用于核酸恒温扩增反应的酶组合产品及其应用的制作方法

1.本技术涉及分子生物技术领域，特别是涉及一种用于核酸恒温扩增反应的酶组合产品及其应用。


背景技术：

2.核酸扩增技术是现代生命科学领域中一项极其重要的技术。聚合酶链反应(polymerase chain reaction，pcr)是核酸扩增技术的典型代表。该技术由美国pe-cetus公司人类遗传研究室的mμllis等于1985年发明，它以线性dna为模板进行复制反应。然而，这种经典的技术需要一个温度循环仪器使双链dna解链，而后降温退火，引物与模板链配对，最后在72℃条件下引物得到延伸，以上过程循环往复使dna呈指数式扩增。整个pcr反应过程都需要在精密温控仪器中进行，而这种仪器价格昂贵、对操作人员的专业技能要求较高、且只有在一些发达地区的实验室或者医疗机构才会配备，大大限制了基于pcr的分子诊断技术在现场快速诊断中的应用。
3.核酸恒温扩增技术无需经过变温步骤即可实现对靶核酸片段的指数式扩增，对仪器的要求大为简化，无需严格受训的专业人员，更不受应用场景的限制，且大大加快了核酸扩增的反应时间。因此，核酸恒温扩增技术更能满足现代分子检测技术“快速简便”的需求，具有较大的现场应用价值。近年来，随着分子生物学技术的迅速发展，基于恒温扩增技术的诊断方法已大量建立并广泛应用于人类疾病的实验室检测中。如美国becton dickinson and company在结核病、呼吸道疾病以及性病等诊断领域广泛应用的链置换扩增技术(sda)，qiagen nv采用的滚环扩增技术(rca)，quidel corporation所采用的依赖解旋酶扩增技术(hda)，tecan genomics采用的单引物恒温扩增技术(spia)，雅培公司研制的id now检测试剂盒所采用的near技术都非常吸引人们的视线。此外，还有博奥生物和百康芯等应用于呼吸道病原体检测的环介导等温扩增技术(lamp)，浙江泰晶生物科技有限公司和江苏省奇天基因公司采用的重组酶介导链替换核酸扩增技术raa(recombinase aided amplification)、上海仁度生物科技有限公司采用的sat技术、杭州优思达公司采用的cpa技术、twistdx的重组酶聚合酶扩增技术(rpa)等。
4.其中，重组酶介导链替换核酸扩增技术(raa)，是通过模拟dna体内扩增，在常温条件下扩增目的片段。该技术主要依赖大肠杆菌的reca重组蛋白、单链dna结合蛋白ssb和链置换dna聚合酶，具有灵敏度高、特异性强、操作简便、反应时间短、无需精密温控设备、不受专业人员和应用场地的限制等优点；但该技术本身还存在着一些缺陷和不足：(1)重组蛋白reca的活性受到其自身c端氨基酸残基的抑制，导致其对ssdna的亲和力较弱；(2)重组蛋白reca对atp的水解速率较慢，atp的水解酶不彻底；(3)raa技术中除了应用大肠杆菌重组蛋白reca外，还额外应用了酵母蛋白rad51，增加了反应成本；(4)raa反应体系中重组蛋白reca、酵母蛋白rad51、单链dna结合蛋白、磷酸肌酸激酶、bsu dna聚合酶等蛋白酶，对酶保存液的要求比较高，甘油浓度低于50％将导致酶活性降低，非常不利于酶的保存与应用，而高甘油酶在冻干应用方面更是需要投入很高的成本；(5)reca蛋白对ph敏感，ph的变化容易
影响其自身的活性，同时需要更高浓度的mg
2+
方可激活reca的活性。上述种种因素限制了raa的应用。


技术实现要素：

5.基于此，本技术提供了一种用于核酸恒温扩增技术的酶组合产品及其应用。
6.根据本技术的一个方面，提供了一种用于核酸恒温扩增反应的酶组合产品，包括重组蛋白recam和解旋酶uvrdm；所述重组蛋白recam具有如seq id no.2所示的氨基酸序列；所述解旋酶uvrdm具有如seq id no.4所示的氨基酸序列。
7.在其中一个实施例中，编码所述重组蛋白recam的核苷酸序列如seq id no.1所示。
8.在其中一个实施例中，编码所述解旋酶uvrdm的核苷酸序列如seq id no.3所示。
9.在其中一个实施例中，还包括单链dna结合蛋白、bsu dna聚合酶和磷酸肌酸激酶中的一种或多种。
10.一种用于核酸恒温扩增反应的试剂盒，包括上述的酶组合产品。
11.在其中一个实施例中，还包括tris-hcl缓冲液、氯化钾、聚乙二醇35000、二硫苏糖醇、dntps、atp、磷酸肌酸、正向引物、反向引物、检测探针和氯化镁中的一种或多种。
12.在其中一个实施例中，所述检测探针的两端分别标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团。
13.一种重组酶解旋酶介导的恒温扩增方法，包括如下步骤：
14.以待测样本的dna或rna为模板；使用上述的酶组合产品或上述的试剂盒进行扩增。
15.在其中一个实施例中，所述扩增的反应体系包括如下成分：
[0016][0017]
在其中一个实施例中，扩增的温度为20℃～42℃，扩增的时间为5min～40min。
[0018]
与传统技术相比，本技术具有如下有益效果：
[0019]
本技术通过分子生物学和生物信息学方法，对重组蛋白reca、解旋酶uvrd进行氨基酸突变筛选，筛选得到的重组蛋白recam和解旋酶uvrdm用于核酸恒温扩增反应时能够提高对dna的亲和力、降低对ph的敏感度以及对mg
2+
浓度的依赖。
[0020]
此外，本技术的重组酶解旋酶介导的核酸恒温扩增方法，对靶标序列特异性强、灵敏度和稳定性较高；并且检测成本低、操作便捷，具有推广应用的前景。
附图说明
[0021]
为了更清楚地说明本技术实施例中的技术方案、更完整地理解本技术及其有益效果，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本技术的一些实施例，对本领域技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0022]
图1为实施例1中采用不同重组蛋白reca突变体的荧光扩增曲线图；
[0023]
图2为实施例1中筛选的重组蛋白recam的三维结构图；
[0024]
图3为实施例1中采用重组蛋白reca的野生型及突变体在不同ph条件下的荧光扩增曲线图；
[0025]
图4为实施例1中采用重组蛋白reca的野生型及突变体在不同mg
2+
浓度条件下的荧光扩增曲线图；
[0026]
图5为实施例1中采用重组蛋白reca的野生型及突变体对不同浓度质粒模板的荧
光扩增曲线图；
[0027]
图6为实施例2中筛选的解旋酶uvrdm的三维结构图；
[0028]
图7为实施例2中采用解旋酶uvrd的野生型及突变体在不同ph条件下的荧光扩增曲线图；
[0029]
图8为实施例3中采用重组蛋白recam和解旋酶uvrdm在不同温度条件下进行核酸扩增的荧光曲线图；
[0030]
图9为实施例4中采用重组蛋白recam和解旋酶uvrdm对不同病原体进行多重扩增的荧光曲线图；
[0031]
图10为实施例5中采用现有的试剂盒及本技术的试剂盒检测副流感病毒的荧光扩增曲线图。
具体实施方式
[0032]
为使本技术的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，对本技术的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本技术。但是本技术能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本技术内涵的情况下做类似改进，因此本技术不受下面公开的具体实施例的限制。
[0033]
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本技术的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本技术。除非另有特别说明，本技术中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
[0034]
本技术的一方面提供了一种用于核酸恒温扩增反应的重组酶组合产品。
[0035]
在其中一些实施方式中，上述重组酶组合产品包括重组蛋白recam和解旋酶uvrdm；其中，重组蛋白recam具有如seq id no.2所示的氨基酸序列，解旋酶uvrdm具有如seq id no.4所示的氨基酸序列。
[0036]
reca蛋白是一种在细菌重组dna修复中起作用的dna依赖性atp酶，其活性受到自身c端的自动调节，单链dna结合蛋白ssb还通过竞争ssdna结合位点间接影响reca功能；reco、recr、以及可能的recf蛋白，都有助于将reca加载到ssb包被的ssdna上；uvrd解旋酶能够从reca中去除reca细丝。
[0037]
单链dna结合蛋白可以大大刺激reca蛋白催化单链dna同源配对的活性，而且uvrd解旋酶可以通过加强reca与ssdna的亲和力来提高reca的单链dna依赖性atp酶活性。reca蛋白与atp结合后导致dna结合亲和力大大增加，同时atp的结合更加稳定了reca-ssdna的结构。单链dna结合蛋白能够与单链ssdna形成稳定的ssb-ssdna复合体，但是在reco的作用下，ssb-ssdna复合体结构的稳定性明显减弱，同时使ssdna更加倾向于形成reca-ssdna复合体，david a.zarling等人利用这一特征，使用大肠杆菌reca蛋白、ssb蛋白、以及特异性引物进行了特定区段的核酸扩增。reca-引物复合物在atp的作用下具有与模板链中互补位点同源配对的特性，并置换出碱基序列相同的链，而后与互补链结合形成d-loop结构；d-loop结构中引物暴露的3’端在dna聚合酶的作用下引物得到延伸，直至复制完成。以上过程循环往复靶dna片段即可实现指数式扩增。
[0038]
上述的重组蛋白recam可替代重组酶reca或rad51使用，解旋酶uvrdm可增强重组
蛋白recam的链置换活性。
[0039]
在其中一些实施方式中，编码上述重组蛋白recam的核苷酸序列如seq id no.1所示；编码上述解旋酶uvrdm的核苷酸序列如seq id no.3所示。
[0040]
在其中一些实施方式中，上述重组蛋白recam来源于枯草芽孢杆菌，上述解旋酶uvrdm来源于大肠杆菌，通过将野生型枯草芽孢杆菌的reca蛋白c端25个氨基酸删除，增强了reca蛋白对dna的亲和力；同时，提高recam重组蛋白对ph的耐受度，并且降低了recam重组蛋白对mg
2+
的依耐性。通过将野生型大肠杆菌的uvrd的c端的40个氨基酸残基进行删除突变，以及中间保守基序中的第258位脯氨酸定点突变为亮氨酸后，增强其对ph的耐受性及稳定性。
[0041]
在其中一些实施方式中，上述重组蛋白recam和解旋酶uvrdm能够在大肠杆菌中实现大量可溶性表达。
[0042]
本技术提供的重组酶组合产品中，重组蛋白recam和解旋酶uvrdm的制备方法包括步骤s10～s40。
[0043]
s10：将目的基因片段导入表达载体中，构建重组表达质粒；
[0044]
s20：将上述重组表达质粒转入表达菌中，制备重组工程菌；
[0045]
s30：对步骤s20制备的重组工程菌进行诱导表达，经过工程菌富集、超声破碎、离心，制备未纯化的重组蛋白；
[0046]
s40：将未纯化的重组蛋白经过层析纯化得到重组蛋白recam和解旋酶uvrdm。
[0047]
在其中一些具体示例中，步骤s10中，目的基因表达片段含有如seq id no.1或seq id no.3所示的核酸序列；且目的基因表达片段的5’端具有bamh i酶切位点黏性末端，3’端具有sal i酶切位点黏性末端。
[0048]
纯化后的重组蛋白recam对dna具有更高的亲和力，在更高ph条件仍具有较高活性，在更低mg
2+
条件下也可发挥其重组酶活性；纯化得到的解旋酶uvrdm在更高ph条件下具有更高的稳定性。
[0049]
上述重组蛋白recam和解旋酶uvrdm的制备方法中，步骤s10中，表达载体优选为pet-28a载体。
[0050]
上述重组蛋白recam和解旋酶uvrdm的制备方法中，步骤s20中，表达菌优选为大肠杆菌。
[0051]
上述重组蛋白recam和解旋酶uvrdm的制备方法，具有制备工艺简单、产量和稳定性高、量产成本低等优点。
[0052]
在其中一些实施方式中，上述的重组酶组合产品还包括单链dna结合蛋白、bsu dna聚合酶和磷酸肌酸激酶中的一种或多种。
[0053]
本技术通过分子生物学与生物信息学方法，对reca蛋白、解旋酶uvrd进行氨基酸突变筛选，提高了recam重组蛋白对dna的亲和力，降低其对ph的敏感度，使其在更高ph条件下仍能保持高重组酶活性，降低recam重组蛋白对mg
2+
浓度的依赖，使其在较低浓度mg
2+
环境下也能高效扩增。本技术的重组酶组合产品包括重组酶recam和解旋酶uvrdm，可以更好的替代reca重组蛋白参与raa反应；重组蛋白recam与野生型重组蛋白reca蛋白序列同源性为59％(208/353)；而且本技术中重组酶recam和解旋酶uvrdm的制备工艺简单，产量和稳定性大幅提高，量产成本低。
[0054]
本技术的另一方面提供了一种用于核酸恒温扩增反应的试剂盒，该试剂盒包括上述的重组酶组合产品。
[0055]
在其中一些实施方式中，上述试剂盒中还包括tris-hcl缓冲液、氯化钾、聚乙二醇35000、二硫苏糖醇(dtt)、dntps、atp、磷酸肌酸、正向引物、方向引物、检测探针和氯化镁中的一种或多种。
[0056]
在其中一些实施方式中，正向引物和反向引物的长度均为20bp～35bp。
[0057]
在其中一些实施方式中，检测探针的两端分别标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团。
[0058]
本技术的又一方面提供了一种重组酶解旋酶介导的核酸恒温扩增的方法，其特征在于，包括如下步骤：
[0059]
以待测样本的dna或rna为模板；使用权利要求1至4任一项所述的重组酶组合产品或5至7任一项所述的试剂盒进行扩增。
[0060]
在其中一些实施方式中，扩增反应体系包括如下成分：tris-hcl缓冲液5mm～100mm、氯化钾10mm～150mm、氯化镁1.5mm～15mm、质量分数为1％～10％聚乙二醇35000、二硫苏糖醇0.5mm～3mm、atp 1mm～5mm、磷酸肌酸10mm～100mm、dntps 0.1mm～1mm、引物0.2μm～1.0μm、检测探针0.1μm～0.5μm、磷酸肌酸激酶10ng/μl～100ng/μl、重组蛋白recam 10ng/μl～360ng/μl、解旋酶uvrdm ng/μl～100ng/μl、单链dna结合蛋白ssb 200ng/μl～1000ng/μl、exo iii核酸外切酶0.5u/μl～5u/μl、bsu dna聚合酶15ng/μl～240ng/μl。
[0061]
在其中一些实施方式中，扩增反应的温度为20℃～42℃，反应时间为5min～40min。
[0062]
传统技术中，重组酶介导链替换核酸扩增技术(raa)主要依赖大肠杆菌的reca重组蛋白、酵母rad51重组酶、单链dna结合蛋白ssb和链置换dna聚合酶。reca重组蛋白能够利用atp结合引物，形成reca重组蛋白-引物复合体，这些复合体能够识别与之互补的目标双链dna；接着重组蛋白-引物复合体侵入目标双链dna的5’端形成d-loop环，并将底物atp分解产生adp+pi。同时，链置换dna聚合酶结合在引物3’端进行链延伸，形成新的互补链。重组酶介导链替换核酸扩增技术中，重组蛋白reca可以改变重组reca-引物复合体解离及重新结合的可逆反应过程，使反应向更有利于扩增的方向进行。
[0063]
使用本技术的重组蛋白recam和解旋酶uvrdm，在恒温条件下即可实现核酸扩增，并且扩增反应具有灵敏、高效、经济、便捷等优点。
[0064]
本技术的重组酶解旋酶介导的恒温扩增反应(recombinase helicase mediated isothermal amplification，rhma)，区别于raa技术仅利用重组酶活性实现链置换反应，rhma技术除了利用重组酶的重组酶活性外，还利用解旋酶加强重组酶与ssdna的亲和力来提高重组酶的单链dna依赖性atp酶活性，实现对靶核酸的快速扩增，对核酸靶标序列的检测亲和力强、特异性好、灵敏度高，可在20℃～42℃的恒温条件下实现高灵敏的快速分子检测，检测成本低廉、操作方便快捷，具有广阔的应用前景。
[0065]
本技术提供的重组酶解旋酶介导的恒温扩增(rhma)反应体系的反应原理为：(1)反应体系中重组酶与atp以及特异性引物结合形成的重组酶-atp-引物复合体，在双链dna模板中寻找同源序列；(2)重组酶-atp-引物复合体识别同源序列后，引发链交换反应，单链dna结合蛋白随即结合被置换的dna链形成d-loop结构；(3)重组酶-atp-引物复合体水解体
系中的atp构象发生改变，重组酶解离暴露出引物3'端，并被dna聚合酶识别，启动dna合成；(4)dna聚合酶具有链置换功能，在引物延伸的同时继续解开模板的双螺旋dna结构，dna合成过程继续进行；(5)两条引物扩增完成即形成一个完整的扩增子；(6)在反应体系中atp水解为重组酶供能后变成adp，磷酸肌酸能在肌酸激酶的催化下将其磷酸基团转移到adp分子中形成atp，从而恢复反应体系中atp的水平。解旋酶在整个过程中参与了增强重组酶活性的作用加快该反应过程。
[0066]
上述的rhma反应至少具有如下优点：
[0067]
(1)rhma反应体系中recam经过基因工程改造，提高了recam重组蛋白对dna的亲和力，可更好地识别低丰度的模板，灵敏度高，稳定性强；
[0068]
(2)解旋酶uvrdm在扩增过程中可增强重组蛋白recam的活性，加快反应速度，降低反应的时间；
[0069]
(3)rhma反应体系在20℃～42℃的恒温条件下进行扩增，不需要pcr技术的热循环设备，从而可实现便携式的核酸检测，使检测成本低廉、操作方便快捷，具有广阔的应用前景；
[0070]
(5)rhma反应体系可实现多重扩增，只需要在反应体系中增加特异性引物对，即可一次性检测多个靶标基因；
[0071]
(6)rhma反应体系既可以适用于dna模板扩增，也可以适用于rna模板扩增；
[0072]
(7)rhma反应体系中recam具有高耐受ph范围，即使体系在试剂冻干过程中ph值发生偏移，冻干后的试剂仍可保持较高的稳定性，可在常温下长期保存。
[0073]
下面将结合具体实施例和对比例对本技术作进一步说明，但不应将其理解为对本技术保护范围的限制。
[0074]
实施例1：重组蛋白reca突变体的基因工程改造、纯化制备与验证
[0075]
已报道的reca重组蛋白活性差，对dna的亲和力弱，降解atp的速率慢，在恒温扩增反应中，检测灵敏度低、反应时间长。为了解决这一问题，申请人针对数据库中已公布的枯草芽孢杆菌的reca基因序列进行基因工程改造，对其c端的氨基酸残基进行删除突变，拟通过筛选验证得到对dna亲和力高、更耐受较高ph、mg
2+
依耐性低的重组蛋白recam。
[0076]
申请人通过对reca重组蛋白c端的活性调节功能位点一级结构序列的氨基酸残基进行基因工程改造。对reca重组蛋白c端分别进行
△
6、
△
13、
△
15、
△
17、
△
25个氨基酸残基的删除突变，得到5个突变体。
[0077]
(1)在5个突变体目的基因片段的5’端均添加bamhi酶切位点黏性末端序列，3’端均添加sall酶切位点黏性末端序列，通过基因重组技术将5个突变体目的基因片段分别导入pet-28a载体中，构建重组表达载体。
[0078]
(2)将5个重组表达载体通过42℃热激方式转入大肠杆菌，经过涂板、筛选等系列工作得到含目标基因的重组工程菌。
[0079]
(3)对重组工程菌进行诱导培养，纯化后得到重组蛋白recam。诱导表达的方法为：在重组工程菌的菌落od值为0.4～0.6时，加入终浓度为0.1mm/l的iptg(异丙基-β-d-硫代半乳糖苷)，并在16℃诱导表达28h，固液分离收集沉淀，得到表达菌，再通过超声粉碎工程表达菌后固液分离收集上清，将上清经过亲和层析后，再经阴离子层析纯化得到目标重组蛋白。
[0080]
(4)得到重组蛋白后，检测其对dna的亲和力，在不同ph条件和mg
2+
浓度下的酶活性。本实施例采用含新型冠状病毒2019ncov-n基因的重组质粒，并将浓度为1ng/μl的质粒按10倍稀释至10-6
ng/μl，采用表1所示物料配置，在荧光定量pcr仪上进行反应，反应温度为37℃，反应时间40min，每30sec采集一次荧光。
[0081]
表1反应体系
[0082]
成分含量tris-hcl缓冲液(ph8.0)8mm氯化钾90mm氯化镁10mm聚乙二醇350002.5wt％dtt(二硫苏糖醇)1.2mmatp2.5mm磷酸肌酸50mmdntps0.2mm正向引物0.48μm反向引物0.48μm磷酸肌酸激酶15ng/μl重组蛋白recam240ng/μl单链dna结合蛋白ssb500ng/μlbsudna聚合酶120ng/μlsybrgreeni1
×
模板2μlnuclease-freewaterto25μl
[0083]
本实施例的引物由申请人设计，委托上海生工合成，2019ncov-n基因的检测引物序列如表2所示。
[0084]
表2引物序列
[0085]
序号引物名称序列(5
’‑3’
)seqidno.5sars-n-fgaacttctcctgctagaatggctggcaatggcgseqidno.6sars-n-rgcagatttcttagtgacagtttggccttgttgt
[0086]
(5)不同突变体的亲和力验证：分别用突变体重组蛋白reca
△
6c、reca
△
13c、reca
△
15c、reca
△
17c、reca
△
25c以及野生型重组蛋白reca(neb：m0249s)按照表1配置反应体系进行亲和力验证，结果如图1所示：相比于野生型大肠杆菌reca重组蛋白，本实施例通过基因工程改造得到的5个突变体中，reca
△
6c、reca
△
13c、reca
△
15c对低丰度dna模板的亲和力低于野生型；而reca
△
17c和reca
△
25c两个突变体对低丰度的dna模板亲和力明显高于野生型，其中reca
△
25c突变体重组蛋白对低丰度的dna模板的亲和力高于reca
△
17c突变体；因此，将reca
△
25c命名为重组蛋白recam；该重组蛋白recam的三维结构如图2所示。
[0087]
重组蛋白recam的基因序列如seq id no.1所示：atgagtgatcgtcaggcagccttagatatggctcttaaacaaatagaaaaacagttcggcaaaggttccattatgaaactgggagaaaagacagatacaagaatttctactgtaccaagcggctccctcgctcttgatacagcactgggaattggcggatatcctcgcggacggattattg
aagtatacggtcctgaaagctcaggtaaaacaactgtggcgcttcatgcgattgctgaagttcagcagcagggcggacaagccgcgtttatcgatgcggagcatgcgttagatccggtatacgcgcaaaagctcggtgttaacatcgaagagcttttactgtctcagcctgacacaggcgagcaggcgcttgaaattgcggaagcattggttcgaagcggggcagttgacattgtcgttgtcgactctgtagccgctctcgttccgaaagcggaaattgaaggcgacatgggagattcgcatgtcggtttacaagcacgcttaatgtctcaagcgcttcgtaagctttcaggggccattaacaaatcgaagacaatcgcgattttcattaaccaaattcgtgaaaaagtcggtgttatgttcgggaacccggaaacaacacctggcggccgtgcgttgaaattctattcttccgtgcgtcttgaagtgcgccgtgctgaacagctgaaacaaggcaacgacgtaatggggaacaaaacgaaaatcaaagtcgtgaaaaacaaggtggctccgccgttccgtacagccgaggttgacattatgtacggagaaggcatttcaaaagaaggcgaaatcattgatctaggaactgaacttgatatcgtgcaaaaaagcggttcatggtactcttatgaagaagagcgtcttggccaaggccgtgaaaatgcaaaacaattcctgaaagaaaataaagatatcatgctgatgatccaggagcaaattcgcgaataa
[0088]
重组蛋白recam的氨基酸序列如seq id no.2所示：msdrqaaldmalkqiekqfgkgsimklgektdtristvpsgslaldtalgiggyprgriievygpessgkttvalhaiaevqqqggqaafidaehaldpvyaqklgvnieelllsqpdtgeqaleiaealvrsgavdivvvdsvaalvpkaeiegdmgdshvglqarlmsqalrklsgainksktiaifinqirekvgvmfgnpettpggralkfyssvrlevrraeqlkqgndvmgnktkikvvknkvappfrtaevdimygegiskegeiidlgteldivqksgswysyeeerlgqgrenakqflkenkdimlmiqeqire
[0089]
(6)突变体重组酶在不同ph条件下的酶活性验证：配置tris-hcl缓冲液ph为8.0、8.4、8.6、8.8、9.0的反应试剂，其余组分参考表1所示，分别对突变体重组蛋白reca
△
17c、reca
△
25c以及野生型重组蛋白reca进行酶活性验证，结果如图3所示：野生型大肠杆菌reca重组蛋白在ph为8.0时具有较高的重组酶活性，reca
△
17c和reca
△
25c两个突变体在ph为9.0时，仍然具有较高的重组酶活性。
[0090]
(7)突变体重组酶在不同mg
2+
浓度条件下的酶活性验证：配制mg
2+
浓度为2.5mm、5mm、10mm的试剂，其余组分参考表1所示，验证突变体重组蛋白reca
△
17c、reca
△
25c以及野生型重组蛋白reca的酶活性，结果如图4所示：野生型大肠杆菌reca重组蛋白在10mm浓度的mg
2+
浓度下具有较高的重组酶活性，reca
△
17c和reca
△
25c两个突变体在2mm浓度的mg
2+
浓度下具有较高的重组酶活性，表现为对mg
2+
的依耐性降低。
[0091]
(8)突变体重组酶与野生型重组酶的扩增效率与灵敏度分析：按照表1的反应体系，分别用本实施例筛选得到的重组蛋白recam与野生型重组蛋白reca配制反应体系，对浓度为10-1
ng/μl、10-2
ng/μl、10-3
ng/μl、10-4
ng/μl、10-5
ng/μl、10-6
ng/μl的新型冠状病毒2019ncov-n基因的重组质粒进行扩增，反应在abi q5荧光定量pcr仪上进行，反应温度为37℃，扩增45个循环，每30sec采集一次荧光。在反应时间相同的情况下，比较不同重组蛋白对样本的检测ct值，分析重组酶的扩增效率与灵敏度。
[0092]
检测结果表明：重组蛋白recam与野生型重组蛋白reca对相同浓度质粒样本的检测ct值存在明显的差异，重组蛋白recam的检测c t值明显小于野生型重组蛋白reca(表3)，说明重组蛋白recam的扩增效率高于野生型重组蛋白。另外，在检测的45个ct内，重组蛋白recam对所有检测样本都有扩增曲线，但野生型重组蛋白reca对10-6
ng/μl质粒却无扩增曲线(图5)，说明重组蛋白recam的灵敏度高于野生型重组蛋白。
[0093]
表3重组蛋白recam与野生型重组蛋白reca检测ct比较
[0094]
序号质粒浓度recam野生型reca
110-1
ng/μl4.58810.770210-2
ng/μl6.11612.946310-3
ng/μl8.17216.896410-4
ng/μl9.47825.847510-5
ng/μl16.34837.615610-6
ng/μl27.944/
[0095]
实施例2：解旋酶uvrd的基因工程改造、纯化制备与验证
[0096]
解旋酶uvrd是一种利用ntp水解释放核酸的酶，在dna的复制与操作方面发挥着重要的作用。但是uvrd解旋酶在高盐、高ph以及高浓度甘油的溶液中表现为较低额核酸解链活性。申请人针对数据库中已公布的大肠杆菌的uvrd的c端的40个氨基酸残基进行删除突变，以及中间保守基序中的第258位脯氨酸定点突变为亮氨酸，拟通过研究得到一种可间接增强重组蛋白recam链置换活性、更耐受较高ph的解旋酶uvrd突变体。
[0097]
在本实施例中，申请人通过对数据库中已公布的大肠杆菌的uvrd的c端的40个氨基酸残基进行删除突变，以及中间保守基序中的第258位脯氨酸定点突变为亮氨酸后，得到解旋酶uvrd突变体基因序列。
[0098]
1)将解旋酶突变体目的基因片段的5’端添加bamhi酶切位点黏性末端序列，3’端添加sall酶切位点黏性末端序列，通过基因重组技术将突变体目的基因片段导入pet-28a载体中，构建重组表达载体。
[0099]
2)将重组表达载体通过42℃热激方式转入大肠杆菌，经过涂板-筛选等系列工作得到含目标基因的重组工程菌。
[0100]
3)对所述重组工程菌进行诱导培养，纯化后得到解旋酶uvrd。诱导表达的方法为：在重组工程菌的菌落od值为0.4～0.6时，加入终浓度为0.1mm/l的iptg(异丙基-β-d-硫代半乳糖苷)并在16℃诱导表达28h，固液分离收集沉淀，得到表达菌，再通过超声粉碎工程表达菌后固液分离收集上清，将上清采用亲和层析过柱后，再经阴离子层析纯化得到目标解旋酶uvrdm，其三维结构图如图6所示。
[0101]
上述的目标解旋酶uvrdm的基因序列如seq id no.3所示：atggacgtttcttacctgctcgacagccttaatgacaaacagcgcgaagcggtggccgcgccacgcagcaaccttctggtgctggcgggcgcgggcagtggtaagacgcgcgtactggtgcatcgtatcgcctggctgatgagcgtggaaaactgctcgccgtattcgattatggcggtgacgtttaccaacaaagcggcggcggagatgcgtcatcgtatcgggcaactgatgggcaccagccagggcggcatgtgggtcggcaccttccacgggctggcgcaccgcctgctgcgtgcgcaccatatggacgccaacctgccgcaggatttccagatcctcgacagcgaggaccagctacgcctgctcaaacgcctaatcaaggcgatgaacctcgacgagaagcagtggccgccgcgccaggcaatgtggtacatcaacagccagaaagatgaggggctgcgtccgcatcatattcagagctacggtaatccggtggagcagacctggcagaaggtgtatcaggcgtatcaggaagcgtgtgaccgcgcgggcctggtggacttcgccgagctgctgctacgtgctcacgagttgtggcttaacaagccgcatatccttcagcactatcgcgaacggtttaccaatatcctggtggacgaattccaggataccaacaacattcagtatgcgtggatccgactgctggcaggcgatactggcaaagtgatgatcgttggcgatgacgaccagtcaatctacggctggcgcggggcgcaggtcgagaatattcagcgtttcctcaatgatttccccggtgctgaaactatccgtctggagcagaactaccgctctaccagcaatattctgagcgccgctaacgccctgattgaaaacaataacgggcgtctgggtaaaaaactgtggaccgatggcgcggacggtgagcctatttccctctattgcgcttttaacgaactcgacgaagcgcgttttgtggttaaccgcatcaaaacctgg
caggacaacggcggggcgcttgccgagtgcgccattctctaccgcagcaacgcccagtcgcgtgtgctggaagaggcgttattgcaggcgagtatgccgtatcgtatttacggcgggatgcgcttcttcgaacgccaggaaatcaaagatgcgctctcgtatctgcgcctgattgccaaccgcaacgacgacgcggcctttgagcgtgtggtgaatacgccaacgcggggtattggtgaccggacgctggacgtggtacgtcagacatcgcgagatcgccagttaacactctggcaggcatgtcgtgaactgttgcaggaaaaagccctcgccggacgtgctgccagcgccttacagcggtttatggagctgatcgacgccttagcgcaggaaactgccgatatgccgctgcatgtacagactgaccgggtaattaaagactccggcctgcgcaccatgtacgagcaggagaagggcgaaaaaggtcagacgcgtatcgaaaacttagaggaactggtgacggcaacgcgccagttcagctacaacgaagaagacgaagatttaatgccgctgcaggcattcctctcccatgcggcgctggaagcgggcgaggggcaggcggatacctggcaggatgcggtgcagttgatgacgctacactcggcgaaaggtctggaattcctgcaggtgtttatcgttggtatggaagagggcatgttcccaagccagatgtcgctggatgaaggcgggcgtctggaagaagaacgccgtctggcctacgttggcgtaacccgcgcgatgcagaaactgacgctgacctacgcggaaacccgccgtctgtatggcaaagaggtttaccatcgcccgtcgcgctttatcggtgagttgccggaagagtgtgtggaagaggtgcgcctgcgcgccacggtaagccgcccggtcagccatcagcgtatgggtacgccgatggtcgagaacgacagcggctataagctcggccagcgcgtacgccacgctaagtaa
[0102]
解旋酶uvrdm的氨基酸序列如seq id no.4所示：mdvsylldslndkqreavaaprsnllvlagagsgktrvlvhriawlmsvencspysimavtftnkaaaemrhrigqlmgtsqggmwvgtfhglahrllrahhmdanlpqdfqildsedqlrllkrlikamnldekqwpprqamwyinsqkdeglrphhiqsygnpveqtwqkvyqayqeacdraglvdfaelllrahelwlnkphilqhyrerftnilvdefqdtnniqyawirllagdtgkvmivgdddqsiygwrgaqveniqrflndfpgaetirleqnyrstsnilsaanaliennngrlgkklwtdgadgepislycafneldearfvvnriktwqdnggalaecailyrsnaqsrvleeallqasmpyriyggmrfferqeikdalsylrlianrnddaafervvntptrgigdrtldvvrqtsrdrqltlwqacrellqekalagraasalqrfmelidalaqetadmplhvqtdrvikdsglrtmyeqekgekgqtrienleelvtatrqfsyneededlmplqaflshaaleagegqadtwqdavqlmtlhsakglefpqvfivgmeegmfpsqmsldeggrleeerrlayvgvtramqkltltyaetrrlygkevyhrpsrfigelpeecveevrlratvsrpvshqrmgtpmvendsgyklgqrvrhak
[0103]
得到目标解旋酶uvrdm后，采用解旋酶uvrdm与重组蛋白recam协同参与核酸扩增的方式，检测解旋酶uvrdm在较高ph条件下对重组蛋白recam链置换活性的影响。将含新型冠状病毒2019ncov-n基因的重组质粒由1ng/μl的浓度按10倍稀释至10-6
ng/μl，采用与实施例1相同的引物及表4所示的配置，在荧光定量pcr仪上进行反应，反应温度为37℃，反应时间40min，每30sec采集一次荧光。
[0104]
表4反应体系
[0105]
成分含量tris-hcl缓冲液(ph8.0)8mm氯化钾90mm氯化镁2.5mm聚乙二醇350002.5wt％dtt1.2mmatp2.5mm磷酸肌酸50mmdntps0.2mm
正向引物0.48μm反向引物0.48μm磷酸肌酸激酶15ng/μl重组蛋白recam240ng/μl解旋酶uvrdm40ng/μl单链dna结合蛋白ssb500ng/μlbsudna聚合酶120ng/μlsybrgreeni1
×
模板2μlnuclease-free(nf)waterto25μl
[0106]
(4)在较高ph条件下对重组蛋白recam链置换活性的影响进行研究，结果如图7所示：ph为8.0时，野生型大肠杆菌解旋酶uvrd刺激重组蛋白recam发挥较高链置换活性；而在ph为9.0时，本技术的解旋酶uvrdm刺激重组蛋白recam发挥较高链置换活性。
[0107]
实施例3：基于重组酶解旋酶介导的恒温扩增技术(rhma)在不同温度下的应用
[0108]
基于本技术的重组蛋白recam和解旋酶uvrdm，构建了一种重组酶介导的恒温扩增技术。将含新型冠状病毒2019ncov-n基因的重组质粒由1ng/μl的浓度按10倍稀释至10-7
ng/μl，采用与实施例1相同的引物(表2)及表4的反应体系配制，在荧光定量pcr仪上进行反应，分别在20℃、25、℃30℃、37℃、42℃的温度下反应40min，每30sec采集一次荧光。
[0109]
结果如图8所示，该反应试剂在20℃、25℃、30℃、37℃、42℃等温度下对所有模板均有扩增信号。
[0110]
实施例4：基于重组酶解旋酶介导的恒温扩增技术(rhma)在呼吸道病原体多重检测中应用
[0111]
本实施例以新冠病毒、甲型流感病毒h1n1、乙型流感病毒的检测为例，具体阐述重组酶介导的恒温扩增技术的应用。针对不同的微生物病原体，只需针对病原体的基因序列设计特异性引物即可，本实施例的引物由申请人设计，委托上海生工合成。
[0112]
具体通过如下步骤实现：选择新冠病毒orf1ab基因、甲型流感病毒h1n1的mp基因、乙型流感病毒mp基因，进行blast分析并分别设计特异性引物。所设计的引物仅对各自基因进行有效的恒温扩增。引物信息如表5所示(探针序列中，fam-dt表示携带荧光基团的胸腺嘧啶核苷酸，thf表示脱碱基类似物四氢呋喃，bhq-dt表示携带荧光淬灭基团的胸腺嘧啶核苷酸，c3 spacer表示间臂)。
[0113]
表5引物信息
[0114][0115]
在生物安全柜中使用takara minibest viral rna/dna extraction kit ver.5.0(takara:9766)核酸提取试剂盒提取含新型冠状病毒基因全序列的假病毒(上海翌圣：11900es03)、甲型hin1流感病毒核糖核酸(h1n1rna)液体室内质控品(广州邦德盛：bds-iqc-173)rna核酸以乙型流感病毒核糖核酸(ivbrna)液体室内质控品(yamagata株)(广州邦德盛：bds-iqc-316)的rna核酸。按照表6所示的反应体系配制后，盖上pcr管盖放入荧光定量pcr仪上进行扩增反应，反应温度为42℃，反应时间为40min，每30sec采集一次荧光。
[0116]
表6反应体系
[0117]
[0118][0119]
多重扩增结果如图9所示，除ntc没有起峰以外，新冠病毒、甲型流感病毒h3n2、乙型流感病毒均有扩增信号，这说明本技术的试剂可进行多重链置换扩增反应。
[0120]
实施例5：基于重组酶解旋酶介导的恒温扩增技术(rhma)检出灵敏度分析
[0121]
本实施例以副流感病毒1型hn基因质粒的检测为例，具体阐述重组酶解旋酶介导的恒温扩增技术(rhma)与对比试剂的分析灵敏度的比较过程。在实施例中，副流感病毒1型hn基因质粒由1ng/μl按照10倍浓度梯度往下稀释成10-1
ng/μl、10-2
ng/μl、10-3
ng/μl、10-4
ng/μl、10-5
ng/μl、10-6
ng/μl、10-7
ng/μl作为扩增反应的样本进行对比分析。
[0122]
具体通过如下步骤实现：选择副流感病毒1型hn基因经blast比对分析后设计特异性引物和exo探针。本实施例的引物由申请人设计，委托上海生工合成；引物信息如表7所示。
[0123]
表7引物信息
[0124][0125]
用购自杭州众测生物的rt-基础型核酸扩增试剂(raa法)添加exoiii核酸外切酶质粒dna进行扩增。按照表8所示的体系配制，配制后每个冻干反应管中加入48μl复溶液，复溶后再加入2μl核酸模板。
[0126]
表8raa反应体系
[0127][0128][0129]
25μl重组酶解旋酶介导的恒温扩增技术反应体系如表9所示。
[0130]
表9rhma反应体系
[0131]
成分含量tris-hcl缓冲液(ph8.0)10mm氯化钾90mm氯化镁2.5mm聚乙二醇350002.5wt％dtt1.2mmatp2.5mm磷酸肌酸50mmdntps0.2mm正向引物0.48μm反向引物0.48μm探针0.12μm磷酸肌酸激酶15ng/μl重组蛋白recam240ng/μl解旋酶uvrdm40ng/μl单链dna结合蛋白ssb500ng/μlbsudna聚合酶120ng/μlm-mlv逆转录酶2u/μlrnasin0.1u/μlexoiii2u/μl模板2μlnf-waterto25μl
[0132]
反应体系配制好后，盖上pcr管盖放入荧光定量pcr仪上进行扩增反应，反应温度为42℃，反应时间为40min，每30sec采集一次荧光。
[0133]
灵敏度分析结果如图10所示，杭州众测厂家的rt-基础型核酸扩增试剂(raa法)添
加exo iii核酸外切酶对质粒dna进行扩增，仅能检测到10-6
ng/μl的质粒浓度(图10中a)，但本技术所述的试剂可检测到10-7
ng/μl的浓度质粒(图10中b)，表明本技术的试剂比杭州众测厂家生产的rt-基础型核酸扩增试剂具有更高的检测灵敏度。
[0134]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0135]
以上所述实施例仅表达了本技术的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本技术构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本技术的保护范围。因此，本技术专利的保护范围应以所附权利要求为准。

技术特征：
1.一种用于核酸恒温扩增反应的酶组合产品，其特征在于，包括重组蛋白recam和解旋酶uvrdm；所述重组蛋白recam具有如seq id no.2所示的氨基酸序列；所述解旋酶uvrdm具有如seq id no.4所示的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的酶组合产品，其特征在于，编码所述重组蛋白recam的核苷酸序列如seq id no.1所示。3.根据权利要求1所述的酶组合产品，其特征在于，编码所述解旋酶uvrdm的核苷酸序列如seq idno.3所示。4.根据权利要求1至3任一项所述的酶组合产品，其特征在于，还包括单链dna结合蛋白、bsu dna聚合酶和磷酸肌酸激酶中的一种或多种。5.一种用于核酸恒温扩增反应的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1至4任一项所述的酶组合产品。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，还包括tris-hcl缓冲液、氯化钾、聚乙二醇35000、二硫苏糖醇、dntps、atp、磷酸肌酸、正向引物、反向引物、检测探针和氯化镁中的一种或多种。7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述检测探针的两端分别标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团。8.一种重组酶解旋酶介导的恒温扩增方法，其特征在于，包括如下步骤：以待测样本的dna或rna为模板；使用权利要求1至4任一项所述的酶组合产品或权利要求5至7任一项所述的试剂盒进行扩增。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述扩增的反应体系包括如下成分：
10.根据权利要求8至9任一项所述的方法，其特征在于，扩增的温度为20℃～42℃，扩增的时间为5min～40min。

技术总结
本申请提供了一种用于核酸恒温扩增反应的酶组合产品及其应用，所述重组酶组合产品包括重组蛋白RecAm和解旋酶UvrDm；所述重组蛋白RecAm具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；所述解旋酶UvrDm具有如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。本申请通过分子生物学和生物信息学方法，对RecA重组蛋白、解旋酶UvrD进行氨基酸突变筛选，筛选到的RecAm重组蛋白和解旋酶UvrDm用于核酸恒温扩增反应时能够提高对DNA的亲和力、降低对pH的敏感度以及对Mg


技术研发人员：张赛 李永聪 何凡 钱纯亘
受保护的技术使用者：深圳市卓润生物科技有限公司
技术研发日：2023.03.16
技术公布日：2023/7/12