一种猪流行性腹泻病毒株及其在疫苗制备中的应用的制作方法

1.本发明涉及兽用生物制品技术领域，具体涉及一种猪流行性腹泻病毒株pedv-aq株，及由猪流行性腹泻病毒株pedv-aq株制备的疫苗组合物。


背景技术：

2.猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea，ped)首先在欧洲被发现后，逐步传入美洲和亚洲。猪流行性腹泻病毒主要宿主为猪，各种年龄阶段的猪均易感，尤其以哺乳仔猪感染后的损失最大，由于刚出生的仔猪消化系统以及免疫系统不完善，因此感染后出现很高的腹泻率和腹泻死亡率，严重影响猪场的生产秩序和经济效益。2010年以来，广东、广西、四川等南部省区先后暴发ped，给我国养猪业造成了非常严重的经济损失。自2019年非洲猪瘟在我国全面爆发以来，在生物安全控制水平大幅提高的背景下，此病依然没有减轻的趋势，且目前已上市应用的各类猪流行性腹泻相关疫苗免疫控制疫病流行的效果均不理想，猪流行性腹泻成为猪场疫病防控过程中最为棘手的问题。
3.ped的病原为猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，pedv)，属于冠状病毒科冠状病毒属，其遗物质为rna，基因组约为28kb。猪流行性腹泻病毒的结构蛋白主要包括s蛋白、e蛋白、m蛋白和n蛋白。其中s蛋白是位于病毒粒子表面的纤突糖蛋白，参与病毒及宿主细胞的吸附和融合，同时它也是诱导宿主产生中和抗体的主要抗原分子。猪流行性腹泻病毒的s蛋白可以分为s1和s2两个结构域。s蛋白也是猪流行性腹泻病毒变异的主要结构蛋白，编码s蛋白的基因的变异比对是划分毒株的主要靶基因。以rna为遗传物质的病毒在复制过程中修正错误的聚合酶较少或者活性较低，rna在复制时出现的错误的修正效率较低，这就增加了rna病毒的变异情况。
4.2010年以来，由于国外传入、pedv的自身变异以及长期使用疫苗的免疫压力等多种因素导致我国pedv流行毒株发生了较大改变。最新的流行病学调查研究结果表明中国境内流行的毒株以变异毒株g2亚群为主，同时存在g1亚群。虽然g1亚群与g2亚群存在交叉保护力，但是较弱。在市售的商品化pedv疫苗毒株在中国应用较早的是g1亚群毒株疫苗，在临床上获得了比较好的效果，2010年后g2亚群毒株在中国开始流行，g2亚群毒株疫苗逐步上市，也有较好的免疫效果。但是随着不同基因型的野毒株中间继续重组和变异，造成猪场免疫的疫苗不对型，产生的抗体不能有效的发挥特异性中和效应，在临床上就表现为现有商品化疫苗保护力不够。
5.现有的pedv疫苗毒株多为从猪场分离毒株方式获得，由于pedv病毒变异快速，因此从猪场分离获得发生变异的pedv毒株，对于pedv的疫苗的制备和应用具有重要意义，也是难度较大的一项工作。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种猪流行性腹泻病毒株及其在疫苗制备中的应用，所提供的猪流行性腹泻病毒株的抗原蛋白基因发生了变异，为一新型的变异病毒株，将该病毒株
可作为抗原来制备疫苗。
7.本发明首先提供一种猪流行性腹泻病毒pedv-aq株，该病毒株于2021年8月5日保藏于中国武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno:v202164。
8.本发明所提供的猪流行性腹泻病毒pedv-aq株，其s基因的氨基酸序列为seq id no:1；
9.本发明所提供的猪流行性腹泻病毒pedv-aq株可用于制备疫苗；
10.所述的疫苗，作为实施例的一种具体记载，为灭活疫苗；
11.本发明再一个方面还提供一种灭活疫苗，其中所使用的抗原为灭活的猪流行性腹泻病毒pedv-aq株；
12.所述的灭活，作为实施例的一种记载，是使用甲醛进行灭活。
13.本发明的病毒株，其另一个用途是用于制备中和抗体。
14.本发明分离得到的猪流行性腹泻病毒pedv-aq株制成的灭活疫苗能显著降低仔猪的腹泻率和死亡率，对仔猪的保护效果显著优于市售疫苗。
附图说明
15.图1为支原体外源检测结果；
16.图2为猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、蓝耳病毒外源检测结果；
17.图3为rt-pcr检测不同代次的猪流行性腹泻病毒g2亚型株病毒培养物；其中：1为阴性对照，2为阳性对照，3-7为第2、4、6、8、10代猪流行性腹泻病毒培养上清；
18.图4为s基因编码的氨基酸同源性进化树分析图；
19.图5为pedv-aq株感染vero细胞的透射电镜照片图；
20.图6为间接免疫荧光鉴定照片图。
具体实施方式
21.本发明实施例中所述灭活疫苗是指先对病毒或细菌进行培养，然后用加热或化学剂(通常是β-丙内酯或福尔马林)将其灭活。灭活疫苗即可由整个病毒或细菌组成，也可由它们的裂解片段组成为裂解疫苗。
22.本发明实施例中所述抗体效价是用抗体的物理状态及其在体内的滞留时间，以其与抗原反应的多少来表示其免疫效果的一种反应。
23.下面结合实施例和附图对本发明进行详细的描述。
24.实施例1病毒的分离与鉴定
25.1、样品
26.2020年江西省某规模化猪场在使用猪流行性腹泻病毒商品化疫苗后，4月份仍发生了猪腹泻疫情。无菌解剖获取腹泻病死仔猪的部分肠道组织及内容物。
27.2、病毒的分离与外源病原检测
28.将肠道样品先用液氮处理后，用研钵研磨，按1∶5(w/v)比例加无菌的pbs(0.1mol/l，ph7.2)继续匀浆，反复冻融3次后6000r/min离心10min，取上清液经0.22um滤器过滤除菌，得组织过滤液，无菌检验合格后保存备用。
29.将vero细胞复苏后在培养瓶中使用含有10％胎牛血清的dmem培养基中培养，待细
胞长成致密单层时候，打入pbs缓冲液，浸润20min，然后倒掉，如此反复使用pbs清洗3遍，待用。
30.使用无菌的dmem将组织过滤液按照10％的体积比进行稀释；然后按照20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml三个梯度向稀释后的组织过滤液中添加猪胰蛋白酶，37℃、二氧化碳培养箱孵育2h；将抚育好的病毒液加入到致密单层的vero细胞当中后放置37℃、二氧化碳培养箱培养。
31.阴性对照组：无菌的dmem中加入20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml猪胰蛋白酶后，分别加入到致密单层的vero细胞当中，接入vero细胞中后放置37℃、二氧化碳培养箱培养。继续培养72h，间隔24h观察细胞状态，并且将培养物-80℃保存。
32.将第一代培养物冻融4次后按照10％的比例，分别加入含20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml三个梯度猪胰蛋白酶的dmem中，37℃温箱培养2h后，三组全部加入为2％胎牛血清dmem。将抚育好的病毒液加入到致密单层的vero细胞当中后放置37℃、二氧化碳培养箱培养。同时设定阴性对照组。间隔24h观察细胞状态，继续培养72h，并且将培养物-80℃保存。
33.如此操作盲传至第10代，观察逐渐开始产生蚀斑病变。同时设置空白细胞作为对照。按照以上方法进行连续传代培养，直至在20代出现明显的蚀斑病变，而阴性对照组细胞正常。盲传之后挑取出现明显病变的病毒液进行分装，-80℃冻存，即为分离得到的毒株。
34.进一步对上述获得的分离毒株进行外源病原检测。将分离毒株在vero细胞上盲传至100代，通过pcr方法检测分离得到的毒株中是否混有支原体、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒和蓝耳病毒。
35.结果如图1和图2所示，本发明所述分离毒株的第90代、第95代和第100代次细胞均未检测到支原体、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒和蓝耳病毒。
36.3、病毒的鉴定
37.(1)pcr鉴定
38.将分离毒株在vero细胞上继续进行10代传代，并在此过程中挑选第2、4、6、8、10代次细胞培养物分别各取250μl，使用total rna kit ii试剂盒(omega)提取rna。将提取后的rna进行反转录，反应体系如下：6μl的rna与1μl oligo(dt)混合均匀，70℃10min，降温2min。向该混合液中加入2μl 5
×
buffer，0.5μl 10mm的dntp mix，0.25μl mlv反转录酶及0.25μl rnase inhibitor。混匀后按如下条件反应：42℃，60min；70℃，15min。反转录后的cdna用以下引物进行pcr扩增。
39.鉴定引物
40.上游引物nf：5
′‑
cggttctcacagatagtgag-3
′
；
41.下游引物nr：5
′‑
cgctagaaaaacactcagtaat-3
′
。
42.反应体系为：cdna1μl，2
×
taq mix 12.5μl，10μm/ml的上下游引物各0.5μl，补加去离子水至25μl，混合均匀。pcr反应条件如下：95℃预变性5min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸2min，反应30个循环；72℃延伸10min。pcr结束后，将pcr扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。
43.结果如图3所示，本发明所述分离毒株从第2代开始一直到第10代，不同代次细胞培养物样品均检测到特异性的阳性条带。从而说明，该分离毒株为猪流行性腹泻病毒。
44.将分离毒株进行连续传代，此过程中分别挑选第2、4、6、8、10代次细胞培养物进行
pcr鉴定。鉴定结果如图5所示，第2、4、6、8、10代细胞培养上清pcr扩增均为阳性。
45.(2)s蛋白鉴定
46.提取分离毒株的基因组rna；并进行反转录及pcr扩增(rna提取和反转录体系及反应条件同上述步骤2)。反转录后的cdna用下述引物进行pcr：分段扩增s基因。
47.引物s1f：5
′‑
tagtgatgttgtgttag-3
′
；
48.引物s1r：5
′‑
cgctgcacagcagctc-3
′
；
49.引物s2f：5
′‑
cataccagaaggttttag-3
′
；
50.引物s2r：5
′‑
gtaatcaactcaccctt-3
′
；
51.引物s3f：5
′‑
ttaccctgagtttggtagtg-3
′
；
52.引物s3r：5
′‑
tccgtctgtagagcaagat-3
′
；
53.引物s4f：5
′‑
cttcacatgtatagtgcgtct-3
′
；
54.引物s4r：5
′‑
cagactttgagacatctttgac-3
′
。
55.测序结果显示，该分离毒株的s基因编码的氨基酸序列为seq id no:1，具体序列如下：
56.mtpliyfwlflpvlltlslpqdvtrcqstinfrrffskfnvqapavvvlggyl
57.psmnssswycgtgietdsgvhgiflsyidsgqgfeigisqepfdpsgyqlylhkatn
58.gntsaiarlricqfpdnktlgptvndvttgrnclsnkaipalqdgknifigitwdn
59.drvtvfadkiyhfyikndwsrvatrcynkrscamqyvytptyymlnvtsaged
60.giyyepctancsgyaanvfatdsnghipegfsfnnwfllsndsttafgkvvsnqpl
61.lvnclwaipriyglgqffsfnqtmdgvcngaaaqrapealrfnindtfvilaegsi
62.vlhtalgtnlsfvcsnssdphkaiftiplgvtevpyycflkvdtykstvykflavl
63.pptvkeivitkygdvyvngfgylhlglldavtinftghgtdddvsgfwtvastnf
64.vdalievqgtaiqrilycddpvsqlkcsqvsfdlddgfypissrnllsheqpisfvt
65.lpsfndhsfvnitvsaafgghsganliasdttingfssfcvdtrqftitlfynvtns
66.ygyvsksqdsncpftlqsvndylsfskfcvstsllagactidlfgypefgsgvkft
67.slyfqftkgelitgtpkplqgvtdvsfmtldvctkytiygfkgegiitltnssflag
68.vyytsdsgqllafknvtsgavysvtpcsfseqaayvdddivgvisslsnstfnntr
69.elpgffyhsndgsnctepvlvysnigvcksgsigyvplqdgqvkiapmvtgnisip
70.tnfsmsirteylqlyntpvsvdcvtyvcngnsrckqlltqytaacktiesalqls
71.arlesvevnsmltiseealqlatissfngdgynftnvlgvsvydpasgrvvqkgsf
72.iedllfnkvvtnglgtvdedykrcsngrsvadlvcaqyysgvmvlpgvvdaek
73.lhmysasliggmalgglttaaalpfshavqarlnylalqtdvlqrnqqllaesf
74.nsaignitsafesvkeaisqtsnglntvahaltkvqevvnsqgsaltqltiqlqhn
75.fqaisssiddiysrldilsadvqvdrlitgrlsalnafvaqtltkytevqasrklaq
76.qkvnecvksqsqrygfcggdgehifslvqaapqgllflhtvlvpgdfvnviaidg
77.lcvngdialtlrepglvlfthelqtytateylvssrrmfeprkptvsdfvqiescv
78.vtyvnltsdqlpdvipdyidvnktldeilaslpnrigpslpldvfnatylnltgeia
79.dleqrseslrntteelrsliyninntlvdlewlnrvetyikwpwwvwliifivlifv
80.vsllvfccistgccgccgccgacfsgccrgprlqpyeafekvhvq。
81.进一步将seq id no:1与其他猪流行性腹泻病毒株的s蛋白序列进行氨基酸同源性进化树分析(图4)，其同源性比对结果见表1。
82.表1：猪流行性腹泻病毒株s蛋白同源性比较表
83.[0084][0085]
从图4可以看出，该分离株属于g1群。从而说明，本发明所述分离毒株是一个猪流行性腹泻病毒g1亚型流行毒株。
[0086]
从表1的结果可知，该分离株与猪流行性腹泻病毒cv777经典株的s蛋白序列同源性最高，为99.6％。比对结果显示：与cv777株相比，该分离毒株s蛋白coe中和表位发生如下突变：第159位氨基酸由v突变为f，第169位氨基酸由v突变为i，第264位氨基酸由l突变为t，第265位氨基酸由l突变为a，第266位氨基酸由h突变为f，第285位氨基酸由r突变为k。
[0087]
(3)电镜观察鉴定
[0088]
将分离毒株感染vero细胞单层后，分别于24h、36h和48h时，用细胞刮收取细胞，800r/min离心后，收集细胞并用2.5％戊二醛电镜固定液固定，制作超薄切片并用醋酸铀和柠檬酸铅染色，电子显微镜观察病毒形态。
[0089]
结果如图5所示，感染分离毒株的vero细胞中能观察到典型猪流行性腹泻病毒(pedv)粒子。从而说明，本发明所述分离毒株为猪流行性腹泻病毒，且在vero细胞中稳定增殖。
[0090]
(4)间接免疫荧光检测
[0091]
使用12孔板培养vero细胞，长至单层后接种分离毒株第5代病毒培养物，同时设立不接毒的vero细胞作阴性对照。培养36h后在显微镜下观察细胞病变情况，轻轻吸弃培养液，用4℃预冷的pbs洗涤细胞3次。每孔加入500μl-20℃预冷的丙酮，将培养板置4℃冰箱固
定15min。pbs洗涤3次，每次5min。每孔加入500μl 5％的脱脂奶粉封闭30min。弃掉脱脂奶粉，用pbs轻轻洗涤2次，每次3min。向孔内滴加适当稀释后的一抗(鼠抗pedv 6c8单克隆抗体(bionote，seoul，korea))各200μl，于37℃作用1h。pbs洗涤3次，每次5min；滴加fitc(异硫氰酸荧光素)标记的山羊抗鼠igg二抗(1：20000)，37℃作用30min，pbs洗涤3次，每次5min。每孔加入500μlpbs，于倒置荧光显微镜下观察并拍照。实验过程中需设置只加一抗不加二抗和只加二抗不加一抗的阴性对照。
[0092]
结果如图6所示，阴性对照孔均无荧光；阳性对照孔及接种分离毒株的孔均在细胞浆中呈现荧光；只加一抗和只加二抗的阴性对照孔没有荧光背景。从而说明，本发明所述分离毒株是猪流行性腹泻病毒，其具有良好的抗原性。
[0093]
(5)传代对病毒毒力的影响
[0094]
使用病毒滴度tcid
50
检测方法检测连续传代对分离毒株的效价影响：采用微量滴定法测定分离毒株毒价，具体方法如下：采用vero细胞进行病毒滴度的测定。用96孔细胞培养板培养vero细胞，将分离毒株用不加血清的dmem从10-1
倍比稀释至10-10
，分别将每个稀释度的100μl病毒液接种到铺满vero细胞的培养孔，每个稀释度接种8孔，同时设置阴性细胞对照孔。置37℃，5％ co2培养箱中培养，4天观察细胞感染病毒情况，计算病毒滴度。结果显示，培养后的第2、4、6、8、10代次细胞培养物病毒毒价均可达10
8.5
tcid
50
/ml以上。
[0095]
上述结果表明，传代并未影响本发明所述分离毒株的毒力。
[0096]
(6)动物回归实验
[0097]
取猪流行性腹泻病毒中和抗体均小于1：8的母猪所产的3日龄仔猪5头，每头口服本发明所述分离毒株第5代103个tcid
50
，观察7日，统计接种猪的发病情况，并对试验猪进行剖检，观察病理变化。取发病猪肠粘膜和内容物，提取rna，按实施例1所述方法进行rt-pcr检测，并将pcr产物进行序列测定。
[0098]
结果显示，5头仔猪全部发病，发病率为100％，5头仔猪死亡，死亡率为100％，发病猪表现为腹泻，脱水，个别猪出现呕吐，剖检观察发现胃和小肠出现典型的病理变化。从发病猪的肠粘膜及内容物中可扩增出1326bp的片段，经序列分析为本发明所述分离毒株的特异性基因。
[0099]
综上所述，本发明获得的分离毒株是猪流行性腹泻病毒，命名为猪流行性腹泻病毒pedv-aq株，已于2021年8月5日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no:v202164。
[0100]
实施例2猪流行性腹泻病毒pedv-aq株灭活疫苗的制备与检验
[0101]
从液氮罐中取出vero细胞冻存管，立即放入37℃水浴融化。将细胞悬液加入5-10mldmem液的离心管内，800r/min离心5分钟。弃掉上清液，加入10％血清的dmem液悬浮细胞，加入细胞培养瓶中，置于37℃培养。vero细胞生长良好的单层后用胰酶液消化，进行细胞传代培养。经过连续传代后，将生长致密度为100％的vero细胞弃掉培养基，按照体积比1％比例加入流行性腹泻病毒pedv-aq株毒种的细胞维持液，37℃培养。接毒后，每日观察细胞病变，当细胞病变为80％以上时候，冻融3次收获细胞培养物。经过检验所收获的猪流行性腹泻病毒pedv-aq株病毒液效价可达10
8.5
tcid
50
/ml。
[0102]
将培养所收获的猪流行性腹泻病毒pedv-aq株病毒液按照0.1％的体积比加入甲醛溶液，搅拌30分钟。将含有0.1％甲醛的病毒液输入至另一灭活容器中，37℃条件下灭活
12h，期间每隔3-6小时搅拌一次，每次60分钟。灭活后的病毒液放置在2-8℃保存。将灭活病毒液取样，按照现行《中国兽药典》附录进行检验，确定无菌生长。
[0103]
将灭活的病毒液用维持液10倍稀释后接种于vero细胞中，每瓶1ml。37℃吸附2小时，弃掉接种液，加入细胞维持液，同时设不接毒的vero细胞对照。置于37℃培养5天，无细胞病变。按照以上方式盲传3代，均无细胞病变。
[0104]
将灭活检验合格的病毒液与等量含量为20％的灭活氢氧化铝盐水稀释液均匀混合，在室温下沉淀24小时，吸出2/5以上清液，即按全量浓缩至3/5,加入终含量为1/1.5万的硫柳汞溶液，充分混合，即为制成的pedv-aq株灭活疫苗。
[0105]
实施例3pedv-aq株灭活疫苗的检验
[0106]
1、pedv-aq株灭活疫苗的检验
[0107]
参照现行《中国兽药典》相关检验方法对实施例2制备的猪流行性腹泻病毒pedv-aq株灭活苗进行检验。按现行《中国兽药典》附录方法对上述灭活疫苗进行无菌检验及其他性状检验均合格。
[0108]
2、pedv-aq株灭活疫苗的安全性试验
[0109]
试验选用本发明制备的检验合格的pedv-aq株灭活疫苗。
[0110]
(1)仔猪的安全性试验
[0111]
颈部肌肉接种pedv抗原和抗体阴性的8-10日龄仔猪5头，间隔15日二免。首次免疫和二免接种双倍剂量4ml/头，第二次免疫后连续观察14天，观察仔猪的接种部位及临床症状。同时设立对照组2头，不做任何处理。试验结果见表2。
[0112]
表2：pedv-aq株灭活疫苗双倍剂量安全试验表(仔猪)
[0113][0114]
免疫组5头仔猪接种本发明制备的pedv-aq株灭活疫苗后，连续观察14天，精神、饮食正常，体温未见升高，未见腹泻相关临床症状。二免后14天剖杀，取接种部位进行病理切片观察，未见异常；说明该疫苗对仔猪安全。
[0115]
(2)母猪的安全性试验
[0116]
颈部肌肉接种pedv抗原和抗体阴性的怀孕母猪5头，产前6周进行第一次免疫，产
前3周进行第二次免疫，首次免疫和二免接种双倍剂量4ml/头。观察接种部位情况，统计母猪产仔数量及质量。同时设立对照组2头不做任何处理。试验结果见表3。
[0117]
表3：pedv-aq株灭活疫苗灭活疫苗双倍剂量安全试验表(母猪)
[0118][0119]
5头怀孕母猪接种本发明制备的pedv-aq株灭活疫苗后未见明显临床症状，接种部位无异常情况。观察至母猪分娩，免疫组和对照组仔猪均无弱仔、流产和死胎情况。免疫组和对照组平均产仔数没有明显差异，说明该疫苗对母猪安全。
[0120]
实施例4：猪流行性腹泻病毒pedv-aq株灭活疫苗的免疫效力比较试验
[0121]
1、pedv-aq株灭活疫苗的仔猪免疫效力检验
[0122]
选择7头pedv抗原和抗体阴性的8-10日龄仔猪用于本试验。将仔猪随机分为2组，第一组为pedv-aq株灭活疫苗免疫组，5头，颈部肌肉接种，2ml/头；第二组为空白对照组，2头，不做任何处理。首免后15日进行二免，免疫后观察接种部位炎症情况及仔猪的临床症状，二免2周开始每周采血，检测血清中pedv中和抗体效价。结果见表4。
[0123]
表4：pedv-aq株灭活疫苗免疫仔猪后中和抗体结果表
[0124][0125]
免疫组仔猪接种部位均未见红肿、硬块、结痂等炎症反应，未见明显异常临床症状。血清中pedv中和抗体结果显示，pedv-aq株灭活疫苗免疫组在免后第2周，5头仔猪的中和抗体均大于1:32，在免后第4周达到最高峰，免后第五周之后逐渐下降。该试验结果表明，对于8-10日龄仔猪，pedv-aq株灭活疫苗免疫效力良好，免疫力持续时间长。
[0126]
2、pedv-aq株灭活疫苗的母猪免疫效力检验
[0127]
选择11头pedv抗原和抗体阴性的后备母猪用于本试验。将后备母猪随机分为3组，第一组为疫苗1免疫组，5头，颈部肌肉接种，2ml/头；第二组为疫苗2免疫组，5头，颈部肌肉接种，2ml/头；第三组为空白对照组，2头，不做任何处理。产前7周首免，产前4周二免，免疫后观察接种部位炎症情况及母猪的临床症状，二免后2周开始每周采血，检测血清中pedv中和抗体效价。结果见表5。
[0128]
表5：pedv-aq株灭活疫苗免疫后备母猪后中和抗体结果表
[0129][0130]
免疫组母猪猪接种部位均未见红肿、硬块、结痂等炎症反应，未见明显异常临床症状。血清中pedv中和抗体结果显示，pedv-aq株灭活疫苗组在免后第2周，所有母猪的中和抗体均大于1:32，在免后第4周达到最高峰，免后第五周之后逐渐下降。该试验结果表明，本发明pedv-aq株灭活疫苗接种母猪后，能产生较高的中和抗体，且能维持在相对较高的水平，具有良好的免疫效力。
[0131]
实施例5pedv-aq株灭活苗的攻毒保护比较试验
[0132]
选择4头产期相同的健康母猪，pedv抗体抗原阴性。其中2头母猪接种本发明制备的pedv-aq株灭活疫苗，2头母猪接种市售猪流行性腹泻病毒(pedv)灭活疫苗。4头母猪均于产前7周进行首免，颈部肌肉接种，2ml/头，产前4周以相同方法进行二免。
[0133]
pedv-aq株灭活疫苗和pedv商品疫苗免疫的母猪生产后，各选5头状态良好的仔猪用于攻毒试验。仔猪均采用母乳喂养。仔猪7日龄时，进行口服攻毒(0.5
×
[0134]
10
3.0
tcid
50
/ml，2ml/头)，仔猪分组及攻毒情况见表6。
[0135]
表6：pedv灭活疫苗免疫仔猪后攻毒保护比较结果表
[0136][0137]
从表6的结果可知，与市售pedv灭活疫苗相比，本发明提供的pedv-aq株灭活疫苗对流行毒株的攻击具有更好的保护性能。pedv-aq株灭活疫苗免疫的母猪生产的仔猪在攻毒后全部获得保护，而市售pedv灭活疫苗对流行毒株的攻击保护率仅为2/5。从而说明，本发明制备的pedv-aq株灭活疫苗对于pedv-aq株的具有更好的免疫保护效果。
[0138]
实施例6猪流行性腹泻病毒pedv-aq株灭活疫苗的临床试验
[0139]
在样品分离地区的，存在猪流行性腹泻病毒感染的规模化猪场进行实验，每个猪场分为挑选同胎次产期相同的健康妊娠母猪40头，随机分组为1、2、3、4共4组，分别按照表7所述方法进行免疫，免疫后统计各猪场母猪生产的仔猪的平均腹泻率和平均死亡率，比较不同猪流行性腹泻病毒疫苗对于仔猪的保护情况，具体结果见表8。
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表7：妊娠母猪免疫方案表
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表8：免疫后的妊娠母猪生产的仔猪腹泻率和死亡率统计表
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从表7、表8的统计结果可知，注射本发明所述猪流行性腹泻病毒pedv-aq株灭活疫苗进行两次免疫的1组妊娠母猪生产的仔猪平均腹泻率仅为12％，平均死亡率仅为8％，远低于注射市售疫苗免疫的2、3、4组妊娠母猪生产的仔猪。从而说明本发明分离得到的猪流行性腹泻病毒pedv-aq株制成的灭活疫苗能显著降低仔猪的腹泻率和死亡率，对仔猪的保护效果显著优于市售疫苗。

技术特征：
1.一种猪流行性腹泻病毒，其特征在于，所述的病毒的保藏编号为cctccno:v202164。2.如权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒，其特征在于，所述病毒的s蛋白的氨基酸序列为seq id no:1。3.权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒在制备疫苗中的应用。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的疫苗为灭活疫苗。5.一种灭活疫苗，其特征在于，所述的灭活疫苗中的抗原为灭活的权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒。6.如权利要求5所述的灭活疫苗，其特征在于，所述的灭活，是使用甲醛进行灭活。7.如权利要求5所述的灭活疫苗，其特征在于，所述的灭活疫苗中还包含有其它病毒的疫苗株。8.权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒在制备中和抗体中的应用。

技术总结
本发明提供一种猪流行性腹泻病毒株及其在疫苗制备中的应用，所提供的猪流行性腹泻病毒株的抗原蛋白基因发生了变异，为一新型的变异病毒株，该病毒株可作为抗原来制备疫苗。本发明所提供的猪流行性腹泻病毒PEDV-AQ株，其保藏编号为CCTCC NO:V202164。本发明分离得到的猪流行性腹泻病毒PEDV-AQ株制成的灭活疫苗能显著降低仔猪的腹泻率和死亡率，对仔猪的保护效果显著优于市售疫苗。护效果显著优于市售疫苗。


技术研发人员：王麒文 徐宏军 李义星 侯晓岚 张艳平 董婷婷 杨杰华 赵玉惠 王少沛 李文华 张孝智 高杰 王宗祥 韩娜
受保护的技术使用者：青岛蔚蓝生物股份有限公司
技术研发日：2023.03.27
技术公布日：2023/7/17