一种ATMi@MnAs的制作方法

一种atmi@mnas
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@lp脂质体及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明涉及一种atmi@mnas
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@lp脂质体及其制备方法和应用，属于生物材料制备领域。


背景技术：

2.三氧化二砷(ato)和锰离子相关的化学动力学疗法(cdt)是一种有前景的基于细胞毒性活性氧(ros)生成的抗肿瘤方法。但是这种治疗方式存在很大的弊端导致治疗效果不佳，包括：
①
药物传递不佳导致的肿瘤细胞杀伤能力不足；
②
免疫抑制性程序性死亡配体(pd-l1)的上调，极其所导致的涉及共济失调毛细血管扩张突变激酶(atm)-介导的dna损伤反应收到影响。


技术实现要素：

3.为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种atmi@mnas
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@lp脂质体及其制备方法和应用。
4.一方面，本发明提供了一种atmi@mnas
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@lp脂质体，其特征在于，包括：具有空腔结构的脂质体、负载在脂质体内部空腔的mnas
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纳米颗粒以及搭载在脂质体层间的小分子抑制剂；所述小分子抑制剂选自atm抑制剂。
5.本发明中，脂质体纳米颗粒atmi@mnas
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@lp，可以提高砷/锰-化学动力学治疗的疗效。其所释放的atm抑制剂(atm或atmi)可以靶向atm，成功地使ros诱导的dna破坏，进一步深入，并下调pd-l1表达，从而增强机体免疫反应。本发明中，脂质体内部负载的mnas
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纳米颗粒为mn-as结合物。
6.较佳的，所述具有空腔结构的脂质体组成包含棕榈酰磷脂酰胆碱dppc、甲氧基peg二硬脂酰磷脂酰乙酰胺dspe-mpeg-2000和胆固醇chol；优选地，所述棕榈酰磷脂酰胆碱、甲氧基peg二硬脂酰磷脂酰乙酰胺和胆固醇的摩尔比为(12～20)：(2～4)：(1～10)，优选为20：3：10。
7.较佳的，所述mnas
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纳米颗粒中mn的化合价主要为2+，其组成包含mnhaso3和mn3(aso3)2。根据图9的xps结果，mn
2+
的结合能(mn 2p3/2和mn 2p1/2的结合能分别为642.1ev和653.1ev)表示脂质体内部形成了两种典型亚砷酸锰mnhaso3和mn3(aso3)2的混合物。
8.较佳的，所述小分子抑制剂的包封率至少为60％，优选至少为70％。
9.本发明中，atm抑制剂(atm kinase inhibitor)，包括：
①
ku-55933，其是一种有效的，特异性atm抑制剂，化学式为：c
21h17
no3s2，分子量为：395.49。且其亲脂性强，更适于搭载在脂质体的双分子膜内：；
②
ku-60019，化学式为c
30h33
n3o5s，分子量为：349.35；
③
cp-466722，化学式为c
17h15
n7o2，分子量为：411.89：。
10.较佳的，所述atmi@mnas
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@lp脂质体的平均水动力直径为190～300nm。
11.另一方面，本发明提供了一种atmi@mnas
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@lp脂质体的制备方法，包括：(1)将二棕榈酰磷脂酰胆碱、甲氧基peg二硬脂酰磷脂酰乙酰胺和胆固醇溶于有机溶剂中中，得到第一混合溶液；(2)在第一混合溶液中加入小分子抑制剂溶液并混合得到第二混合溶液，再经进行蒸发，得到脂质膜；(3)将脂质膜置于锰盐溶液中进行水化处理后，再加入亚砷酸盐溶液进行沉淀反应，最后经过滤，得到浓缩液；(4)将所得浓缩液过滤通过脂质体挤出器进行多次挤推，得到所述atmi@mnas
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@lp脂质体。
12.较佳的，步骤(1)中：所述有机溶剂选自氯仿、乙醇、二甲基亚砜dmso中的至少一种；所述第一混合溶液中二棕榈酰磷脂酰胆碱、甲氧基peg二硬脂酰磷脂酰乙酰胺和胆固醇总质量浓度为10～25mg/ml。其中，有机溶剂会在旋蒸过程中完全挥发，混合溶液浓度不影响脂质体膜的形成。例如，在制备合成脂质体时使用的二棕榈酰磷脂酰胆碱、甲氧基peg二硬脂酰磷脂酰乙酰胺和胆固醇的剂量分别为10mg、5.73mg、2.63mg，加入到1ml氯仿中完全溶解。
13.较佳的，步骤(2)中：所述小分子抑制剂溶液的浓度为1～3mg/ml，优选为1mg/ml；所述小分子抑制剂溶液的溶剂选自乙醇，其中易容，较稳定，旋蒸易去除；所述小分子抑制剂溶液和第一混合溶液的体积比为(5～10)：100，优选为9：100；所述蒸发的方式为旋涂蒸发；所述旋涂蒸发的气压为75～130mbar，转速为150～200转/分钟，温度为30～50℃，每1ml第二混合溶液所需时间为10～20分钟。优选，旋转蒸发的参数包括：100mbar；180rpm；40℃；旋蒸时间按合成总量调整，1ml左右的第二混合溶液旋蒸时间15min左右即可。
14.较佳的，步骤(3)中：所述锰盐溶液中锰盐选自乙酸锰，浓度为25～35mg/ml，ph＝7～8；所述亚砷酸盐溶液中亚砷酸盐选自亚砷酸钠，浓度为1～3mg/ml；所述锰盐和亚砷酸盐的质量比为(10～20)：1；所述水化处理的方式为水浴超声处理，功率为600w，时间为20～40分钟所述沉淀
反应的方式为水浴磁力搅拌；优选地，所述水浴磁力搅拌的温度为50～60℃，转速为150～250转/分钟，时间为20～40分钟。其中乙酸锰溶液为30mg/ml，ph＝7.4；亚砷酸钠溶液的浓度为2mg/ml；乙酸锰和亚砷酸钠质量比15:1。超声水浴的参数为：600w，30min；磁力搅拌水浴的参数为：55℃，200rpm，30min。
15.较佳的，步骤(4)中：所述脂质体挤出器具有阵列分布的通孔结构，所述通孔结构的孔径为80～120nm；所述脂质体挤出器的直径为15～25mm，孔径为100～200μm；所述脂质体挤出器内所置膜的材质为聚碳酸酯；所述多次的次数为至少为10次，优选至少为20次，更优选至少为30次。
16.再一方面，本发明还提供了一种atmi@mnas
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@lp脂质体在制备抗肿瘤药物中的应用。
17.有益效果：本发明利用逆向蒸发法将疏水结构atmi搭载入脂质体的脂质双分子层内，利用脂质体作为纳米反应器完成砷-锰结合搭载入脂质体内部。本发明的制备方法所用设备简单，投资小，且能批量生产atmi@mnas
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@lp载药抗瘤脂质体。
附图说明
18.图1为本发明中atmi@mnas
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@lp的合成示意图；图2为实施例1中atmi@mnas
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@lp的tem图像；图3为atmi的hplc结果(左)和atmi@mnas
x
@lp的hplc结果(右)，从图中可知atmi被成功包封成纳米颗粒；图4为破坏实施例1中atmi@mnas
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@lp后得到的内部砷-锰结合物的tem图像，从图中可知证实脂质体内砷-锰结合物的形成；图5为实施例1中atmi@mnas
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@lp的eds能谱图，从图中可知高含量的mn、as元素，进一步证实了砷-锰结合物的成功包载；图6为实施例1中atmi@mnas
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@lp合成过程中的粒径变化与最终粒径，通过dls测试，随着药物的搭载，脂质体水合粒径逐步增加(blank lp:165nm；atmi@lp:183nm，mnas
x
@lp：188nm)，所合成的atmi@mnas
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@lp平均水合粒径为192nm。粒径的变化可间接体现出药物的搭载过程，而所合成纳米颗粒的大小有利于通过epr效应有效地渗透到肿瘤中，从而获得更好的治疗效果；图7为实施例1中atmi@mnas
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@lp合成过程中的粒径变化与最终粒径，从图中可知atmi@mnasx@lp在4℃的pbs(含5mg/ml bsa)中出现良好的稳定性，在水动力直径和多分散度指数(pdi)在合成后一周时间里基本稳定；图8为实施例1中atmi@mnas
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@lp合成过程中的zeta电位变化与最终zeta电位(n＝3)，从图中可知blank lp，atmi@lp，mnas
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@lp与atmi@mnas
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@lp的zeta电位变化可以分别体现出atmi，mnas
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在脂质体上的成功搭载；图9为实施例1中atmi@mnas
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@lp的xps图像，锰元素以+2价态为主，从图中可知mn
2+
的结合能(mn 2p3/2和mn 2p1/2的结合能分别为642.1ev和653.1ev)表示脂质体内部形成了两种典型亚砷酸锰mnhaso3和mn3(aso3)2的混合物；
图10为实施例1中atmi@mnas
x
@lp在不同ph环境下，分解h2o2产生ros的能力；为了研究mn
2+
的芬顿反应，将tmb的吸光度作为
·
oh(羟基自由基，重要的活性氧)生成的指标。酸性环境下mnas
x
@lp和atmi@mnas
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@lp的芬顿样反应更为明显，说明肿瘤环境(ph＝5.5)产生的
·
oh显著增加；图11为实施例1中atmi@mnas
x
@lp在不同ph环境下，atmi的释放曲线(a)与砷的释放曲线(b)；为了验证atmi@mnas
x
@lp的ph响应特性，研究了ph为5.5(溶酶体酸度)和7.4(生理环境)下的药物释放谱。在酸性环境中孵育后，atmi@mnas
x
@lp表现出明显的ph依赖性药物释放行为，在ph为5.5和7.4时，atmi在24小时内的累积释放量分别为57.29
±
5.34％和44.23
±
3.89％，显示出缓释特征。atmi@mnas
x
@lp在6h内表现出快速的as释放，达到78.47
±
2.68％的累积释放。
具体实施方式
19.以下通过下述实施方式进一步说明本发明，应理解，下述实施方式仅用于说明本发明，而非限制本发明。
20.本发明中，以逆向蒸发法合成搭载atmi的脂质体结构，并以此为纳米反应器完成砷与锰的结合与搭载。以下示例性地说明atmi@mnas
x
@lp的制备方法。
21.配制小分子抑制剂溶液。用乙醇等有机溶剂配制1mg/ml的ku-55933(atmi)溶液。
22.第一混合溶液的配制。将二棕榈酰磷脂酰胆碱(dppc)、甲氧基peg二硬脂酰磷脂酰乙酰胺(dspe-mpeg-2000)和胆固醇(chol)按20:3:10的摩尔比溶于溶剂(例如氯仿等)中，得到第一混合溶液。
23.在第一混合溶液中加入atmi溶液并混合，得到第二混合溶液。
24.将第二混合溶液进行蒸发去除溶剂，制备得到脂质膜。本发明中，制备脂质体采用逆向蒸发法，指将磷脂等膜材溶于有机溶剂，加入待包封的药物水溶液进行短时超声，直到形成稳定油包水乳状液，然后减压蒸发除去有机溶剂，最后形成脂质体混悬液。
25.将脂质膜置于锰盐溶液中进行水化处理，得到脂质体溶液。其中，水化后mn盐溶液可进入到脂质体内，为后续以脂质体作为反应器与as盐反应做铺垫。
26.将脂质体溶液中加入亚砷酸盐溶液，进行沉淀反应。其中，本发明利用弱酸输运特性和亚砷酸盐形成不溶性过渡金属(如mn
2+
)的化合物，可以在高砷密度下将三氧化二砷装载到脂质体中，并保持关键的生物活性。膜复水合法制备含醋酸锰脂质体；离子梯度驱动下在亲水空间内部形成砷锰化合物(具体反应式未查到)。砷锰化合物之间的相互作用，包括静电相互作用和偶极子-偶极子相互作用，使被捕获的药物得以持续释放，脂质体提高了制备的纳米颗粒的稳定性，并促进了它们在肿瘤部位的积累，从而提高了治疗效果。
27.将反应后的脂质体溶液进行超滤系统过滤掉未反应的离子，的都。然后将经过超滤系统后的浓缩液多次通过脂质体挤出器，目的在于提纯脂质体，最终得到atmi@mnas
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@lp脂质体。例如用200nm的聚碳酸酯膜推挤30次。
28.下面进一步例举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适
的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。下述示例中，所用挤出器为morgec avestins手推式实验室专用滤膜挤出器，官方参数包括：标配膜孔径：100nm；聚碳膜直径：19mm；聚碳膜孔径：200nm(孔径根据利于体内epr效应选择，morgec配套专用膜)；推挤次数：30次。
29.实施例1(1)用乙醇配制1mg/ml的ku-55933(atmi)溶液；(2)将二棕榈酰磷脂酰胆碱(dppc)、甲氧基peg二硬脂酰磷脂酰乙酰胺(dspe-mpeg-2000)和胆固醇(chol)按20:3:10的摩尔比(10mg、5.73mg、2.63mg)溶于氯仿(1ml)中，得到第一混合溶液(18.36mg/ml)；(3)在第一混合溶液(100ml)中加入atmi溶液(9ml)，得到第二混合溶液；(4)将配制好的第二混合溶液(1ml)在旋转蒸发仪上以180rpm转速在40℃下蒸发，控制1ml左右的第二混合溶液旋蒸时间15min左右即可，制备得到脂质膜；(5)将所得脂质膜用醋酸锰溶液(30mg/ml，ph＝7.4)通过600w水浴超声30min进行水化处理，得到脂质体溶液；(6)在脂质体溶液中加入亚砷酸钠溶液(2mg/ml，控制乙酸锰和亚砷酸钠质量比15:1)，在55℃水浴下磁力搅拌30min(转速为200rpm)；得到反应后的脂质体溶液。(7)将所得反应后的脂质体溶液进行超滤系统过滤掉未反应的离子，将超滤后的浓缩液通过脂质体挤出器，用200nm的聚碳酸酯膜推挤30次，得到atmi@mnas
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@lp脂质体。
30.本实施例1中atmi@mnas
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@lp的形态结构如透射电镜(tem)图像所示(图2)。例如，对应图2与图6，经dls测定，atmi@mnasx@lp的平均水动力直径约为192nm。
31.本发明实施例1中atmi@mnas
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@lp成功搭载了小分子抑制剂atmi，通过高效液相(hplc)技术进行证实(图3)。
32.本发明实施例1中atmi@mnas
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@lp成功搭载了砷-锰结合物，通过tem(图4)与射线能量色散谱(eds)(图5)进行证实。
33.本实施例1中atmi@mnas
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@lp脂质体合成性质稳定，包括水合粒径(图6、图7)，多分散性指数(pdi)(图7)与zeta电位(图8)。
34.经x射线光电子能谱学(xps)验证，本实施例1中atmi@mnas
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@lp合成后锰以mn
2+
形式(图9)进行化学动力学治疗产生ros,并通过与h2o2的反应，证实在ph＝5.5(模拟肿瘤细胞溶酶体ph)的条件下atmi@mnas
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@lp能够产生更多ros(图10)。
35.本实施例1中，atmi@mnas
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@lp能够实现ph响应释放，在ph＝5.5(模拟肿瘤细胞溶酶体ph)的条件下atmi@mnas
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@lp能够释放更多的atmi与砷。而在ph＝7.4(模拟血液环境)的条件下药物释放显著减少(图11)，说明atmi@mnas
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@lp具有肿瘤靶向能力，保证药物主要聚集于肿瘤内进行杀伤，提高有效成分的治疗效用。
36.本实施例1中所述atm抑制剂为ku-55933。，当材料合成时，添加的棕榈酰磷脂酰胆碱、甲氧基peg二硬脂酰磷脂酰乙酰胺和胆固醇的摩尔比为20：3：10，棕榈酰磷脂酰胆碱、甲氧基peg二硬脂酰磷脂酰乙酰胺、胆固醇与atmi的摩尔比为60:9:30:1。经过hplc对atmi的定量，计算出atmi的包封率为65.2
±
3.8％。
37.对比例1本发明中atmi@mnas
x
@lp脂质体的制备过程，参照实施例1，区别仅在于：步骤(2)
中，棕榈酰磷脂酰胆碱、甲氧基peg二硬脂酰磷脂酰乙酰胺和胆固醇的摩尔比为8：4：1，导致atmi包封率不高于10％。
38.对比例2本发明中atmi@mnas
x
@lp脂质体的制备过程，参照实施例1，区别仅在于：步骤(2)中，棕榈酰磷脂酰胆碱、甲氧基peg二硬脂酰磷脂酰乙酰胺和胆固醇的摩尔比为12：1：10，会使得合成的脂质体不稳定，dls所测粒径与pdi不稳定。

技术特征：
1.一种atmi@mnas
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@lp脂质体，其特征在于，包括：具有空腔结构的脂质体、负载在脂质体内部空腔的mnas
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纳米颗粒以及搭载在脂质体层间的小分子抑制剂；所述小分子抑制剂选自atm抑制剂。2.根据权利要求1所述的atmi@mnas
x
@lp脂质体，其特征在于，所述具有空腔结构的脂质体组成包含棕榈酰磷脂酰胆碱dppc、甲氧基peg二硬脂酰磷脂酰乙酰胺dspe-mpeg-2000和胆固醇chol；优选地，所述棕榈酰磷脂酰胆碱、甲氧基peg二硬脂酰磷脂酰乙酰胺和胆固醇的摩尔比为(12～20)：(2～4)：(1～10)，优选为20：3：10；所述mnas
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纳米颗粒中mn的化合价主要为2+，其组成包含mnhaso3和mn3(aso3)2。3.根据权利要求1或2所述的atmi@mnas
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@lp脂质体，其特征在于，所述小分子抑制剂的包封率至少为60％，优选至少为70％。所述atm抑制剂为ku-55933、ku-60019和cp-466722中的至少一种。4.根据权利要求1-3中任一项所述的atmi@mnas
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@lp脂质体，其特征在于，所述atmi@mnas
x
@lp脂质体的平均水动力直径为190～900nm。5.一种权利要求1-4中任一项所述的atmi@mnas
x
@lp脂质体的制备方法，包括：(1)将二棕榈酰磷脂酰胆碱、甲氧基peg二硬脂酰磷脂酰乙酰胺和胆固醇溶于有机溶剂中中，得到第一混合溶液；(2)在第一混合溶液中加入小分子抑制剂溶液并混合得到第二混合溶液，再经进行蒸发，得到脂质膜；(3)将脂质膜置于锰盐溶液中进行水化处理后，再加入亚砷酸盐溶液进行沉淀反应，最后经过滤，得到浓缩液；(4)将所得浓缩液过滤通过脂质体挤出器进行多次挤推，得到所述atmi@mnas
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@lp脂质体。6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中：所述有机溶剂选自氯仿、乙醇、二甲基亚砜dmso中的至少一种；所述第一混合溶液中二棕榈酰磷脂酰胆碱、甲氧基peg二硬脂酰磷脂酰乙酰胺和胆固醇总质量浓度为10～25mg/ml。7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中：所述小分子抑制剂溶液的浓度为1～3mg/ml，优选为1mg/ml；所述小分子抑制剂溶液的溶剂选自乙醇，其中易容，较稳定，旋蒸易去除；所述小分子抑制剂溶液和第一混合溶液的体积比为(5～10)：100，优选为9：100；所述蒸发的方式为旋涂蒸发；所述旋涂蒸发的气压为75～130mbar，转速为150～200转/分钟，温度为30～50℃，每1ml第二混合溶液所需时间为10～20分钟。8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中：所述锰盐溶液中锰盐选自乙酸锰，浓度为25～35mg/ml，ph＝7～8；所述亚砷酸盐溶液中亚砷酸盐选自亚砷酸钠，浓度为1～3mg/ml；所述锰盐和亚砷酸盐的质量比为(10～20)：1；所述水化处理的方式为水浴超声处理，功率为600w，时间为20～40分钟所述沉淀反应的方式为水浴磁力搅拌；优选地，所述水浴磁力搅拌的温度为50～60℃，转速为150～250转/分钟，时间为20～40分钟。9.根据权利要求5-8中任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中：所述脂质体挤
出器具有阵列分布的通孔结构，所述通孔结构的孔径为80～120nm；所述脂质体挤出器的直径为15～25mm，孔径为100～200μm；所述脂质体挤出器内所置膜为聚碳酸酯；所述多次的次数为至少为10次，优选至少为20次，更优选至少为30次。10.一种如权利要求1-4中任一项所述的atmi@mnas
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@lp脂质体在制备抗肿瘤药物中的应用。

技术总结
本发明涉及一种ATMi@MnAs


技术研发人员：张坤 赵晴 周航
受保护的技术使用者：上海市第十人民医院
技术研发日：2023.05.09
技术公布日：2023/7/20