，以cdna为模板，利用引物进行pcr扩增得到。
11.进一步地，引物的上游序列如seq id no.2所示，下游序列如seq id no.3所示。
12.进一步地，orf2基因的碱基序列如seq id no.1所示。
13.由于采用上述方案，本发明的有益效果是：本发明提供的orf2蛋白表达量高，且纯度好，为猪星状病毒临床诊断相关技术研发提供了良好的素材储备。此外，本发明提供的orf2蛋白带有gst标签，可用于特异性鉴定，为研究猪星状病毒和宿主互作的致病机制提供了一种新的选择。
附图说明
14.图1为本发明的orf2基因的pcr扩增图（m: dl8,000 dna marker；1: orf2基因；2: 阴性对照）。
15.图2为本发明的重组质粒的鉴定图。
16.图3为本发明的sds-page鉴定orf2表达图（m: protein marker；1: pgex-orf2质粒未诱导表达；2: pgex-orf2质粒诱导表达（15℃）；3: pgex-4t-1空质粒诱导表达（15℃）；4: pgex-orf2质粒诱导表达后（37℃）；5: pgex-4t-1空质粒诱导表达后（37℃））。
17.图4为本发明的orf2融合蛋白的纯化图（m: protein marker；1: pgex-4t-1空质粒；2: orf2蛋白（15℃）；3: orf2蛋白（37℃））。
实施方式
18.本发明提供了一种猪星状病毒orf2蛋白在制备猪腹泻病的试剂盒中的应用。
19.1.材料与方法1.1病毒猪星状病毒4型流行株pastv/sh/2022/cm1由上海市农业科学院畜牧兽医研究所分离与保存。
20.1.2主要试剂pgex-4t-1载体和rosetta表达菌株由本实验室保存；protein marker购自thermo公司；胶回收试剂盒购自tiangen公司；iptg购自sigma公司；sds购自amresco公司；tryptone、yeast extract购自 oxoid公司；0.22μm无菌滤器和透析袋购自millipore公司；gst纯化试剂盒购自promege公司。
21.1.3引物根据pastv/sh/2022/cm1毒株orf2基因序列（genbank no：on391462），设计1对引物（orf2-f：ggatccccatcatggtcagcccttg（seq id no.2）；orf2-r：gtcgaccatcttcttcagatgatcaag（seq id no.3））扩增orf2基因，大小为1845bp。引物由上海生物工程有限公司合成。
22.其中，orf2基因序列（seq id no.1）：(bamhi)ggatccccatcatggtcagcccttggggcgagacgacatagggacacgaatcccggtcgccccctgtacttcgtccttagtgggaaggagtttaagggacccaaagatggctggttcttttgtaatacgaagaatgatccacagatgtgcacagcaggctccatagaaattcacaccctgggtcaaactatttcaacctatcaaaataaacagtttgatggacctctctttcttgctgagatgacatgtgactggtcttttaaggggtacaatcccatgcctggtatgttaacattggtgaaagcagagctaaaagaaaaggaacaggcagtaaaaatctattccaaacctggtgagcctataacaatatcagttccaccgagctctctcttggctaggactactggtggcccaaatgctgctgcagatgctaccccctctgagataatctggtccatttgtgatactactatggatgtggtgactggagcccttcctgccccttttgagtggctgt
ttagagcaggatggtggtttgtgaaaaggatagctaatagaaaaacagcagtagactctacacctggggagccaaatgctggagaggttacattccaagtatttcagagtctatctgacgctagaaatgatgttccatgtattgctacaagtacagcccaaagtactaacacagagatcactggttggcacattgtacaagtcacaccaggtaatgtgggatctccacaggccaccatgatgatgtcccgaagtgcagacttcacccttgatgatatcaagataacatctgaaccgctacttggccagtctgcattttatgggcacatctttacacaagtcccaaattcatgttttgtagcacagagggctgtaggtactcctcaaagtaaggtctacagttatatagcatggcatctcaataaacctgtctttatgcagaatggcaacgagataaaccctgctcaactttcatcaaacccttatccattactccataaagaaggcggcagctttcgtgagattggaaccgtctttgcagccggttatgctgccattggtcagacaccagactacaactggacaacagtactatggaggtcaaatataactgaagaggttaagataaggggccagacaggtacaactgacaggtttgtttttattcagccaacacaaagttcaaacacatctagtccaccaacaaccgtctataatgtgacactaacaaatcagatgtccatgccagagaggaggattccattggtagcaggtgaatggtatttaagttcctttgtcacataccatggtgctattgaattcacaaactatggaatacccttctaccatggccttcagaatcccactacaacatcatctcaatatgatataggtagacctgtctttgatgttggagcagccatgcaaacatccatgccactgacacttacaccaccttcagcttctagtgtgccatcattgacaaaccttgaggttgaacagctgcgctcactgttaaatccaggtgacttgccaccacctttacagccaggttatgatagcctagaaatgccacctttagaagaagaagaagaagaattgcagggagcagttggagacactgggaagcggagggataccaggaattgggttgaatttggccacagaaagagaccaccaacaccattctcaccaatagaggaagaggaagaagatgaggaagaatctgatttagatgatgatgattatgcagaagttccttcttttgttaagaatctccttacacctgaagctaaaaaacttcttgatgatctgaagaagatggtcgac (sali)。
23.orf2氨基酸序列（seq id no.4）：pswsalgarrhrdtnpgrplyfvlsgkefkgpkdgwffcntkndpqmctagsieihtlgqtistyqnkqfdgplflaemtcdwsfkgynpmpgmltlvkaelkekeqavkiyskpgepitisvppssllarttggpnaaadatpseiiwsicdttmdvvtgalpapfewlfragwwfvkrianrktavdstpgepnagevtfqvfqslsdarndvpciatstaqstnteitgwhivqvtpgnvgspqatmmmsrsadftlddikitsepllgqsafyghiftqvpnscfvaqravgtpqskvysyiawhlnkpvfmqngneinpaqlssnpypllhkeggsfreigtvfaagyaaigqtpdynwttvlwrsniteevkirgqtgttdrfvfiqptqssntssppttvynvtltnqmsmperriplvagewylssfvtyhgaieftnygipfyhglqnptttssqydigrpvfdvgaamqtsmpltltppsassvpsltnleveqlrsllnpgdlppplqpgydslemppleeeeeelqgavgdtgkrrdtrnwvefghrkrpptpfspieeeeedeeesdlddddyaevpsfvknlltpeakkllddlkkm。
24.1.4原核表达质粒的构建与鉴定提取pastv/sh/2022/cm1病毒液总rna并反转录，以cdna为模板，利用orf2-f/orf2-r引物对进行pcr扩增，并利用胶回收试剂盒回收orf2目的片段。利用bamhi和sali限制性内切酶同时双酶切pgex-4t-1载体和orf2基因片段，并用t4 dna ligase进行连接后转化rosetta感受态。挑取单菌落，利用菌液pcr或提质粒方法进行鉴定，并送上海生物工程有限公司进行测序鉴定，筛选获得正确的重组质粒pgex-orf2。
25.1.5 orf2蛋白的原核表达与鉴定将鉴定正确的pgex-orf2菌落接种于3ml氨苄lb培养液中，37℃、220r/min振摇过夜。次日按1:100转接至30ml氨苄lb培养液中，继续振摇至菌体od600为0.6-0.8。取出1ml培养物，10000r/min室温离心2min，弃上清，用100μl 1
×
上样缓冲液重悬菌体沉淀。向剩余的培养物中加入iptg至终浓度为0.2mm，分别在15℃和37℃、220r/min振摇过夜，诱导融合蛋
白表达。取出1ml培养物，10000r/min室温离心2min，弃上清，用100μl 1
×
上样缓冲液重悬菌体沉淀。剩余培养物4000r/min，离心10min，弃上清，用 pbs重悬菌体沉淀；重悬液进行超声波破碎后，分别取上清液与沉淀液加入上样缓冲液重悬。利用12% sds-page检测分析，考马斯亮蓝染色显带。
26.1.6 融合蛋白的纯化将菌体沉淀重悬于20ml裂解液（20mm tris-hcl ，0.15m nacl，containing 1mm pmsf and bacteria protease inhibitor cocktail，ph 8.0），超声破碎（功率400w，工作4s，间歇8s，共20min）。将超声破碎的细胞裂解液4℃、10000r/min离心20min，收集上清。
27.利用gst柱低压层析系统，上清溶液以0.5ml/min流速上样至gst binding-buffer预平衡的gst亲和层析柱。用gst binding-buffer以0.5ml/min流速冲洗，至流出液od280值到达基线。用gst elution-buffer（20mm tris-hcl，50mm gsh， 0.15m nacl，ph 8.0）以1ml/min流速洗脱目的蛋白，收集流出液。利用12% sds-page分析。
28.2. 结果2.1 orf2基因的pcr扩增以猪星状病毒总rna为模板，pcr成功扩增获得1845bp左右的orf2基因目的条带（图1）。
29.2.2 pgex-orf2原核表达质粒的构建与鉴定将orf2基因插入pgex-4t-1载体，挑取单克隆，利用提质粒和双酶切鉴定。结果显示（图2），提取的质粒大小约6814bp，bamhi和sali双酶切将重组质粒切成4969bp和1845bp的两条带，与预期相符，提示pgex-orf2重组质粒构建正确。进一步将该质粒送公司测序，证实插入的orf2基因片段序列正确。
30.2.3 orf2蛋白的表达与鉴定将pgex-orf2质粒转化rosetta表达菌株，分别在37℃和15℃进行诱导表达。利用sds-page电泳鉴定（图3），发现orf2融合蛋白在37℃和15℃均能诱导表达成功，大小约85kd，与预期相符。
31.3.结果与讨论orf2是星状病毒的结构蛋白，不仅介导病毒与宿主的相互利用，还可刺激机体产生中核抗体。本发明选择带gst标签的原核表达系统，成功表达获得猪星状病毒orf2蛋白，不仅可用于临床检测和诊断方法的建立，也可用于研究orf2蛋白与宿主的互作。
32.对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

技术特征：
1.猪星状病毒orf2蛋白在制备猪腹泻病的试剂盒中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述猪星状病毒orf2蛋白的氨基酸序列如seq id no.4所示。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述猪星状病毒orf2蛋白由重组质粒pgex-orf2转化rosetta表达菌株，离心，分别在37℃和15℃诱导得到。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述离心的转速为10000r/min，离心的时间为2min。5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述重组质粒pgex-orf2包括orf2基因和pgex-4t-1载体。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述orf2基因以pastv/sh/2022/cm1病毒液总rna反转录，以cdna为模板，利用引物进行pcr扩增得到。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述引物的上游序列如seq id no.2所示，下游序列如seq id no.3所示。8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述orf2基因的碱基序列如seq id no.1所示。

技术总结
本发明提供了一种猪星状病毒ORF2蛋白在制备猪腹泻病的试剂盒中的应用，其中，猪星状病毒ORF2蛋白由重组质粒pGEX-ORF2转化Rosetta表达菌株，离心，分别在37℃和15℃诱导得到；重组质粒pGEX-ORF2包括ORF2基因和pGEX-4T-1载体，ORF2基因以PAstV/SH/2022/CM1病毒液总RNA反转录，以cDNA为模板，利用引物进行PCR扩增得到，ORF2基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，引物的上游序列如SEQ ID NO.2所示，下游序列如SEQ ID NO.3所示。NO.3所示。NO.3所示。


技术研发人员：刘惠莉 陶洁 李本强 程靖华 石迎
受保护的技术使用者：上海市农业科学院
技术研发日：2023.05.08
技术公布日：2023/7/12