白藜芦醇神经酸酯的制备方法

1.本发明涉及白藜芦醇的酯化改性技术领域。更具体地说，本发明涉及白藜芦醇神经酸酯的制备方法。


背景技术：

2.神经酸(c24:1-15c)是一种ω-9型超长链单不饱和脂肪酸，具有促进脑部健康、增强免疫力、降糖降脂等功能，是迄今为止发现的唯一一种能促进受损神经组织修复和再生的新食品原料。
3.白藜芦醇(3,4’,5-三羟基二苯乙烯)是一种天然多酚类化合物，在花生、葡萄、桑葚等植物中含量丰富。现有研究报道发现，白藜芦醇具有抑制肿瘤、抗炎、抗菌、保护心脏、保护神经、抗氧化、抗异构等作用。目前常应用于膳食补充剂、化妆品、食物和饮料中，市场潜力巨大。但是由于其在水中(30mg/l)和油中(0.98μg/g)溶解度较低，且口服生物利用率极低(《1％)，大大限制了其在食品、药品、化妆品等中的应用。
4.为进一步提高白藜芦醇的脂溶性，目前研究多采用酯化改性或包埋等方法。化学包埋法采用多糖、蛋白及多酚等单一或多种材料将白藜芦醇负载封装，具有持续释放特点，但是材料间由于以非共价键结合，容易相分离及乳液聚集(温度或ph变化)而降低包埋体系稳定性。而酯化改性通过催化剂或酶等作用，可在其现有结构上引入亲水或亲脂基团，更为简单经济。其中酶法酯化由于转化率、收率较低，多采用化学酯化。
5.目前，研究多采用芳香酸、短链脂肪酸(c3-c5)、中链脂肪酸(c6-c12)、长链脂肪酸(c13-c21)等改善白藜芦醇的脂溶性。超长链脂肪酸(c22-c30)，具有熔点高、热值低、稳定性高等优点，可改善塑性脂肪结晶性能及合成低热量食品。由于链长合成难度高，现有研究酯化率、纯度和收率极低(10.2％)，因此，亟待建立一种快速高效合成超长链脂肪酸酯方法。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供白藜芦醇神经酸酯的制备方法，该方法安全、高效、清洁，能实现白藜芦醇神经酸酯的高转化率、高纯度、高收率合成。
7.为了实现本发明的这些目的和其它优点，提供了白藜芦醇神经酸酯的制备方法，包括以下步骤：
8.步骤一、按照白藜芦醇、神经酸、硫代羰基二咪唑摩尔比1:1:0.8-1:7:11.2称取于反应器中；
9.步骤二、向反应器中加入一定量溶剂使反应物完全溶解；
10.步骤三、室温下搅拌反应30-180min。
11.优选的是，所述的白藜芦醇神经酸酯的制备方法中，还包括以下步骤：
12.步骤四、采用柱层析方法分离纯化合成样品：固定相为300目硅胶，湿法装柱，流动相为石油醚和乙酸乙酯，体积比为10:1-10:6；
13.步骤五、在100-130hpa，20-45℃下进行旋转蒸发，得到白藜芦醇神经酸酯纯品。
14.优选的是，所述的白藜芦醇神经酸酯的制备方法中，按照白藜芦醇、神经酸、硫代羰基二咪唑摩尔比1:6:9称取于反应器中。
15.优选的是，所述的白藜芦醇神经酸酯的制备方法中，所述溶剂为二氯甲烷。
16.优选的是，所述的白藜芦醇神经酸酯的制备方法中，所述步骤二中，将反应器密封，防止溶剂挥发。
17.优选的是，所述的白藜芦醇神经酸酯的制备方法中，所述步骤三中，搅拌时转速为300-800rpm。
18.优选的是，所述的白藜芦醇神经酸酯的制备方法中，所述步骤三中，搅拌时转速为500rpm，反应时间为60min。
19.优选的是，所述的白藜芦醇神经酸酯的制备方法中，所述步骤四中，石油醚和乙酸乙酯的体积比为10:3，所述步骤五中，在100hpa，40℃下进行旋转蒸发。
20.本发明至少包括以下有益效果：
21.(1)合成的新物质白藜芦醇神经酸酯的酯化率、收率和纯度最高可达99.61％、80.68％、91.66％，远高于现有方法。
22.(2)采用硫代羰基二咪唑催化一步法最快可半小时常温下快速合成白藜芦醇神经酸酯，且合成过程中无有毒有害物质产生，整个合成过程温和简单且绿色无污染。
23.(3)经过酯化后得到的白藜芦醇神经酸酯相较于白藜芦醇，脂溶性(提高61.2-204.1倍)和热稳定性(提高10℃)极大提高。
24.(4)白藜芦醇神经酸酯抗氧化性增强，可应用于抑制油脂氧化，延长食用油的货架期。
25.本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
26.图1是根据本发明一个实施例的白藜芦醇神经酸酯的红外光谱图；
27.图2是根据本发明一个实施例的白藜芦醇神经酸酯的热重图；
28.图3是根据本发明一个实施例的白藜芦醇神经酸酯的过氧化值检测图；
29.图4是根据本发明一个实施例的白藜芦醇神经酸酯的酸价检测图；
30.图5是根据本发明一个实施例的白藜芦醇神经酸酯的共轭二烯值检测图。
具体实施方式
31.下面结合附图和实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
32.需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
33.1.一步法合成白藜芦醇神经酸酯
34.对不同白藜芦醇:神经酸摩尔比a1-a5(1:1、1:2、1:3、1:6、1:7)、神经酸:硫代羰基二咪唑摩尔比b1-b5(1:0.8、1:1、1:1.2、1:1.5、1:1.6)、酯化时间c1-c5(0.5、1、2、3、4h)、溶
剂添加量d1-d5(5、10、15、20、25ml)、酯化温度e1-e2(0、25℃)进行实验。在确定最优参数时，其它参数白藜芦醇用量、白藜芦醇:神经酸摩尔比、神经酸:硫代羰基二咪唑摩尔比、酯化时间、溶剂添加量和酯化温度分别控制为0.31g、1:3、1:1、0.5h、5ml和25℃。
35.由表1可知，不同白藜芦醇:神经酸摩尔比的白藜芦醇神经酸酯酯化率均在95％以上，其中白藜芦醇:神经酸摩尔比为1:6时，酯化率最高为97.87％。这可能是由于神经酸过量添加有助于酯化完全，但是超过一定比例后，酯化已完全，酯化率不再增加。不同神经酸:硫代羰基二咪唑摩尔比的白藜芦醇神经酸酯酯化率均在90％以上，其中神经酸:硫代羰基二咪唑摩尔比为1:1.5时，酯化率最高为95.21％。硫代羰基二咪唑(tcdi)作为缩合剂，与神经酸一样，适当过量有助于酯化反应的进行。不同酯化改性时间的白藜芦醇神经酸酯酯化率均在90％以上，其中酯化改性时间为1h时，酯化率最高为92.70％。这可能是酯化率随着酯化时间的增加而增加，后受到其它因素的影响而不再增加。不同溶剂添加量的白藜芦醇神经酸酯酯化率均在80％以上，其中溶剂添加量为5ml时，酯化率最高为91.94％。由于实验须在溶剂中反应且溶剂添加量无法更少，因此确定最优溶剂添加量为5ml。不同温度合成白藜芦醇神经酸酯酯化率皆在91％以上，其中常温25℃酯化率更高。可能是低温不利于硫代羰基二咪唑活化羧基，而温度过高时会导致二氯甲烷挥发。
36.综上所述，确定了白藜芦醇神经酸酯粗样合成的最优参数，即白藜芦醇(m＝228.24)(0.31g，0.001358mol)、神经酸(m＝366.6)(3g，0.00818mol)和硫代羰基二咪唑(m＝178.21)(2.19g，0.01227mol)摩尔比1:6:9于锥形瓶中，再加入5ml二氯甲烷(0.0937mol)使其完全溶解，保鲜膜封口防止溶剂挥发，25℃下磁力搅拌(转速500rpm)反应1h，合成可得到白藜芦醇神经酸酯粗样，酯化率为99.61％。
37.表1不同参数下合成白藜芦醇神经酸酯的酯化率实验结果
[0038][0039][0040]
对合成的粗样进一步分离纯化。采用柱层析方法：固定相为300目硅胶；流动相(洗脱液)为石油醚:乙酸乙酯＝10:1-10:6(v/v)，其中优选为石油醚:乙酸乙酯＝10:3(v/v)，可分离不同类型的酯质产物；固定相:流动相比例为1:5(v/v)，湿法装柱。使用旋转蒸发仪，在100-130hpa压力下，20-45℃下除去粗样中的流动相和溶剂及其他杂质等，得到白藜芦醇神经酸酯纯品。其中优选为100hpa压力40℃。复溶挥发后称量得到纯品的重量，计算确定收率。在最优条件下，白藜芦醇神经酸酯纯品的收率最高为80.68％，纯度最高为91.66％。
[0041]
最优实施例1：
[0042]
白藜芦醇(m＝228.24)(0.31g，0.001358mol)、神经酸(m＝366.6)(3g，0.00818mol)和硫代羰基二咪唑(m＝178.21)(2.19g，0.01227mol)摩尔比1:6:9于锥形瓶中，再加入5ml二氯甲烷(0.0937mol)使其完全溶解，保鲜膜封口防止溶剂挥发，25℃下磁力搅拌(转速500rpm)反应1h，合成可得到白藜芦醇神经酸酯粗样。柱层析分离纯化，流动相为
石油醚:乙酸乙酯＝10:3(v/v)，100hpa压力40℃下旋转蒸发，除去粗样中的流动相和溶剂及其他杂质等，得到白藜芦醇神经酸酯纯品。
[0043]
实施例2：
[0044]
白藜芦醇(m＝228.24)(0.31g，0.001358mol)、神经酸(m＝366.6)(3g，0.00818mol)和硫代羰基二咪唑(m＝178.21)(2.19g，0.01227mol)摩尔比1:6:9于锥形瓶中，再加入5ml二氯甲烷(0.0937mol)使其完全溶解，保鲜膜封口防止溶剂挥发，25℃下磁力搅拌(转速300rpm)反应1h，合成可得到白藜芦醇神经酸酯粗样。柱层析分离纯化，流动相为石油醚:乙酸乙酯＝10:3(v/v)，100hpa压力40℃下旋转蒸发，除去粗样中的流动相和溶剂及其他杂质等，得到白藜芦醇神经酸酯纯品。
[0045]
对比例1：
[0046]
白藜芦醇(m＝228.24)(0.31g，0.001358mol)、神经酸(m＝366.6)(3g，0.00818mol)和硫代羰基二咪唑(m＝178.21)(2.19g，0.01227mol)摩尔比1:6:9于锥形瓶中，再加入5ml二氯甲烷(0.0937mol)使其完全溶解，保鲜膜封口防止溶剂挥发，25℃下磁力搅拌(转速500rpm)反应1h，合成可得到白藜芦醇神经酸酯粗样。柱层析分离纯化，流动相为石油醚:乙酸乙酯＝10:6(v/v)，100hpa压力40℃下旋转蒸发，除去粗样中的流动相和溶剂及其他杂质等，得到白藜芦醇神经酸酯纯品。
[0047]
对比例2：
[0048]
白藜芦醇(m＝228.24)(0.31g，0.001358mol)、神经酸(m＝366.6)(3g，0.00818mol)和硫代羰基二咪唑(m＝178.21)(2.19g，0.01227mol)摩尔比1:6:9于锥形瓶中，再加入5ml二氯甲烷(0.0937mol)使其完全溶解，保鲜膜封口防止溶剂挥发，25℃下磁力搅拌(转速500rpm)反应1h，合成可得到白藜芦醇神经酸酯粗样。柱层析分离纯化，流动相为石油醚:乙酸乙酯＝10:3(v/v)，80hpa压力40℃下旋转蒸发，除去粗样中的流动相和溶剂及其他杂质等，得到白藜芦醇神经酸酯纯品。
[0049]
对比例3：
[0050]
白藜芦醇(m＝228.24)(0.31g，0.001358mol)、神经酸(m＝366.6)(3g，0.00818mol)和硫代羰基二咪唑(m＝178.21)(2.19g，0.01227mol)摩尔比1:6:9于锥形瓶中，再加入5ml二氯甲烷(0.0937mol)使其完全溶解，保鲜膜封口防止溶剂挥发，25℃下磁力搅拌(转速500rpm)反应1h，合成可得到白藜芦醇神经酸酯粗样。柱层析分离纯化，流动相为石油醚:乙酸乙酯＝10:3(v/v)，100hpa压力25℃下旋转蒸发，除去粗样中的流动相和溶剂及其他杂质等，得到白藜芦醇神经酸酯纯品。
[0051]
对比例4：
[0052]
白藜芦醇(m＝228.24)(0.31g，0.001358mol)、共轭亚油酸(m＝280.4)(2.29g，0.00818mol)和硫代羰基二咪唑(m＝178.21)(2.19g，0.01227mol)摩尔比1:6:9于锥形瓶中，再加入5ml二氯甲烷(0.0937mol)使其完全溶解，保鲜膜封口防止溶剂挥发，25℃下磁力搅拌(转速500rpm)反应1h，合成可得到白藜芦醇共轭亚油酸酯粗样。柱层析分离纯化，流动相为石油醚:乙酸乙酯＝10:3(v/v)，100hpa压力40℃下旋转蒸发，除去粗样中的流动相和溶剂及其他杂质等，得到白藜芦醇亚油酸酯纯品。
[0053]
对比例5：
[0054]
按照专利号zl 202011585264.x中的最优选方法制备白藜芦醇亚油酸酯。
[0055]
实施例1和2与对比例1-5下样品的酯化率、纯度和收率见表2。
[0056]
表2实施例与对比例下样品的酯化率、纯度和收率
[0057] 酯化率(％)纯度(％)收率(％)实施例199.6191.6680.68实施例296.0189.0377.39对比例150.3585.2847.28对比例278.4687.0571.43对比例377.2668.4070.22对比例497.5198.5260.22对比例596.8798.0060.00
[0058]
2.红外光谱检测确定酯质生成
[0059]
称取500mg实施例1制备的样品于红外光谱槽上，以空气为背景即刻采集红外吸收光谱图。以16cm-1
的分辨率进行64次扫描，分辨率：4cm-1
，记录500-4500cm-1
范围内的谱图(图1)，可根据吸收峰来快速判断是否有白藜芦醇神经酸酯生成。经过检测实施例1生成白藜芦醇神经酸酯后，神经酸羧酸基团峰c＝o明显降低(1690cm-1
)；酯c＝o基团峰明显生成(1753cm-1
)；未在3000cm-1
以上中观察到明显强峰，即白藜芦醇的羟基o-h基团峰(3187cm-1
)；白藜芦醇3个羟基皆发生反应，生成了白藜芦醇神经酸酯产物。
[0060]
3.酯化率的确定
[0061]
取0.5g的样品，添加2ml体积分数为80％的乙醇提取白藜芦醇，取上清液后，重复提取步骤，收集上清液配平至5ml，超高相液相色谱检测白藜芦醇含量。部分样品中白藜芦醇剩余量较多，可采用体积分数为80％的乙醇多次稀释后检测。液相色谱条件为：色谱柱型号为c18柱(2.1mm
×
100mm，1.8μm)，柱温为35℃，检测波长为285nm/306nm，进样量为10μl，流动相a和b为0.1％甲酸水溶液和纯甲醇，流速为0.45ml/min。采用梯度洗脱：0～0.5min为90％a相，2min为75％a相，3.5min为70％a相，4min为65％a相，5min为50％a相，7min为10％a相，7.2～10min为90％a相。
[0062]
4.纯度的确定
[0063]
用分析天平称取0.2g样品置于10ml的塑料离心管中，加入2.0ml c18:0内标液，再加入100μl 2mol/l的氢氧化钾甲醇溶液，旋涡震荡30s至样品溶液混匀。并以4000rpm的速度离心10min。再吸取上清液20μl，加入色谱级异辛烷定容于1ml容量瓶中，放于室温下待测。进样参数的选择：分流比设置为60:1；线速度设置为9.0cm/s；进样量设置为1μl；进样口温度设置为230℃；色谱柱流量设置为0.6ml/min。升温程序的选择：slb-il111毛细色谱柱，初始温度设置为60℃，保留5min后，以20℃/min升温达到175℃，继续保持15min，再以1℃/min的速度升至185℃，最后保留70min。检测参数：检测器使用氢火焰；检测器的温度设置为250℃；空气的尾吹流量设置为30.0ml/min；氢气流量为40ml/min；空气流量为400ml/min；载气为高纯氮；进样口压力为192.2kpa，总流量为31.5ml/min；清洗流量为1.0ml/min。
[0064]
5.热稳定性的检测
[0065]
称取适量实施例1纯品(50mg左右)于小铝盒中，平衡后记录样品重量，热重设备的温度选择为0-500℃，升温速率为20℃/min，氮气流量为100ml/min，记录热重变化曲线。根据基线外推法，初始反应温度为300℃。对比白藜芦醇(290℃)，白藜芦醇神经酸酯的样品的
热稳定性温度提高10℃。图2中a和b曲线分别代表随着温度的增加，质量变化速率和质量变化。
[0066]
6.脂溶性的检测
[0067]
准确称取适量实施例1纯品，放入到100ml的三角瓶中，水浴加热到60℃，将花生油逐滴加入三角瓶中并不断搅拌，直到白藜芦醇神经酸酯被花生油完全溶解，体系成均一相。冷却到20℃，静置24h，观察三角瓶中有无沉淀或者浑浊出现，依据所加花生油的量，来计算溶解度。经过实验后，白藜芦醇的脂溶性为0.98μg/g，实施例1白藜芦醇神经酸酯的脂溶性为60-200μg/g，相较于白藜芦醇提高了61.2-204.1倍，而对比例4和5白藜芦醇亚油酸酯的脂溶性相较于白藜芦醇提高了20-21倍。
[0068]
7.氧化稳定性的检测
[0069]
将白藜芦醇及实施例1、对比例4和5纯品(10mg)分别溶于80％甲醇溶液(1ml)中，涡旋混匀后4000rpm离心10min取上清液。取400μl上清液与600μl80％甲醇溶液或dpph工作液混合分别合成对照管和测试管，空白管为400μl甲醇溶液与600μldpph工作液。混合均匀后，室温避光静置30min，4000rpm离心5min后取上清液，在517nm波长下，以无水乙醇为背景测定各管吸光度值，所有测量均重复进行三次。抗氧化性按照以下公式计算(1)：
[0070][0071]
根据实验结果可知：白藜芦醇和对比例4、5白藜芦醇亚油酸酯的抗氧化性分别为87.49％和88.10-88.28％，而实施例1白藜芦醇神经酸酯的抗氧化活性为90.00％，分别是白藜芦醇和白藜芦醇亚油酸酯的1.03倍和1.01倍。
[0072]
称取五份25g去除内源抗氧化剂的玉米油，分别加入10ml烧瓶中，其中两份分别加入5mg实施例1纯品、白藜芦醇，另两份分别加入5mg对比例4和5纯品，浓度为200ppm，还一份做空白对照(不加抗氧化剂)。氮气吹干乙醇溶液后，用铝箔包裹烧瓶，以防止光曝光。将烧瓶置于60
±
0.5℃的烘箱中，0、1、3、6天后采集样品，检测其酸价、过氧化值、共轭二烯值，并检测货架期。酸价、过氧化值采用酸价过氧化值检测仪。称取油样约0.1g，准确称至0.0001g，置于25ml容量瓶中。用异辛烷溶解并稀释至25ml，用异辛烷溶剂作空白，使用分光光度计在232nm处测定吸光度。食用油的货架期采用油脂氧化诱导仪检测不同温度(100、110、120和130℃)下氧化诱导时间，根据诱导时间求导计算得到货架期(20℃下氧化诱导时间)。根据结果可知，白藜芦醇神经酸酯的过氧化值(图3)、酸价(图4)和共轭二烯值(图5)基本低于白藜芦醇和空白对照。图3-5中a、b、c曲线分别对应空白组、白藜芦醇和实施例1纯品。实施例1、对比例4、对比例5、白藜芦醇和空白组6天后的过氧化值、酸价和共轭二烯值，以及货架期见表3。
[0073]
表3过氧化值、酸价和共轭二烯值，以及货架期检测结果
[0074] 过氧化值(meq/kg)酸价(mgkoh/g)共轭二烯值货架期(天)实施例1纯品26.50.553.3378.2对比例4纯品270.603.6071.4对比例5纯品27.50.603.6571.3白藜芦醇260.653.6968.5空白对照320.73.9231.9
[0075]
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

技术特征：
1.白藜芦醇神经酸酯的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、按照白藜芦醇、神经酸、硫代羰基二咪唑摩尔比1:1:0.8-1:7:11.2称取于反应器中；步骤二、向反应器中加入一定量溶剂使反应物完全溶解；步骤三、室温下搅拌反应30-180min。2.如权利要求1所述的白藜芦醇神经酸酯的制备方法，其特征在于，还包括以下步骤：步骤四、采用柱层析方法分离纯化合成样品：固定相为300目硅胶，湿法装柱，流动相为石油醚和乙酸乙酯，体积比为10:1-10:6；步骤五、在100-130hpa，20-45℃下进行旋转蒸发，得到白藜芦醇神经酸酯纯品。3.如权利要求1所述的白藜芦醇神经酸酯的制备方法，其特征在于，按照白藜芦醇、神经酸、硫代羰基二咪唑摩尔比1:6:9称取于反应器中。4.如权利要求1所述的白藜芦醇神经酸酯的制备方法，其特征在于，所述溶剂为二氯甲烷。5.如权利要求1所述的白藜芦醇神经酸酯的制备方法，其特征在于，所述步骤二中，将反应器密封，防止溶剂挥发。6.如权利要求1所述的白藜芦醇神经酸酯的制备方法，其特征在于，所述步骤三中，搅拌时转速为300-800rpm。7.如权利要求6所述的白藜芦醇神经酸酯的制备方法，其特征在于，所述步骤三中，搅拌时转速为500rpm，反应时间为60min。8.如权利要求2所述的白藜芦醇神经酸酯的制备方法，其特征在于，所述步骤四中，石油醚和乙酸乙酯的体积比为10:3，所述步骤五中，在100hpa，40℃下进行旋转蒸发。

技术总结
本发明公开了白藜芦醇神经酸酯的制备方法，包括以下步骤：步骤一、按照白藜芦醇、神经酸、硫代羰基二咪唑摩尔比1:1:0.8-1:7:11.2称取于反应器中；步骤二、向反应器中加入一定量溶剂使反应物完全溶解；步骤三、室温下搅拌反应30-180min。本发明安全、高效、清洁，能实现白藜芦醇神经酸酯的高转化率、高纯度、高收率合成。成。成。


技术研发人员：王强 郭芹 李甜 胡小宁 梁蔓竹 屈阳 李振源
受保护的技术使用者：中国农业科学院农产品加工研究所
技术研发日：2023.03.24
技术公布日：2023/7/18