用于组织工程化的纤维素结合结构域(CBD)细胞效应蛋白(CEP)嵌合体

用于组织工程化的纤维素结合结构域(cbd)细胞效应蛋白(cep)嵌合体
发明领域
1.本公开内容总体上涉及用于产生纤维和其他非各向同性组织，特别是培养的肉的新颖的生长诱导/操作支架。具体地，本发明涉及与细胞效应蛋白(cep)融合的重组纤维素结合结构域(cbd)，该cep结合到纤维素纤维支架。
2.背景
3.细胞外基质(ecm)是由细胞外大分子、小分子、效应蛋白和矿物质组成的三维网络，是细胞生长、增殖和分化的重要调节因子。此外，它有助于组织秩序和方向，确保产生良好发挥功能的组织。然而，在这个阶段，没有可用的技术允许成本有效地模拟ecm环境和体外组织生成。在组织工程化领域的最新技术中，支架的使用是一个关键组成部分。然而，现有技术缺乏提供类似ecm的环境的能力。有许多类型的支架，包括多孔的、纤维的、水凝胶的、微球的和无细胞的支架，它们虽然作为支持结构运转，但不能使细胞定向分布；它们需要针对每种类型的细胞的复杂操作；与细胞生存力降低有关；并且有时产生酸性副产品。
4.生长因子通过指导细胞的命运和允许组织的形成，在组织工程化中起着至关重要的作用。然而，由于自然存在的变化，生长因子有失去其生物活性的趋势。已经开发了一些策略来克服这一缺点，包括使用特定的材料，如水凝胶(例如明胶、藻酸盐)和疏水聚合物(例如聚己内酯)；然而，短半衰期和不稳定性仍然是高效组织工程化的主要障碍。
5.因此，对能够有效地产生有序和功能性的组织，真正模仿自然的组织生成的组织工程化支架仍然存在需求。
6.发明概述
7.结合组合物和方法来描述并说明了以下实施方案及其方面，这些组合物和方法意为示例性和说明性的，而不限制范围。在多种实施方案中，一种或更多种上述问题被减少或消除，而其他实施方案涉及其他优点或改进。
8.根据一些实施方案，提供了用于体外组织工程化的嵌合多肽以及利用其的系统和方法。
9.本文公开的嵌合多肽包含碳水化合物结合模块(cbm)，优选地纤维素结合结构域(cbd)；细胞效应蛋白(cep)；以及将cbd连接到cep的接头。本文公开的多肽被有利地配置为提供定制的环境，其提供产生期望的组织所需的特异性、顺序、方向和功能。
10.根据一些实施方案，接头可以包含裂解位点，所述裂解位点的特征在于能够被位点特异性蛋白酶以预定的裂解效率裂解，使得当多肽暴露于蛋白酶时，获得cep从cbd的持续释放。这有利地增加了cep的半衰期，从而提高了组织工程化系统的效率。
11.根据一些实施方案，嵌合蛋白结合到或能够结合到用作组织生长支架的纤维素纤维的纤维或层(a fiber or layer of cellulose fibers)。有利的是，可以利用多于一个支架，从而能够产生复杂的组织(即，包括多于一种类型的细胞的组织，诸如但不限于包含脂肪(adipose)和肌肉组织两者的组织)。
12.根据一些实施方案，提供了用于在体外组织工程化中使用的嵌合多肽，该多肽包
含碳水化合物结合模块(cbm)；细胞效应蛋白(cep)；以及将cbm连接到cep的接头，其中所述接头包含裂解位点，所述裂解位点的特征在于能够被位点特异性蛋白酶以预定裂解效率裂解，使得当多肽暴露于蛋白酶时，获得cep从cbm的持续释放。
13.根据一些实施方案，cbm是纤维素结合结构域(cbd)。根据一些实施方案，cbd与seq id no:1(elqlnlkvefynsqpsdttnsinpqfkvtntgssaidlskltlryyytv dgqkdqtfwcdhaaiigsqgsyngitsnvkgtfvkmssstnnadtyle isftggtlepgahvqiqgrfakndwsqytqsndysfksasqfvewdqv taylngvlvwgkepggsvvpstqpvttppattkppattipps)中列出的氨基酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％序列同源性。每种可能性是单独的实施方案。
14.根据一些实施方案，接头具有5-50个氨基酸、5-25个氨基酸、5-20个氨基酸、10-25个氨基酸的长度或5-50个氨基酸范围内的任何其他合适的长度。每种可能性是单独的实施方案。
15.根据一些实施方案，接头与seq id no:2(gagggsgggsgggsaggg)中列出的氨基酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％序列同源性。每种可能性是单独的实施方案。
16.根据一些实施方案，裂解位点可以具有seq id no:3(enlyfqg)或seq id no:4(enlyfsg)中列出的氨基酸序列。
17.根据一些实施方案，裂解位点位于cep的n’末端上游约5个氨基酸或更少，或cep的c’末端下游约5个氨基酸或更少。根据一些实施方案，裂解位点可以与接头邻接。根据一些实施方案，编码接头-裂解位点-肽的氨基酸可以与seq id no:5(gagggsgggsgggsagggenlyfxg)中列出的氨基酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％序列同源性。每种可能性是单独的实施方案。
18.根据一些实施方案，编码接头-裂解位点-cbd-肽的氨基酸可以与seq id no:6(elqlnlkvefynsqpsdttnsinpqfkvtntgssaidlskltlryyytv dgqkdqtfwcdhaaiigsqgsyngitsnvkgtfvkmssstnnadtyleisftggtlepgahvqiqgrfakndwsqytqsndysfksasqfvewdqvtaylngvlvwgkepggsvvpstqpvttppattkppattippsgagggsgggsgggsagggenlyfxg)，其中x＝q或s中列出的氨基酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％序列同源性。每种可能性是单独的实施方案。
19.根据一些实施方案，cep选自：生长因子、激素、促凋亡因子、抗凋亡因子、血管生长因子、细胞分化因子、骨生长因子、细胞生存力所需的其他蛋白如转铁蛋白，或其组合。每种可能性是单独的实施方案。根据一些实施方案，cep是细胞分化因子、生长因子或生长激素。每种可能性是单独的实施方案。
20.根据一些实施方案，cep可以是选自fgf2、igf1、tgfβ1、egf、lif、激活蛋白a、nrg1、pdgf、il6、il13或其任何组合的细胞因子或生长因子。每种可能性是单独的实施方案。
21.根据一些实施方案，cep可以是牛fgf2的同种型，其与seq id no:7(pslpedggsgafppghfkdpkrlycknggfflrihpdgrvdgvreksd phiklqlqaeergvvsikgvcanrylamkedgrllaskcvtdecfffe rlesnnyntyrsrkysswyvalkrtgqyklgpktgpgqkailflpmsa ks)中列出的氨基酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％序列同源性。每种可能性是单独的实施方案。
22.根据一些实施方案，嵌合多肽还可以包括er驻留信号。根据一些实施方案，驻留信号可以具有seq id no:8(kdel)中列出的氨基酸序列。
23.根据一些实施方案，嵌合多肽可以包含与seq id no:9(elqlnlkvefynsqpsdttnsinpqfkvtntgssaidlskltlryyytv dgqkdqtfwcdhaaiigsqgsyngitsnvkgtfvkmssstnnadtyleisftggtlepgahvqiqgrfakndwsqytqsndysfksasqfvewdqvtaylngvlvwgkepggsvvpstqpvttppattkppattippsgagggsgggsgggsagggenlyfxgpslpedggsgafppghfkdpkrlycknggfflrihpdgrvdgvreksdphiklqlqaeergvvsikgvcanrylamkedgrllaskcvtdecffferlesnnyntyrsrkysswyvalkrtgqyklgpktgpgqkailflpmsakskdel)，其中x＝q或s中列出氨基酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％序列同源性的序列。每种可能性是单独的实施方案。
24.根据一些实施方案，在裂解时，cep可以包括c-末端甘氨酸(裂解位点的残留物)和er驻留信号。
25.作为非限制性实例，在裂解后，嵌合多肽可以包含与seq id no:10(gpslpedggsgafppghfkdpkrlycknggfflrihpdgrvdgvreks dphiklqlqaeergvvsikgvcanrylamkedgrllaskcvtdecfff erlesnnyntyrsrkysswyvalkrtgqyklgpktgpgqkailflpms akskdel)中列出的氨基酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％序列同源性的序列。
26.根据一些实施方案，裂解位点被修饰以提供与裂解位点的未修饰版本相比更低的裂解效率。根据一些实施方案，修饰包括一个或更多个氨基酸的缺失、一个或更多个氨基酸的添加或一个或更多个氨基酸的取代。每种可能性是单独的实施方案。根据一些实施方案，修饰包括一个或更多个氨基酸的化学修饰。作为非限制性实例，tev蛋白酶识别位点的p’1位置(c末端)处的甘氨酸侧链可以改变，而对蛋白水解效率产生很小的影响doi:10.1016/s0006-291x(02)00574-0。
27.根据一些实施方案，裂解位点是在正常哺乳动物细胞生长条件下具有低于1.5
×
103m-1
s-1
、低于1
×
103m-1
s-1
、或低于0.5
×
103m-1
s-1
的催化效率(k
cat
/km)的蛋白酶的裂解位点。每种可能性是单独的实施方案。
28.根据一些实施方案，裂解位点被定位成使得cep在从cbd释放时具有生物活性。根据一些实施方案，裂解位点被定位成使得cep仅在从cbd释放时具有生物活性。根据一些实施方案，作为裂解的结果，cep仅在从cbd释放时具有生物活性。根据一些实施方案，与cep的游离形式相比，当结合到cbd和/或接头时，cep的半衰期更长。根据一些实施方案，接头增加了cbd的半衰期。
29.根据一些实施方案，提供了体外组织工程化系统，其包含本文公开的多肽和至少一层和/或至少一条纤维素。
30.根据一些实施方案，系统包含至少两层和/或至少两条纤维素。根据一些实施方案，至少两层和/或至少两条中的每一层和/或每一条都与包括不同cep的嵌合肽缔合。
31.根据一些实施方案，所述至少一层包含至少两种类型的嵌合多肽，每种类型的嵌合多肽包含不同的cep。根据一些实施方案，两种类型的嵌合多肽中的第一种包含分化因子，并且两种类型的嵌合多肽中的第二种包含与分化相关的生长因子。
32.根据一些实施方案，两种类型的嵌合多肽中的第一种的接头包含含有第一裂解位
点的接头，第一裂解位点的特征在于能够被位点特异性蛋白酶以第一预定裂解效率裂解，并且两种类型的嵌合多肽中的第二种包含含有第二裂解位点的接头，第二裂解位点的特征在于能够被位点特异性蛋白酶以第二预定裂解效率裂解，第二裂解效率低于第一裂解效率。
33.根据一些实施方案，提供了包含本文公开的嵌合多肽的载体。根据一些实施方案，载体是(pcambia载体)，如图3所示。
34.根据一些实施方案，提供了用于体外组织工程化的方法，该方法包括：
35.a.提供包含至少一层和/或至少一条纤维素的细胞生长培养基；所述至少一层纤维素包含嵌合多肽，该嵌合多肽包含：纤维素结合结构域(cbd)、细胞效应蛋白(cep)；和将cbd连接到cep的接头，其中接头包含特征在于能够被位点特异性蛋白酶裂解的裂解位点；
36.b.在至少一层纤维素上接种哺乳动物细胞；
37.c.将至少一层纤维素暴露于位点特异性蛋白酶，使得cep可持续地释放到细胞生长培养基中；
38.d.培养细胞直至获得有组织的组织；
39.e.收获组织。
40.根据一些实施方案，提供了用于体外组织工程化的方法，该方法包括：
41.a.提供包含至少一层和/或至少一条纤维素的细胞生长培养基；所述至少一层纤维素包含嵌合多肽，该嵌合多肽包含：纤维素结合结构域(cbd)、细胞效应蛋白(cep)；以及将cbd连接到cep的接头，
42.b.在至少一层纤维素上接种哺乳动物细胞；
43.c.培养细胞直至获得有组织的组织；
44.d.收获组织。
45.根据一些实施方案，至少一层和/或至少一条包含具有含有第一cep的第一嵌合多肽的第一层和包含含有第二cep的第二嵌合多肽的第二层。
46.根据一些实施方案，接种哺乳动物细胞包括在第一层上接种第一细胞类型和在第二层上接种第二细胞类型。根据一些实施方案，第一细胞类型包括肌肉细胞，并且第二细胞类型包括脂肪细胞，并且其中有组织的组织是肉。根据一些实施方案，第一cep是肌肉特异性生长因子并且第二cep是脂肪特异性生长因子。
47.根据一些实施方案，哺乳动物细胞是专能(multipotent)或多能(pluripotent)细胞，并且其中第一因子和第二因子导致细胞分化成不同的细胞类型。根据一些实施方案，第一cep导致专能或多能细胞分化成肌肉细胞，并且第二cep导致专能或多能细胞分化成脂肪细胞。
48.本公开内容的某些实施方案可以包括上述一些优点、上述所有优点或不包括上述优点。根据本文包括的附图、说明书和权利要求书，一种或更多种技术优点对本领域技术人员来说可以是显而易见的。此外，虽然上文已经列举了特定优点，但是多种实施方案可以包括所有列举的优点、一些列举的优点或不包括列举的优点。
49.除了上文描述的示例性方面和实施方案以外，通过参考附图和研究以下详细描述，另外的方面和实施方案将变得明显。
50.附图简述：
51.现在将参考以下说明性附图，结合某些实例和实施方案来描述本发明。
52.图1a是本文公开的嵌合多肽的示意图，该嵌合多肽包含cep(例如gf、激素等-蓝色加星圆圈)，其通过接头融合cbd。
53.图1b是本文公开的嵌合多肽的示意图，该嵌合多肽包含cep(例如gf、激素等-蓝色加星圆圈)，其通过接头嵌合多肽融合cbd，cbd结合到纤维素(银灰色)，该纤维素用作组织生长的支架。
54.图2a是包括纤维素层的多层纤维素支架的示意图，纤维素层被放置以提供期望的多层支架。每层可以包含不同的嵌合多肽，为不同类型细胞的分化和/或生长提供合适的因子。
55.图2b是具有用作不同细胞的支架的不同纤维素层的多层纤维素支架的示意图。例如，分别用于产生肌肉组织和脂肪组织的肌肉细胞和脂肪细胞。
56.图2c是根据附接到支架层的cep通过细胞分化和/或扩增获得的具有期望特征(例如形态、质地等)的组织，诸如但不限于培养肉的示意图。
57.图3是二元质粒pcambia内cbd-fgf2
146aa
盒的图谱。
58.图4示出了在不同生长条件(补充有10％fcs的培养基、无fcs培养基或补充有商业fgf2标准品/146aa牛fgf2同种型/cbd-fgf2的无fcs培养基)下对培养72h的mcf7细胞进行刃天青测定测量的细胞生存力水平。结果显示为相对荧光单位(rfu)。*＝p值《0.05，并且**＝p值《0.005。
59.详细描述
60.在以下描述中，将描述本公开内容的各个方面。为了说明的目的，阐述了特定配置和细节以便提供对本公开内容的不同方面的透彻理解。然而，对本领域技术人员还将明显的是，本公开内容可以在没有本文呈现的特定细节的情况下实践。此外，熟知的特征可以省略或简化以便不使本公开内容晦涩。
61.除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
62.术语“一”和“一”是指一个或多于一个(即至少一个)该冠词的语法对象。例如，“要素(an element)”意指一个要素或多于一个要素。
63.当述及可测量的值诸如量、时间长度及类似值时，术语“约”意指涵盖从指定的值的
±
20％，或在一些情况下
±
10％，或在一些情况下
±
5％，或在一些情况下
±
1％，或在一些情况下
±
0.1％的变化，因为这样的变化适于进行所公开的方法。
64.如本文所用，术语“多肽”、“肽”和“蛋白”可以可互换地使用，并指氨基酸残基的聚合物。这些术语适用于其中一个或更多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。本发明的多肽可以通过标准分子生物学技术或人工合成和方法生产。
65.本发明的特定多肽(即参考多肽)的变体可以通过比较百分比序列同一性来评估。因此，例如，公开了与seq id no:1的多肽具有给定百分比序列同源性的多肽。任何两个多肽之间的百分比序列同一性可以使用本文别处描述的序列比对程序和参数来计算。例如，编码本文公开的cbd的多肽可以具有与整个seq id no:1具有至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同
一性的多肽。
66.碳水化合物结合模块(cbm)可见于各种不同的生物体中。纤维素结合结构域(cbd)是cbm的一个实例。cbd是从细菌嗜纤维梭菌(clostridiumcellulovorans)或任何其他合适的遗传来源(http://www.cazy.org/)分离的蛋白结构域。它与纤维素牢固地结合，并形成稳定但可逆的连接，该连接能够承受剪切力和ph值(ph 4至10)和盐度(10mm至饱和nacl)的温和变化。将cbd连接到细胞效应蛋白(诸如但不限于生长因子(gf)或激素)增加了cep的稳定性。此外，由于本文公开的嵌合多肽的大小，cep的内化速率较慢，其半衰期增加，并因此需要较低的工作浓度。此外，cbd的存在将cep连接到基于纤维素的支架上，该支架用作组织生长的支架并促进组织(诸如纤维肌肉，例如或多方向组织)的非各向同性生长和发育，以在另一实例中给出期望的3d结构。
67.根据一些实施方案，嵌合多肽包含含有合适蛋白酶的裂解位点的接头。有利的是，接头本身被构建成使得其有助于cep的构象和蛋白水解稳定性。根据一些实施方案，蛋白酶可以是位点特异性蛋白酶、内源性植物蛋白酶(丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶或其他)、肽酶等。每种可能性是单独的实施方案。
68.根据一些实施方案，蛋白酶裂解位点可以是对所培养的组织的特定发育阶段特异性的。根据一些实施方案，cep的裂解依赖性释放有利地确保cep受控释放到培养基中，从而延长了半衰期，并因此需要较低的工作浓度。
69.根据一些实施方案，蛋白酶可以是tev蛋白酶(ec 3.4.22.44，烟草蚀纹病毒核包含体a-内肽酶)。有利地，tev蛋白酶是来自烟草蚀纹病毒(tev)的高度序列特异性的半胱氨酸蛋白酶。根据一些实施方案，蛋白酶可以是具有最小裂解位点arg-x-x-arg的的弗林蛋白酶。根据一些实施方案，蛋白酶可以是sumo蛋白酶，其特异性识别整个sumo结构域的三级序列，并在其识别位点的c-末端裂解出双甘氨酸(gg)基序。这个过程不会在靶蛋白上留下额外的残基。此外，由于sumo蛋白酶识别sumo结构域，它们比其他蛋白酶更具高度特异性。如本文所用，术语“细胞效应蛋白(cep)”可指当存在于细胞的生长培养基中时影响细胞生长和/或分化的任何因子。根据一些实施方案，cep可以是生长因子(例如tgfβ、fgf2)、激素(例如胰岛素)、影响组织血管化的因子或诱导凋亡的因子等。每种可能性是单独的实施方案。
70.如本文所用，提及多肽的术语“嵌合”是指连接最初编码分开的蛋白的氨基酸的肽。这种嵌合肽的翻译产生具有源自每个原始蛋白的功能特性的单个多肽。
71.有利的是，本文公开的嵌合多肽和利用其的体外组织工程化系统是通用的，即，各种组织可以基于cep的组成、cep的浓度、包括不同cep的不同嵌合分子之间的比率以及它们在纤维素支架上的分布而工程化。
72.根据一些实施方案，嵌合多肽可以在经遗传修饰以表达该嵌合多肽的植物(诸如但不限于烟草植物)中表达。与其他表达系统相比，烟草植物中的蛋白表达具有很大的优势。这些优势包括低生产成本、大规模培养的潜力以及反映人类病原体无法在植物中复制的固有安全性。例如，根据另一种实施方案，嵌合多肽可以在其他植物(诸如大豆和玉米)中表达。例如，根据另一种实施方案，嵌合多肽可以在另一种生物体(诸如浮萍(duckweed)、酵母、细菌、真菌或藻类)中表达。每种可能性是单独的实施方案。
73.提供以下实施例以更充分地说明本发明的一些实施方案。然而，其绝不应以任何方式被解释为限制本发明的宽范围。本领域技术人员可以容易地设想本文公开的原理的许
多变化形式和修改，而不背离本发明的范围。
74.现在参考图1a，该图是本文公开的嵌合多肽100的示意图，该嵌合多肽100包含cep 110(例如gf、激素等)，其通过接头130融合到cbd 120，该接头130包含位点特异性蛋白酶的裂解位点。如从图1b所见，嵌合多肽100的cbd 120结合到或能够结合到纤维素140，纤维素140用作组织生长的支架。
75.现在参考图2a-图2c，该图是多层纤维素支架的示意图。支架可包括纤维素层，其被放置以提供期望的多层支架，如图2a所示。每层可以包含具有不同cep(例如，脂肪细胞生长因子和肌细胞生长因子)的嵌合多肽，每种cep允许不同类型的细胞(例如，分别为脂肪细胞和肌细胞)的分化和/或生长，如图2b所示。结果是，细胞可以根据所提供的cep分化和/或扩增，从而产生具有期望特征(例如，形态、质地等)的组织，诸如但不限于培养的肉的组织(参见图2c)。
76.提供以下实施例以更充分地说明本发明的一些实施方案。然而，其绝不应以任何方式被解释为限制本发明的宽范围。本领域技术人员可以容易地设想本文公开的原理的许多变化形式和修改，而不背离本发明的范围。
实施例
77.实施例1-在存在本文公开的多肽的情况下在饥饿培养基中生长的细胞的生存力。
78.为了评估结合cbd的生长因子的活性，在饥饿培养基中培养并仅补充本文公开的嵌合多肽的细胞的存活。
79.简言之，mcf-7细胞在96孔板(每孔10k细胞)中在补充有10％胎牛血清(fcs)的emem培养基(阳性对照)、无fcs的emem(完全饥饿-阴性对照)，或补充有增加浓度的商业重组人fgf2标准品(rhfgf2,peprotech,usa#100-18b)fgf2、146aa牛fgf2同种型(seq id no:6)或通过含有tev裂解接头连接到cbd的146aa牛fgf2同种型(cbd-fgf2-在seq idno:10中列出)的饥饿培养基中培养3天。
80.为了评估植物来源的重组牛fgf2在72h饥饿期间保持mcf-7细胞生存力的能力，进行了刃天青测定。弃去旧培养基并用含有刃天青(目录#ab129732,abcam,usa)的透明dmem培养基(高葡萄糖，无酚红)代替。细胞在37℃和5％co2孵育4h，在此期间在4小时后测量荧光强度(激发：535nm，发射波长：590nm)。
81.如从图4所见，由于3天的饥饿，细胞生存力与阳性对照(10％fcs)相比明显下降，但如果向细胞供应fgf2(无论是标准品还是146aa牛同种型)则观察到显著的拯救。重要的是，当向细胞供应结合cbd的fgf2时也获得了类似的拯救，指示结合cbd的fgf2可以作为生长因子，并且cbd不会对存活有负面影响。
82.实施例2-在植物中产生嵌合多肽
83.转化烟草植物以表达本文公开的嵌合多肽，并培养植物。
84.在产生足够的植物生物质之后，收集植物的叶子，并通过切碎和绞拧从叶子中提取嵌合多肽。提取后，将匀浆在0.2μm过滤器上过滤。
85.此时，有三种不同的选择可用。
86.1.第一种选择是产生纤维素纤维；然后将每条纤维通过cbd与嵌合多肽连接。这样，特制支架含有期望的cep。随后，将细胞接种在支架上，以期望的顺序和方向启动组织形
成(例如肉)。
87.2.第二种选择是预打印期望的纤维素-嵌合多肽复合物。在这种情况下，嵌合多肽嵌合体(chimera)被用作筒(cartridge)(装载材料)。同样，该应用允许控制培养组织的顺序和方向。
88.3.最后，将嵌合多肽添加到含有基于纤维素的支架的细胞培养基中。
89.虽然已经说明和描述了本发明的某些实施方案，但应清楚的是，本发明不限于本文描述的实施方案。不偏离如所附权利要求书描述的本发明的精神和范围的许多修改、改变、变化、替代和等同物对于本领域技术人员将是明显的。
90.实施例3-测试纤维素结合的fgf2的生物活性：
91.本实验的目的是通过在含有结合纤维素的生长因子即牛fgf2的饥饿培养基中诱导人类上皮细胞系mcf-7的附着和生长来展示结合纤维素的生长因子的生物活性。
92.简言之，96孔聚-l-赖氨酸板用晶体纳米纤维素(cnc)包被，作为细胞附着和生长的基础，随后通过刃天青测定评估细胞生存力。cnc涂层允许通过cbd-纤维素相互作用与纤维素结合结构域(cbd)融合的靶蛋白牢固地附着到板底部。为了制备cnc包被的板，添加cnc并在25℃孵育10分钟。将预稀释的标准品和cbd融合蛋白的样品添加到孔中，并在4℃孵育2h，以允许任何cbd蛋白融合蛋白与cnc结合。在本实施例中，cbd与牛fgf2的155个氨基酸同种型相连。
93.孵育后，用洗涤缓冲液洗涤板(以去除任何非反应性组分)，并立即将细胞添加到板以在各种条件下附着和生长：(a)富含血清的培养基，(b)无血清培养基(“饥饿条件”)和(c)供应cbd-fgf2的无血清培养基。在24、48、72和96小时后进行检测和定量细胞代谢活性的刃天青细胞生存力荧光测定，以确定cbd-fgf2对细胞附着、生长和生存力的影响。在该测定中，蓝色非荧光刃天青试剂被代谢活性细胞中的脱氢酶还原为高荧光试卤灵。这种转化仅发生在活细胞中，并因此产生的试卤灵的量与样品中活细胞的数量成正比。测定中形成的试卤灵可以通过使用荧光计(ex＝530-570nm,em＝590-620nm)测量相对荧光单位(rfu)来定量。

技术特征：
1.一种体外组织工程化系统，所述组织工程化系统包含多肽和至少一层和/或至少一条纤维素，其中所述多肽包含纤维素结合结构域(cbd)、细胞效应蛋白(cep)；以及将所述cbd连接到所述cep的接头。2.根据权利要求1所述的组织工程化系统，其中所述cbd与seq idno:1中列出的氨基酸序列具有至少70％同源性。3.根据权利要求1或2所述的组织工程化系统，其中所述接头具有10-25个氨基酸的长度。4.根据权利要求1-3中任一项所述的组织工程化系统，其中所述cep选自：生长因子、激素、细胞因子、促凋亡因子、抗凋亡因子、血管生长因子、细胞分化因子、骨生长因子、细胞生存力所需的其他蛋白如转铁蛋白，或其组合。5.根据权利要求4所述的组织工程化系统，其中所述cep是细胞分化因子、生长因子、细胞因子或生长激素。6.根据权利要求4所述的组织工程化系统，其中所述cep选自：fgf2、igf1、tgfβ1、egf、lif、激活蛋白a、nrg1、pdgf、il6、il13或其任何组合。7.根据权利要求1-6中任一项所述的组织工程化系统，其中所述接头包含裂解位点，所述裂解位点的特征在于能够被位点特异性蛋白酶以预定裂解效率裂解，使得当所述多肽暴露于所述蛋白酶时，获得所述cep从所述cbd的持续释放。8.根据权利要求7所述的组织工程化系统，其中所述裂解位点位于所述cep的n’末端上游5个氨基酸或更少，或所述cep的c’末端下游5个氨基酸或更少。9.根据权利要求7或8所述的组织工程化系统，其中所述裂解位点是tev蛋白酶裂解位点。10.根据权利要求7-9中任一项所述的组织工程化系统，其中所述裂解位点被修饰以提供与所述裂解位点的未修饰版本相比更低的裂解效率。11.根据权利要求10所述的组织工程化系统，其中所述修饰包括一个或更多个氨基酸的缺失、一个或更多个氨基酸的添加或一个或更多个氨基酸的取代。12.根据权利要求11所述的组织工程化系统，其中所述修饰包括一个或更多个氨基酸的化学修饰。13.根据权利要求7-12中任一项所述的组织工程化系统，其中所述裂解位点是在正常哺乳动物细胞生长条件下具有低于1.5
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103m-1
s-1
的催化效率(k
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/k
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)的蛋白酶的裂解位点。14.根据权利要求1-13中任一项所述的组织工程化系统，其中与所述cep的游离形式相比，当结合到cbd和/或所述接头时，所述cep的半衰期更长。15.根据权利要求1-14中任一项所述的组织工程化系统，其中所述接头增加所述cbd的半衰期。16.根据权利要求1-15中任一项所述的组织工程化系统，所述组织工程化系统包含至少两层和/或至少两条纤维素。17.根据权利要求16所述的组织工程化系统，其中所述至少两层和/或至少两条中的每一层和/或每一条与包含不同cep的嵌合肽缔合。18.根据权利要求16-17中任一项所述的组织工程化系统，其中所述至少一层包含至少
两种类型的嵌合多肽，每种类型的嵌合多肽包含不同的cep。19.根据权利要求18所述的组织工程化系统，其中所述两种类型的嵌合多肽中的第一种包含分化因子，并且所述两种类型的嵌合多肽中的第二种包含与分化相关的生长因子。20.根据权利要求19所述的组织工程化系统，其中所述两种类型的嵌合多肽中的第一种的接头包含含有第一裂解位点的接头，所述第一裂解位点的特征在于能够被位点特异性蛋白酶以第一预定裂解效率裂解，并且所述两种类型的嵌合多肽中的第二种包含含有第二裂解位点的接头，所述第二裂解位点的特征在于能够被位点特异性蛋白酶以第二预定裂解效率裂解，所述第二裂解效率低于所述第一裂解效率。21.一种嵌合多肽，用于在体外组织工程化中使用，所述多肽包含：a.纤维素结合结构域(cbd)；b.细胞效应蛋白(cep)；以及c.将所述cbd连接到所述cep的接头。22.根据权利要求21所述的嵌合多肽，其中所述cbd与seq id no:1中列出的氨基酸序列具有至少70％同源性。23.根据权利要求21或22所述的嵌合多肽，其中所述接头具有10-25个氨基酸的长度。24.根据权利要求21-23中任一项所述的嵌合多肽，其中所述cep选自：生长因子、激素、细胞因子、促凋亡因子、抗凋亡因子、血管生长因子、细胞分化因子、骨生长因子、细胞生存力所需的其他蛋白如转铁蛋白，或其组合。25.根据权利要求24所述的嵌合多肽，其中所述cep是细胞分化因子、生长因子、细胞因子或生长激素。26.根据权利要求24所述的嵌合多肽，其中所述cep选自：fgf2、igf1、tgfβ1、egf、lif、激活蛋白a、nrg1、pdgf、il6、il13或其任何组合。27.根据权利要求21-26中任一项所述的嵌合多肽，其中所述接头包含裂解位点，所述裂解位点的特征在于能够被位点特异性蛋白酶以预定裂解效率裂解，使得当所述多肽暴露于所述蛋白酶时，获得所述cep从所述cbd的持续释放。28.根据权利要求27所述的嵌合多肽，其中所述裂解位点位于所述cep的n’末端上游5个氨基酸或更少，或所述cep的c’末端下游5个氨基酸或更少。29.根据权利要求26或27所述的嵌合多肽，其中所述裂解位点是tev蛋白酶裂解位点。30.根据权利要求26-28中任一项所述的嵌合多肽，其中所述裂解位点被修饰以提供与所述裂解位点的未修饰版本相比更低的裂解效率。31.根据权利要求29所述的嵌合多肽，其中所述修饰包括一个或更多个氨基酸的缺失、一个或更多个氨基酸的添加或一个或更多个氨基酸的取代。32.根据权利要求30所述的嵌合多肽，其中所述修饰包括一个或更多个氨基酸的化学修饰。33.根据权利要求26-32中任一项所述的嵌合多肽，其中所述裂解位点是在正常哺乳动物细胞生长条件下具有低于1.5
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103m-1
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的催化效率(k
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)的蛋白酶的裂解位点。34.根据权利要求21-33中任一项所述的嵌合多肽，其中与所述cep的游离形式相比，当结合到cbd和/或所述接头时，所述cep的半衰期更长。35.根据权利要求21-34中任一项所述的嵌合多肽，其中所述接头增加所述cbd的半衰
期。36.一种用于体外组织工程化的方法，所述方法包括：a.提供包含至少一层和/或至少一条纤维素的细胞生长培养基；所述至少一层纤维素包含嵌合多肽，所述嵌合多肽包含纤维素结合结构域(cbd)、细胞效应蛋白(cep)；以及将所述cbd连接到所述cep的接头，b.在所述至少一层纤维素上接种哺乳动物细胞；c.培养所述细胞直至获得有组织的组织；d.收获所述组织。37.根据权利要求36所述的方法，其中所述至少一层和/或至少一条包含具有含有第一cep的第一嵌合多肽的第一层和包含含有第二cep的第二嵌合多肽的第二层。38.根据权利要求37所述的方法，其中接种所述哺乳动物细胞包括在所述第一层上接种第一细胞类型和在所述第二层上接种第二细胞类型。39.根据权利要求38所述的方法，其中所述第一细胞类型包括肌肉细胞，并且所述第二细胞类型包括脂肪细胞，并且其中所述有组织的组织是肉。40.根据权利要求39所述的方法，其中所述第一cep是肌肉特异性生长因子，并且所述第二cep是脂肪特异性生长因子。41.根据权利要求36所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是专能细胞或多能细胞，并且其中所述第一因子和第二因子导致所述细胞分化成不同的细胞类型。42.根据权利要求41所述的方法，其中所述第一cep导致所述专能细胞或多能细胞分化成肌肉细胞，并且所述第二cep导致所述专能或多能细胞分化成脂肪细胞。43.根据权利要求36-42中任一项所述的方法，其中所述接头包含特征在于能够被位点特异性蛋白酶裂解的裂解位点，并且其中所述方法还包括将所述至少一层纤维素暴露于所述位点特异性蛋白酶，使得所述cep可持续地释放到所述细胞生长培养基中。

技术总结
公开了一种用于在体外组织工程化中使用的嵌合多肽，该多肽包括纤维素结合结构域(CBD)、细胞效应蛋白(CEP)和将CBD连接到CEP的接头，以及利用该多肽的系统和方法。以及利用该多肽的系统和方法。以及利用该多肽的系统和方法。


技术研发人员：奥德
受保护的技术使用者：耶路撒冷希伯来大学伊森姆研究发展有限公司
技术研发日：2021.08.19
技术公布日：2023/7/17