RFC4在GBM诊断和提高GBM化疗疗效中的应用

rfc4在gbm诊断和提高gbm化疗疗效中的应用
技术领域
1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种rfc4在gbm诊断和提高gbm化疗疗效中的应用。


背景技术：

2.胶质母细胞瘤(glioblastoma multiforme，gbm)是一种恶性程度极高、预后最差的胶质瘤，属who分级ⅳ级。手术联合放化疗是治疗胶质母细胞瘤的主要手段，替莫唑胺(temozolomide,tmz)是临床上化疗的一线常用药物之一，主要通过诱导dna损伤发挥作用，但由此引发一系列细胞dna修复反应，致使gbm对替莫唑胺产生耐药性，导致化疗失败。阐明替莫唑胺耐药的调控网络机制有利于提高gbm的治疗效率，延长病人生存期。
3.胶质母细胞瘤对替莫唑胺产生耐药是限制临床治疗的关键瓶颈，针对替莫唑胺耐药性的研究是当前治疗的重点和难点。本专利通过研究首次发现替莫唑胺激活复制因子c4亚基——rfc4蛋白，同时敲低rfc4蛋白明显抑制替莫唑胺激活的自噬过程。自噬作为细胞中的重要修复机制，现有研究报道可受替莫唑胺刺激激活，自噬激活后降解受损的细胞器、长寿命蛋白等，为细胞修复提供所需的能量以维持肿瘤细胞的稳定，抑制肿瘤细胞凋亡，临床研究证实抑制自噬可一定程度上增强gbm的化疗敏感性，但是具体作用模式并不清楚，并且由于针对的自噬调控靶点不同导致治疗效果良莠不齐。因此，明确gbm中替莫唑胺作用下自噬的激活特征，参与调控的具体靶点蛋白以及作用方式，对提高gbm中替莫唑胺的治疗效果具有重要的指导意义。
4.现有技术中，公开号为cn114672566a的发明专利公开了rfc4基因作为宫颈病变诊断标志物的应用，该发明通过检测宫颈病变组织中rfc4基因的表达水平，能够判断宫颈病变的程度。然而未发现有关胶质母细胞瘤中rfc4蛋白的相关资料。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种复制因子c亚基4(replication factor csubunit 4,rfc4)作为生物标志物在制备用于诊断胶质母细胞瘤的试剂中的应用，本发明研究发现rfc4在胶质母细胞瘤中高表达。
6.为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
7.rfc4蛋白作为生物标志物在制备用于诊断胶质母细胞瘤的试剂中的应用。
8.进一步，所述rfc4蛋白的gene id：5984。
9.进一步，所述rfc4蛋白在胶质母细胞瘤中高表达。
10.本发明的目的之二在于提供一种rfc4抑制剂在制备增强胶质母细胞瘤中替莫唑胺治疗敏感性的药物中的应用，本发明研究发现rfc4通过自噬影响胶质母细胞对替莫唑胺的敏感性，通过抑制rfc4蛋白，可有效提高胶质瘤患者生存期。
11.为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
12.rfc4抑制剂在制备增强胶质母细胞瘤中替莫唑胺治疗敏感性的药物中的应用。
13.进一步，所述rfc4抑制剂通过调控gbm中自噬相关基因来抑制替莫唑胺诱导的自噬过程，进而调控胶质母细胞对替莫唑胺的敏感性。
14.进一步，所述胶质母细胞为ln229细胞、u251细胞和/或ln18细胞。
15.进一步，所述自噬相关基因包括lc3b—ii、becn1和/或atg5。
16.本发明的目的之三在于提供一种rfc4抑制剂在制备用于降低胶质母细胞瘤中替莫唑胺诱导的自噬激活的药物中的应用，本发明研究发现rfc4对胶质母细胞瘤替莫唑胺治疗引发的自噬过程具有明显的激活调控作用。
17.本发明的目的之四在于提供一种rfc4抑制剂在制备用于抑制胶质瘤细胞增殖的药物中的应用。
18.为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
19.rfc4抑制剂在制备用于抑制胶质瘤细胞增殖的药物中的应用。
20.进一步，rfc4过表达促进细胞周期g1期到s期的转换。
21.本发明的目的之五在于提供一种rfc4抑制剂和替莫唑胺的联合应用在制备用于治疗胶质母细胞瘤的药物组合物中的应用。
22.本发明的目的之六在于提供一种用于治疗胶质母细胞瘤的药物组合物。
23.为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
24.用于治疗胶质母细胞瘤的药物组合物，所述药物组合物包括rfc4抑制剂和替莫唑胺。
25.本发明的有益效果在于：
26.1.本专利研究发现，在胶质母细胞瘤中，rfc4表达明显上调并降低细胞对替莫唑胺的敏感性；rfc4对自噬过程具有明显的激活调控，并通过自噬影响胶质母细胞对替莫唑胺的敏感性。本发明阐明了rfc4对自噬的诱导作用以及对替莫唑胺敏感性的影响，为解决替莫唑胺临床应用的耐药性问题提供新的治疗靶点，提高患者生存率。
27.2.本发明研究发现rfc4高表达与胶质瘤患者生存期短密切相关，并且rfc4可促进细胞周期g1期到s期的转换，表明rfc4过表达可明显促进胶质瘤细胞的增殖。
附图说明
28.图1为gepia数据库分析rfc4在多种肿瘤中的表达情况的结果图；
29.图2为利用生物软件(gliovis,ualcan)分析gbm中rfc4的表达的结果图；
30.图3-图4为利用生物软件(gliovis,cgga)分析rfc4在不同级别胶质瘤中的表达的结果图；
31.图5-图6为tcga数据库分析lgg和gbm中rfc4蛋白表达与患者的短生存期密切相关的结果图；
32.图7-图8为替莫唑胺刺激ln18细胞检测rfc4蛋白、自噬标记蛋白lc3b的表达的结果图；
33.图9为替莫唑胺刺激ln18细胞检测rfc蛋白mrna的表达变化的结果图；
34.图10为富集分析rfc4影响的差异基因组的结果图；
35.图11为过表达rfc4后检测ln18对替莫唑胺的敏感性的结果图；
36.图12为过表达rfc4后检测u251对替莫唑胺的敏感性的结果图；
37.图13为靶向rfc4的shrna敲低rfc4的表达后检测ln229细胞对替莫唑胺的敏感性的结果图；
38.图14为靶向rfc4的shrna敲低rfc4的表达后检测u251细胞对替莫唑胺的敏感性的结果图；
39.图15为cgga数据库分析rfc4与自噬关键基因lc3b—ii的相关性的结果图；
40.图16为cgga数据库分析rfc4与自噬关键基因becn1的相关性的结果图；
41.图17为cgga数据库分析rfc4与自噬关键基因atg5的相关性的结果图；
42.图18-图19为rfc4过表达稳转株中转染egfp-mrfp-lc3b双荧光标记质粒，激光共聚焦检测荧光强度的结果图；
43.图20为rnaseq分析rfc4稳转株与对照组细胞，差异基因组结果与gbm中的自噬相关基因以及rfc4的相关基因做交集的结果图；
44.图21为透射电镜检测rfc4过表达细胞的结果图；
45.图22为替莫唑胺处理rfc4敲低细胞的检测结果图(ln229细胞)；
46.图23为替莫唑胺处理rfc4敲低细胞的检测结果图(u251细胞)；
47.图24-图25为rfc4敲低稳转株中转染egfp-mrfp-lc3b双荧光标记质粒，替莫唑胺刺激后激光共聚焦检测荧光强度的结果图，图25中，“*”表示p＜0.05，“**”表示p＜0.01；
48.图26为ln229细胞加入替莫唑胺/氯喹处理后的染色结果图；
49.图27为ln229细胞加入替莫唑胺/氯喹处理后测定的吸光度值的统计图，其中，“*”表示p＜0.05，“**”表示p＜0.01，“#”表示p＜0.05。
具体实施方式
50.下面将结合具体的实施例对本发明的技术方案进行更进一步地清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例。因此，基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的其他所有实施例都属于本发明的保护范围。
51.本发明实施例中，替莫唑胺购自selleck公司，批号为s1237；cck8购自碧云天，批号为c0037，lipofectamine2000转染试剂购自thermo fisher scientific公司，批号为11668019，嘌呤霉素购自thermo fisher scientific公司，批号为a1113803。
52.本发明实施例中，ln18细胞来源于atcc细胞库，编号为crl-2610；ln229细胞来源：细胞来源于atcc细胞库，编号为crl-2611；u251细胞来源：细胞来源于中国科学院细胞库，编号为tchu 58。
53.本发明实施例中，仪器信息如下：伯乐chemidoc western成像分析仪，型号chemidoc；伯乐cfx96 touch实时荧光定量pcr仪；激光扫描共聚焦描显微镜，型号为奥林巴斯fv3000。
54.本发明实施例中，过表达病毒质粒以及干扰慢病毒质粒委托上海生博生物医药科技有限公司合成；rnaseq委托诺禾致源生物公司进行实验；透射电镜检测rfc4过表达细胞委托普瑞赛斯公司进行实验。
55.实施例1
56.利用gliovis数据库(http://gliovis.bioinfo.cnio.es/)以及cgga数据库
(http://www.cgga.org.cn/)分析胶质瘤患者mrna数据，分析rfc4在gbm中的表达情况。结果如图1-图4所示，rfc4在多种肿瘤中的表达均上调，并且与低级别胶质瘤相比，在gbm中显著上调。
57.实施例2
58.利用gliovis数据库(http://gliovis.bioinfo.cnio.es/)以及cgga数据库(http://www.cgga.org.cn/)分析胶质瘤患者mrna数据，分析lgg和gbm中rfc4蛋白表达与胶质瘤患者生存期之间的关系。结果如图5-图6所示，rfc4高表达与胶质瘤患者短生存期密切相关。
59.实施例3
60.分别使用梯度浓度(100-800μm)的替莫唑胺处理ln18细胞，24小时后收取细胞western blot检测rfc4蛋白、自噬标记蛋白lc3b的表达，以及利用real-time pcr检测rfc4基因mrna的表达变化。结果如图7-图9所示，替莫唑胺可以刺激rfc4的蛋白表达明显上调，且呈浓度依赖性。
61.实施例4
62.利用lipofectamine2000转染试剂将rfc4过表达慢病毒质粒转染进胶质瘤细胞系，嘌呤霉素(2μg/ml)筛选阳性细胞株，利用rnaseq检测rfc4过表达细胞株的转录组水平并富集分析rfc4影响的差异基因组。结果如图10所示，rfc4过表达可促进细胞周期g1期到s期的转换，表明rfc4过表达可明显促进胶质瘤细胞的增殖。
63.实施例5
64.利用lipofectamine2000转染试剂将rfc4过表达/rfc4敲低慢病毒质粒转染进细胞系构建rfc4过表达及敲低的细胞株，嘌呤霉素(2μg/ml)筛选阳性细胞株，并使用梯度替莫唑胺处理，cck8检测细胞活性。结果如图11-图14所示，rfc4明显影响胶质瘤细胞株对替莫唑胺的敏感性，rfc4高表达可降低胶质母细胞株对替莫唑胺的敏感性。
65.实施例6
66.利用cgga数据库(http://www.cgga.org.cn/)分析rfc4与自噬关键基因lc3b—ii、becn1、atg5的相关性；并在rfc4过表达稳转株中转染egfp-mrfp-lc3b双荧光标记质粒，激光共聚焦检测荧光强度；结果如图15-图21所示，rfc4与自噬关键基因lc3b—ii、becn1、atg5密切相关，rnaseq分析rfc4稳转株与对照组细胞，差异基因组结果与gbm中的自噬相关基因以及rfc4的相关基因做交集，结果发现rfc4可以调控多个自噬相关基因；透射电镜检测rfc4过表达细胞，结果在rfc4过表达细胞株中自噬体数量明显增多。本实施例在构建的rfc4过表达细胞株中检测自噬点以及自噬体，发现rfc4过表达可明显促进自噬体的生成。
67.实施例7
68.利用靶向rfc4的shrna敲低rfc4，puromycin筛选稳定株，发现敲低rfc4后可明显抑制替莫唑胺诱导的自噬激活。如图22-图23所示，替莫唑胺处理rfc4敲低细胞，在不同时间段收集细胞western blot检测，rfc4的蛋白降低明显逆转了替莫唑胺刺激的lc3b蛋白和becn1蛋白的上调、p62蛋白的下调。同时，在rfc4敲低稳转株中转染egfp-mrfp-lc3b双荧光标记质粒，替莫唑胺刺激后激光共聚焦检测荧光强度，image j统计荧光点，结果详见图24-图25。以上结果表明，抑制rfc4蛋白可明显逆转替莫唑胺刺激的自噬激活。
69.实施例8
70.构建ln229细胞rfc4过表达细胞株，克隆形成检测替莫唑胺敏感性，具体的，ln229细胞计数后定量均匀铺于六孔板，加替莫唑胺/氯喹(chloroquine,clq)处理后结晶紫染色，后用醋酸溶解并测吸光度值。结果如图26-图27所示，rfc4明显降低ln229细胞对替莫唑胺的敏感性，但利用氯喹抑制自噬后可明显升高ln229细胞对替莫唑胺的敏感性。以上结果表明，rfc4通过自噬调控胶质母细胞对替莫唑胺的敏感性。

技术特征：
1.rfc4蛋白作为生物标志物在制备用于诊断胶质母细胞瘤的试剂中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述rfc4蛋白在胶质母细胞瘤中高表达。3.rfc4抑制剂在制备增强胶质母细胞瘤中替莫唑胺治疗敏感性的药物中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述rfc4抑制剂通过调控gbm中自噬相关基因来抑制替莫唑胺诱导的自噬过程，进而调控胶质母细胞对替莫唑胺的敏感性。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述胶质母细胞为ln229细胞、u251细胞和/或ln18细胞。6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述自噬相关基因包括lc3b—ii、becn1和/或atg5。7.rfc4抑制剂在制备用于降低胶质母细胞瘤中替莫唑胺诱导的自噬激活的药物中的应用。8.rfc4抑制剂在制备用于抑制胶质瘤细胞增殖的药物中的应用。9.rfc4抑制剂和替莫唑胺的联合应用在制备用于治疗胶质母细胞瘤的药物组合物中的应用。10.用于治疗胶质母细胞瘤的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括rfc4抑制剂和替莫唑胺。

技术总结
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种RFC4在GBM诊断和提高GBM化疗疗效中的应用。具体包括，RFC4抑制剂在制备增强胶质母细胞瘤中替莫唑胺治疗敏感性、降低胶质母细胞瘤中替莫唑胺诱导的自噬激活的药物、抑制胶质瘤细胞增殖中的应用等。本专利研究发现，在胶质母细胞瘤中RFC4表达明显上调并降低细胞对替莫唑胺的敏感性；RFC4对自噬过程具有明显的激活调控，并且通过自噬影响胶质母细胞对替莫唑胺的敏感性。本发明阐明了RFC4对自噬的诱导作用以及对替莫唑胺敏感性的影响，为解决替莫唑胺临床应用的耐药性问题提供新的治疗靶点，提高患者生存率。者生存率。者生存率。


技术研发人员：毛敏
受保护的技术使用者：四川大学华西第二医院
技术研发日：2023.03.03
技术公布日：2023/7/12