增强免疫活性的硒化构树叶多糖的制备方法

1.本发明属于中草药多糖修饰合成技术领域，尤其涉及一种增强免疫活性的硒化构树叶多糖的制备方法。


背景技术：

2.抗生素的发现曾经挽救了成千上万的生命，但如今抗生素的滥用也给人类的生活带来了诸多问题。同时，畜禽养殖业也面临着高度依赖抗生素的问题，中草药的开发和利用显得格外重要，如何更好地发挥其药效更是研究的重点和关键。
3.多糖广泛存在于中药植物体中，具有多种生物学活性，如抗氧化，抗肿瘤，免疫调节等，植物多糖的改性可以更好地发挥多糖作用，而成为研究领域中的一大热点。硒多糖作为有机硒的一种主要形式，与常规的多糖相比，硒多糖具有更高的生物活性。目前硒多糖的研究在国内外尚出于起步阶段，但由于其独特的生物活性，近年来逐步成为研究热点。硒多糖的生物功能不仅集硒与多糖的优点于一身，还体现在硒与多糖结合为硒多糖后表现出了更高的生物活性，甚至可以产生新的生物学功能。大量研究表明，硒多糖在免疫调节，抗氧化，抗病毒，抗肿瘤，肾保护，抗衰老等方面发挥越来越大的作用。
4.构树叶最早被记录在《名医别录》中，具有凉血、利水的功效，可用于治疗多种类型的出血、水肿、疝气、痢疾等病症，现代研究表明构树叶具有抗菌、保肝、抗炎、抗氧化、降脂、调节免疫等多种生物活性。构树叶中的多糖和多酚也被证明具有体外抗氧化活性。此外，动物饲喂实验发现构树叶可以提高雏鸡的新城疫抗体水平，表明构树叶可能具有提高免疫力的作用。


技术实现要素：

5.本发明要解决的技术问题是提供一种设备要求低、操作简单易得、制作成本低、产物安全性高的增强免疫活性的硒化构树叶多糖的制备方法。
6.为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
7.增强免疫活性的硒化构树叶多糖的制备方法，利用硝酸-亚硒酸钠法对脱蛋白后的构树叶多糖进行反应，其中，反应温度为40-80℃，反应时间为5-9h，亚硒酸钠的用量为构树叶多糖质量的0.4-1.2倍。
8.反应温度为63℃，反应时间为7.5h，亚硒酸钠的用量为构树叶多糖质量的0.8倍。
9.上述硒化构树叶多糖的制备方法，按以下进行操作：取50ml体积分数为0.5％hno3溶解0.5g构树叶多糖，搅拌5min，混合0.4g亚硒酸钠与0.7g氯化钡进行反应至完全；冷却室温后，加入饱和na2co3溶液调节ph＝6-7，加入0.7gna2so4除去ba
2+
，反应5min后，3000rpm离心10min，收集上清液，将上清液用流水透析2d，将透析液减压浓缩，醇沉冻干，即得。
10.构树叶多糖按以下进行制备：
11.(1)将新鲜的构树叶干燥后粉碎成末，以液料比为1：5的比例浸泡石油醚脱除色素，在通风橱中回收已脱色的构树叶粉末；
12.(2)将预处理好的构树叶粉末以液料比为1：10的比例与纯水混合煮沸3h，重复2次，回收滤液并减压浓缩获得构树叶多糖溶液；静置至室温，缓慢搅拌加入4倍体积的无水乙醇后3000rpm离心10min，冻干后获得构树叶多糖。
13.脱蛋白按以下进行操作：配制sevage溶液，将sevage溶液缓慢倒入构树叶多糖溶液，搅拌20min后，3000rpm离心10min，去除中间蛋白层，向多糖溶液多次加入sevage溶液直至中间蛋白层消失，将上层多糖溶液浓缩至原体积的10％-20％，醇沉离心，再次冻干，即得。
14.sevage溶液为正丁醇：三氯乙酸＝1：4的混合溶液；sevage溶液与构树叶多糖溶液的体积比为1:4。
15.上述制备方法得到的硒化构树叶多糖。
16.上述硒化构树叶多糖用于制备畜禽用免疫增强剂。
17.针对硒化构树叶多糖制备技术欠缺的问题，发明人建立了一种增强免疫活性的硒化构树叶多糖的制备方法，利用硝酸-亚硒酸钠法对脱蛋白后的构树叶多糖进行反应，其中，反应温度为40-80℃，反应时间为5-9h，亚硒酸钠的用量为构树叶多糖质量的0.4-1.2倍。该法采用水煮醇沉得到的构树叶多糖，并经三氯乙酸法脱蛋白处理后，使用硝酸-亚硒酸钠法对构树叶多糖进行硒化。发明人进一步通过对反应温度、反应时间、亚硒酸钠的用量进行单因素的反应试验和三因素三水平的响应面优化试验，最终得到了硒化构树叶多糖提取的最佳制备工艺。
18.本发明制备工艺设备要求低，操作简单易得，制作成本低，产物安全性高；所得硒化构树叶多糖的硒含量高，生物活性强。通过体液免疫，黏膜免疫相关指标及细胞因子分子水平多角度共同研究表明，本发明所得经硒元素修饰后的构树叶多糖，在雏鸡喂食过程中，有一定的促生长作用，联用新城疫疫苗能增强免疫效果，对机体有免疫调节作用，具有成为提高机体免疫力的饲料添加剂的潜力。本发明的硒化构树叶多糖产品降低了以亚硒酸钠为代表的传统无机硒的生物毒性，其药效也优于构树叶多糖，为提高机体免疫力的中药学领域提供理论指导。
附图说明
19.图1为本发明硒化构树叶多糖制备方法的研究流程示意图。
20.图2为本发明制备所得硒化构树叶多糖对广西麻鸡adg的影响示意图。
21.图3为本发明制备所得硒化构树叶多糖对广西麻鸡血清抗体效价的影响示意图。
22.图4为本发明制备所得硒化构树叶多糖对广西麻鸡siga分泌的影响示意图。
23.图5为本发明制备所得硒化构树叶多糖对广西麻鸡il-2分泌的影响示意图。
24.图6为本发明制备所得硒化构树叶多糖对广西麻鸡ifn-γ分泌的影响示意图。
具体实施方式
25.实施例1硒化构树叶多糖制备的反应温度筛选
26.50ml体积分数为0.5％hno3溶解0.5g构树叶多糖，搅拌5min，混合0.5g亚硒酸钠与0.7g氯化钡，反应5h，反应温度分别为40℃，50℃，60℃，70℃，80℃；冷却室温后，加入饱和na2co3溶液调节ph＝6-7，加入0.7gna2so4除去ba
2+
，反应5min后离心(3000rpm，10min)，收集
上清液。将上清液用流水透析2d，将透析液减压浓缩，醇沉冻干。
27.取单因素反应温度试验的5个样品进行硒含量测定。与标准曲线对比，得出硒含量分别为15.74mg/g，16.94mg/g，17.56mg/g，6.83mg/g，6.74mg/g。
28.实施例2硒化构树叶多糖制备的反应时间筛选
29.50ml体积分数为0.5％hno3溶解0.5g构树叶多糖，搅拌5min，混合0.5g亚硒酸钠与0.7g氯化钡，反应60℃，反应时间为5h，6h，7h，8h，9h；冷却室温后，加入饱和na2co3溶液将ph＝6-7，加入0.7gna2so4除去ba
2+
，反应5min后离心(3000r，10min)，收集上清液。将上清液用流水透析2d，将透析液减压浓缩，醇沉冻干。
30.取单因素反应时间试验的5个样品进行硒含量测定。与标准曲线对比，得出硒含量分别为3.97mg/g，4.21mg/g，7.60mg/g，11.94mg/g，10.21mg/g。
31.实施例3硒化构树叶多糖制备的亚硒酸钠用量筛选
32.50ml体积分数为0.5％hno3溶解0.5g构树叶多糖，搅拌5min，混合的亚硒酸钠与0.7g氯化钡，反应5h，反应温度为60℃，亚硒酸钠的用量为200mg，300mg，400mg，500mg，600mg；冷却室温后，加入饱和na2co3溶液将ph＝6-7，加入0.7gna2so4除去ba
2+
，反应5min后离心(3000r，10min)，收集上清液。将上清液用流水透析2d，将透析液减压浓缩，醇沉冻干。
33.取单因素亚硒酸钠用量试验的5个样品进行硒含量测定。与标准曲线对比，得出硒含量分别为4.65mg/g，8.74mg/g，11.27mg/g，6.73mg/g，5.86mg/g。
34.实施例1至3中，标准曲线的建立和样品含量测定具体操作如下：
35.标准曲线的建立：取0.0ml，1.0ml，2.0ml，3.0ml，4.0ml，5.0ml的浓度为4μg/ml的硒标准溶液，加入1.0ml浓度为50g/l的edta-2na，1.5ml浓度为10g/l的邻苯二胺于试管内，滴入2滴浓度为6mol/l的盐酸，混合均匀，室温置于暗处环境反应50min，加入10.0ml环已烷，振摇3min，静置8min，转入分液漏斗，测环己烷层吸光度(波长＝330nm)。
36.样品测定：质量为0.02g的硒化构树叶多糖溶解2ml去离子水，加入1.0ml浓度为50g/l的edta-2na，1.5ml浓度为10g/l的邻苯二胺于试管内，滴入2滴浓度为6mol/ll的盐酸，混合均匀，室温置于暗处环境反应50min，加入10.0ml环已烷，振摇3min，静置8min，转入分液漏斗，测环己烷层吸光度(波长＝330nm)。
37.实施例4
38.在单因素试验的基础上，根据box-bchnken响应面试验方法进行三因素三水平试验(表1)，得出17种硒化构树叶多糖，与标准曲线对比，测得硒含量结果如下表2。
39.表1三因素三水平试验设计
[0040][0041]
表2三因素三水平试验硒含量结果
[0042][0043][0044]
通过建立的回归方程可以发现三个条件因素对硒化构树叶多糖的硒含量影响程度依次是反应时间＞反应温度＞亚硒酸钠的用量，分析得到最佳提取条件为：反应时间为7.56h，反应温度为63.42℃，亚硒酸钠的用量是407.32mg。结合实验操作的可行性，确定提取条件为：反应时间为7.5h，反应温度为63℃，亚硒酸钠的用量是407mg(约为构树叶多糖质量的0.8倍)。
[0045]
实施例5硒化构树叶多糖的生物学功能研究
[0046]
为研究最佳提取工艺下的硒化构树叶多糖的生物学功能，进行了广西麻鸡的养殖实验进行对新城疫疫苗的影响试验。本研究通过口服的方式对广西麻鸡进行硒化构树叶多糖的药效评估，以1g/kg的规格进行药物的混匀，通过日增重，血清效价，血清生化等方面研究口服构树叶多糖和硒化构树叶多糖对广西麻鸡的安全性。
[0047]
1方法
[0048]
1.1试验药品
[0049]
构树叶多糖：
[0050]
(1)将新鲜的构树叶干燥后粉碎成末，以液料比为1：5的比例浸泡石油醚脱除色素，在通风橱中回收已脱色的构树叶粉末；
[0051]
(2)将预处理好的构树叶粉末以液料比为1：10的比例与纯水混合煮沸3h，重复2
次，回收滤液并减压浓缩获得构树叶多糖溶液；静置至室温，缓慢搅拌加入4倍体积的无水乙醇后3000rpm离心10min，冻干即得构树叶多糖。
[0052]
(3)配制sevage溶液(正丁醇：三氯乙酸＝1：4)，将1体积sevage溶液缓慢倒入4体积构树叶多糖溶液，搅拌20min后，3000rpm离心10min，去除中间蛋白层，向多糖溶液多次加入sevage溶液直至中间蛋白层消失；将上层多糖溶液浓缩至原体积的10％-20％，醇沉离心(3000rpm、10min)，再次冻干，即得脱蛋白后的构树叶多糖。
[0053]
硒化构树叶多糖：50ml体积分数为0.5％hno3溶解0.5g(脱蛋白后的)构树叶多糖，搅拌5min，混合亚硒酸钠与0.7g氯化钡，反应时间为7.5h，反应温度为63℃，亚硒酸钠的用量是407mg；冷却室温后，加入饱和na2co3溶液将ph＝6-7，加入0.7gna2so4除去ba
2+
，反应5min后离心(3000rpm，10min)，收集上清液。将上清液用流水透析2d，将透析液减压浓缩，醇沉冻干，即得硒化构树叶多糖。
[0054]
黄芪多糖：将新鲜的黄芪干燥后以液料比为1：10的比例与纯水混合煮沸3h，重复2次，回收滤液并减压浓缩获得黄芪多糖溶液。静置至室温，缓慢搅拌加入4倍体积的乙醇并离心(3000rpm，10min)，减压浓缩冻干后获得试验所需的黄芪多糖。
[0055]
1.2试验动物的分组与给药
[0056]
1日龄非免疫的麻鸡，预饲7天后，随机分为4个组分别是空白组，疫苗对照组，构树叶多糖组，硒化构树叶多糖组，每组25只鸡；试验期间，空白组饲喂正常饮食至42d；疫苗对照组喂食含1g/kg的黄芪多糖拌料，正常饮水至42d；构树叶多糖组喂食1g/kg的构树叶多糖拌料，正常饮水至42d；硒化构树叶多糖喂食1g/kg的硒化构树叶多糖拌料，正常饮水至42d。
[0057]
试验至14天时，测母源抗体为2.5log2，除空白组以外，其余各组均进行新城疫疫苗一免，28天进行新城疫疫苗二免。
[0058]
1.3硒化构树叶多糖对鸡生长性能的影响
[0059]
于14、28、35、42d的早上10点对所有鸡只进行称重，计算鸡只在1-21d，22-42d试验期的adg。
[0060]
1.4硒化构树叶多糖对鸡血清抗体效价的影响
[0061]
于21，28，35，42d采样，收集所有动物的血清。
[0062]
1.4.1血凝试验
[0063]
在96孔v型微量血凝板1孔～12孔均加入25μlpbs。在第1孔中加入25μl抗原或病毒悬液，吹打3次～5次，充分混匀。将抗原或病毒悬液在反应板上进行系列倍比稀释，即从第1孔中吸取25μl悬液至第2孔，混匀后再吸取25μl悬液至第3孔，依次进行倍比稀释到第11孔，最后从第11孔吸取25μl弃去，第12孔不加抗原或病毒悬液，作为pbs对照。每孔加入25μl pbs。每孔加入25μl体积分数为1％的鸡红细胞悬液(将鸡红细胞悬液充分摇匀后加入)。将微量反应板在微型振荡器振荡混匀或轻扣反应板混匀反应物，室温静置20min～30min或2℃～8℃静置60min，当对照孔(第12孔)红细胞呈显著纽扣状时判定结果。
[0064]
结果判定：将反应板倾斜，观察红细胞有无泪珠状流淌。以完全凝集(不流淌)的最高稀释倍数为抗原或病毒悬液的血凝效价。完全凝集的病毒的最高稀释倍数为1个血凝单位(hau)。
[0065]
1.4.2血凝抑制试验
[0066]
根据测得抗原或病毒悬液血凝效价配制4单位抗原(4hau)。4hau的配制方法如下：
假设抗原的血凝效价为8log2(1：256)，则4hau抗原的稀释倍数应是1：64(256除以4)，稀释时，将1ml抗原加入63ml pbs中即为4hau抗原。
[0067]
hau检测：4单位抗原应现用现配，在使用前进行标定。将配制的4hau进行系列稀释，使最终稀释度分别为1：2、1：3、1：4.1：5、1：6和1：7，然后按照1.4.1进行血凝试验。如果配制的抗原液为4hau，则1：4稀释度将给出凝集终点；如果4hau高于4个单位，可能1：5或1：6为终点；如果较低，可能1：2或1：3为终点。应根据检验结果将抗原稀释度做适当调整，使工作液确为4hau。
[0068]
取96孔v型微量血凝板，用移液器在第1孔～第11孔各加人25μl pbs，第12孔加人50μl pbs。在第1孔加入25μl血清，充分混匀后移出25μl至第2孔，依次类推，倍比稀释至第10孔，并从第10孔弃除25μl.在第1孔～第11孔各加入25μl4hau抗原，振荡15s，使液体混合均匀，室温静置至少20min或2℃～8℃至少60min。在第1孔～第12孔每孔加入25μl1％的鸡红细胞悬液，振荡混匀，室温静置20min～40min或2℃～8℃静置40min～60min，对照孔红细胞呈显著纽扣状时判定结果。第11孔为抗原对照，第12孔为pbs对照，每次测定还应设已知效价的标准阳性血清和阴性血清作对照。
[0069]
结果判定：将反应板倾斜，从背侧观察加样孔底部的红细胞是否呈泪痕状流淌。以完全抑制4hau抗原的最高血清稀释倍数为该血清的hi抗体效价。只有当阴性血清对照孔血清效价≤2log2，阳性血清对照孔血清效价与标定效价相差≤1个滴度，红细胞对照无自凝现象时，试验结果有效。hi效价≤3log2，判为hi试验阴性；hi效价≥4log2判为hi试验阳性。
[0070]
1.5硒化构树叶多糖对siga、tnf-γ、il-2的影响
[0071]
于21，28，35，42d采样，收集所有动物的血清。
[0072]
1.6数据统计分析
[0073]
所得数据均在spss22.0统计软件进行单因素方差分析，判断差异是否显著。
[0074]
2结果
[0075]
2.1硒化构树叶多糖对鸡生长性能的影响
[0076]
表3硒化构树叶多糖对鸡生长性能的影响
[0077][0078]
如表3和图2所示，疫苗对照组在22-42d的试验期间与空白组有差异性(p＜0.05)，构树叶多糖组在22-42d的试验期间与空白组有差异性(p＜0.05)，硒化构树叶多糖在22-42d的试验期间adg与空白组差异性显著(p＜0.001)，说明1g/kg的硒化构树叶多糖药性安全无毒，对广西麻鸡也有促生长作用，这可能与硒化构树叶多糖中的硒元素有关。
[0079]
2.2硒化构树叶多糖对鸡血清抗体效价的影响
[0080]
表4硒化构树叶多糖对鸡血清抗体效价的影响
[0081][0082]
如表4和图3所示，鸡抗体血清呈现先上升后下降的趋势，这与文献报道的一致，硒化构树叶多糖在28d到达峰值，在后续养殖过程中持续发挥药效。综上可知，硒化构树叶多糖有提高新城疫抗体效价的效果。
[0083]
2.3硒化构树叶多糖对siga、inf-γ、il-2的影响
[0084]
表5硒化构树叶多糖对siga的影响
[0085][0086]
如表5和图4所示，在21天时，构树叶多糖siga的分泌与空白组差异显著(p＜0.005)，硒化构树叶多糖siga的分泌与空白组差异极其显著(p＜0.001)；在28天时，硒化构树叶多糖siga的分泌与空白组差异极显著(p＜0.001)；在35天时，构树叶多糖siga的分泌与空白组差异显著(p＜0.05)，硒化构树叶多糖siga的分泌与空白组差异极显著(p＜0.005)；在42天时，硒化构树叶多糖siga的分泌比空白组差异极其显著(p＜0.001)。
[0087]
表6硒化构树叶多糖对il-2分泌水平的影响
[0088][0089]
如表6和图5所示，在21天时，构树叶多糖和硒化构树叶多糖分泌il-2的含量较空白组差异极其显著(p＜0.001)；在28天时，硒化构树叶多糖分泌il-2的含量较空白组差异极其显著(p＜0.001)；在35天时，构树叶多糖分泌il-2的含量较空白组差异极显著(p＜0.005)，硒化构树叶多糖分泌il-2的含量较空白组差异极其显著(p＜0.001)；在42天时，硒化构树叶多糖分泌il-2的含量较空白组差异极其显著(p＜0.001)。
[0090]
表7硒化构树叶多糖对ifn-γ的影响
[0091][0092]
如表7和图6所示，在21d时，疫苗对照组，构树叶多糖，硒化构树叶多糖分泌的ifn-γ含量较于空白组差异极其显著(p＜0.001)；在28d时，构树叶多糖分泌的ifn-γ含量较于空白组差异极显著(p＜0.005)，疫苗对照组、硒化构树叶多糖分泌的ifn-γ含量较于空白
组差异极其显著(p＜0.001)；在35d时，硒化构树叶多糖分泌的ifn-γ含量较于空白组差异显著(p＜0.01)；在42d时，硒化构树叶多糖分泌的ifn-γ含量较于空白组差异极其显著(p＜0.001)。以上结果表明，硒化构树叶多糖能够增强机体免疫，促进畜禽生长。

技术特征：
1.一种增强免疫活性的硒化构树叶多糖的制备方法，其特征在于利用硝酸-亚硒酸钠法对脱蛋白后的构树叶多糖进行反应，其中，反应温度为40-80℃，反应时间为5-9h，亚硒酸钠的用量为构树叶多糖质量的0.4-1.2倍。2.根据权利要求1所述的硒化构树叶多糖的制备方法，其特征在于：所述反应温度为63℃，反应时间为7.5h，亚硒酸钠的用量为构树叶多糖质量的0.8倍。3.根据权利要求2所述的硒化构树叶多糖的制备方法，其特征在于按以下进行操作：取50ml体积分数为0.5％hno3溶解0.5g构树叶多糖，搅拌5min，混合0.4g亚硒酸钠与0.7g氯化钡进行反应至完全；冷却室温后，加入饱和na2co3溶液调节ph＝6-7，加入0.7gna2so4除去ba
2+
，反应5min后3000rpm离心10min，收集上清液，将上清液用流水透析2d，将透析液减压浓缩，醇沉冻干，即得。4.根据权利要求1所述的硒化构树叶多糖的制备方法，其特征在于所述构树叶多糖按以下进行制备：(1)将新鲜的构树叶干燥后粉碎成末，以液料比为1：5的比例浸泡石油醚脱除色素，在通风橱中回收已脱色的构树叶粉末；(2)将预处理好的构树叶粉末以液料比为1：10的比例与纯水混合煮沸3h，重复2次，回收滤液并减压浓缩获得构树叶多糖溶液；静置至室温，缓慢搅拌加入4倍体积的无水乙醇后3000rpm离心10min，冻干后获得构树叶多糖。5.根据权利要求4所述的硒化构树叶多糖的制备方法，其特征在于所述脱蛋白按以下进行操作：配制sevage溶液，将sevage溶液缓慢倒入构树叶多糖溶液，搅拌20min后，3000rpm离心10min，去除中间蛋白层，向多糖溶液多次加入sevage溶液直至中间蛋白层消失，将上层多糖溶液浓缩至原体积的10％-20％，醇沉离心，再次冻干，即得。6.根据权利要求5所述的硒化构树叶多糖的制备方法，其特征在于：所述sevage溶液为正丁醇：三氯乙酸＝1：4的混合溶液。7.根据权利要求5所述的硒化构树叶多糖的制备方法，其特征在于：所述sevage溶液与构树叶多糖溶液的体积比为1；4。8.权利要求1至7任一所述制备方法得到的硒化构树叶多糖。9.权利要求8所述硒化构树叶多糖用于制备畜禽用免疫增强剂。

技术总结
本发明公开了一种增强免疫活性的硒化构树叶多糖的制备方法，利用硝酸-亚硒酸钠法对脱蛋白后的构树叶多糖进行反应，其中，反应温度为40-80℃，反应时间为5-9h，亚硒酸钠的用量为构树叶多糖质量的0.4-1.2倍。本发明制备工艺设备要求低，操作简单易得，制作成本低，产物安全性高；所得硒化构树叶多糖的硒含量高，生物活性强。本发明所得经硒元素修饰后的构树叶多糖，在雏鸡喂食过程中，有一定的促生长作用，联用新城疫疫苗能增强免疫效果，对机体有免疫调节作用，具有成为提高机体免疫力的饲料添加剂的潜力。本发明的硒化构树叶多糖产品降低了以亚硒酸钠为代表的传统无机硒的生物毒性，其药效也优于构树叶多糖，为提高机体免疫力的中药学领域提供理论指导。药学领域提供理论指导。


技术研发人员：司红彬 张丽芳 胡红杰 杨蒙 莫家豪 张志丹
受保护的技术使用者：广西大学
技术研发日：2023.03.13
技术公布日：2023/7/12