中国荷斯坦牛产奶性状相关SNP分子标记及其应用

中国荷斯坦牛产奶性状相关snp分子标记及其应用
技术领域
1.本发明涉及分子生物育种技术领域，尤其涉及中国荷斯坦牛产奶性状相关snp分子标记及其应用。


背景技术：

2.奶牛育种工作与猪、禽等繁殖力高的动物有很大不同，奶牛是单胎动物，繁殖效率低、世代间隔长，母牛绝大多数需要留种繁殖，公牛本身又不表现产奶性状；奶牛育种数据收集工作涉及面广，需要多部门开展联合育种。因此，奶牛育种不可能像猪、家禽、作物那样广泛开展杂交和杂种优势利用，也不可能持续培育新品种，而是在原有品种群体基础上进行长期系统的本品种选育提高，实施品种登记、生产性能测定、体型鉴定、准确遗传评估等育种技术措施，实现奶牛群体的持续遗传改良。
3.奶牛的产奶性状主要由产奶量、乳脂量、乳脂率、乳蛋白量和乳蛋白率等组成，由多基因控制，同时受到包括遗传、营养和环境等多种因素影响。但传统的动物遗传育种是基于表型的选择，期望通过对畜禽表型的直接选择从而间接实现对有利基因的选择，鉴于其遗传基础复杂，表型受环境影响大，很难通过这种传统育种方式取得显著的成效。而分子育种针对所选择的复杂性状在dna水平上进行直接选择，不仅能提高选种的准确性，而且可以加快品种的遗传改良和新品种的培育。因此能找到影响奶牛产奶性状的分子标记，进而应用于标记辅助选择，将可能大大加快遗传研究的进展。
4.奶牛育种过程中期望得到产奶量、乳脂率和乳蛋白率的较高的种牛，通过传统的育种方法无法得到两者兼顾的品种，因此寻求相关分子标记方法是较为有效的辅助选择方法。在育种上间接性状的选择需要根据与之相关的性状或标记进行选择，同样可以取得育种目标，因此也要通过相关标记进行选育。
5.外泌体成分4(exosomecomponent4，exosc4)，又名rrp41，是外泌体的核心亚基之一，是维持外泌体稳定性的必须成分之一。exosc4位于奶牛14号染色体上，大小为1876bp，一共3个外显子。exosc4参与核酸代谢过程和细胞生长的正向调节，在防御病毒响应的上游或内部行动，位于细胞质，核质和转录活性染色质中。exosc4是rna外泌体复合物的成分，具有3'-》5'外切核糖核酸酶活性，并参与多种细胞rna加工和降解事件。在细胞核中，rna外泌体复合物参与稳定rna物种(如rrna，snrna和snorna)的适当成熟，消除rna加工副产物和非编码“普遍”转录物，例如具有加工缺陷的mrna，从而限制或排除其输出到细胞质。rna外泌体可能通过靶向转录的dsdna底物的aicda脱氨活性参与ig类开关重组(csr)和/或ig可变区体细胞超突变(shm)。在细胞质中，rna外泌体复合物参与一般mrna周转，并特异性降解其3'非翻译区域内含有富au元素(are)的固有不稳定mrna，以及rna监视途径，防止异常mrna的翻译。它似乎参与组蛋白mrna的降解。9个亚基的催化无活性rna外泌体核心复合物(exo-9)在核糖核分解rna的结合和呈递中起关键作用，并可以用作催化亚基和辅助蛋白结合的支架。
6.exosc4是动物健康、生长发育和生育性状相关的功能拷贝数变化(cnv)重叠基因。
在多种癌症类型中扩增的rna外泌体成分exosc4是癌细胞存活所必需的条件。在功能上，exosc4过表达通过促进裸鼠细胞增殖和单层集落形成，增强细胞侵袭和迁移研究以及加速异种移植形成来增加早期致瘤能力。而exosc4敲低表现出抑制细胞增殖和侵袭等抗致癌作用，exosc4在结直肠癌的发展和进展中的致癌作用。exosc4也参与多种信号通路，如细胞周期、p53通路和wnt通路，敲低exosc4可以通过抑制wnt途径来抑制上皮性卵巢癌的增殖、迁移和侵袭能力。exosc4有望成为eoc中的新型生物标志物和分子靶标。exosc4也参与了监管抗病毒反应，以减少人乳头瘤病毒感染的角质形成细胞。
7.但，exosc4基因在中国荷斯坦牛中未发现有报道，在genbank和ensembl数据库中也均未发现有报道。


技术实现要素：

8.本发明的目的是提出中国荷斯坦牛产奶性状相关snp分子标记及其应用。
9.本发明的目的之一在于：提供中国荷斯坦牛产奶性状相关snp分子标记，为外泌体成分4基因发生突变，发生突变的区域位于中国荷斯坦牛基因组(来源于ars-ucd1.2)的第14号染色体上第758264至759010位点的碱基处，如seq id no：1所示。
10.具体如下：
11.gctcttcccacagcttgacattgaactgctcctgtggacgggg
12.agggggcaccatgtcacctccccttgagcctggcagacctttg
13.tgactgccttgacccagagtctggcaaaagtgaccctactgac
14.ttctggaggctaggtcttagaacgccacgaatacccactttgtc
15.ttgggaggccaccttggtgccgtgctttgcggaagcccaagct
16.ggatggagaggccacataaaggtgtgctgtctctcagagcccc
17.agttgagccctggccaacagccagcacctgccaccaaagacgt
18.gagggaggaaggcttcacgacaatgctggtcaccatcaacaat
19.gaccacagacaggaaagccccaagtgcacacggccctcagtc
20.cctgtcaatgtcgcctccctgtggtcagtgtcacagccctgctg
21.atttatccttccacgctcaaacctgaagcatgggatctggcttct
22.aagcactgcagaggagctgaataatgccctaagtttagtcctaa
23.gttgtgtctgactcttacaaccccatgagctatagcccaccagt
24.ctcctctgtccgtaagattctccaagcaagaagactggagtgg
25.gttgccatttccttttccaggggaccttcccaagccagggatca
26.aacccaggtctcctccactgcaggtagattctttaccagctgag
27.ccataagagaagcccgaataatgcagatgaggaggggaatgag
28.ctccctgat
29.优选地，所述snp分子标记包括：第一snp分子标记、第二snp分子标记和第三snp分子标记中至少一个。
30.第一snp分子标记位于中国荷斯坦牛基因组的第14号染色体上第758897位点的碱基处(即，如seq id no：1所示核酸序列的第114位碱基处)，该snp分子标记位点具有a/g多态性。
31.第二snp分子标记位于中国荷斯坦牛基因组的第14号染色体上第758888位点的碱基处(即，如seq id no：1所示核酸序列的第123位碱基处)，该snp分子标记位点具有t/c多态性。
32.第三snp分子标记位于中国荷斯坦牛基因组的第14号染色体上第758854位点的碱基处(即，如seq id no：1所示核酸序列的第157位碱基处)，该snp分子标记位点具有c/t多态性。
33.优选地，第一snp分子标记多态性位点的gg基因型的乳脂率显著高于aa基因型和ag基因型，gg基因型的乳蛋白率显著高于aa基因型。
34.优选地，第二snp分子标记多态性位点的cc基因型的乳脂率显著高于tt基因型和tc基因型，cc基因型的乳蛋白率显著高于tt基因型。
35.优选地，第三snp分子标记多态性位点的tt基因型的乳脂率显著高于cc基因型和tc基因型，tt基因型的乳蛋白率显著高于cc基因型。
36.本发明的目的之二在于：提供上述snp分子标记在中国荷斯坦牛产奶性状检测或中国荷斯坦牛育种中的应用。
37.本发明的目的之三在于：提供用于检测上述snp标记的引物对，上游引物为5
’‑
gctcttcccacagcttgacat-3’，下游引物为5
’‑
gaaccccagtgcagtgacttt-3’。
38.本发明的目的之四在于：提供上述引物对在中国荷斯坦牛产奶性状检测或中国荷斯坦牛育种中的应用。
39.本发明的目的之五在于：提供一种试剂盒，含有上述引物对。
40.本发明的目的之六在于：提供一种检测中国荷斯坦牛产奶性状的方法，检测上述snp分子标记的多态性位点基因型。
41.具体地，包括如下步骤：
42.(1)提取牛中包含上述上述snp分子标记的基因组dna；
43.(2)采用上述引物对、步骤(1)所得基因组dna和pcr反应缓冲液进行聚合酶链式反应得到体外扩增产物；
44.(3)对步骤(2)所得体外扩增产物进行高通量测序；
45.(4)对步骤(1)所得酶切产物进行飞行质谱分型，获得各个个体的基因型。
46.优选地，步骤(2)中，聚合酶链式反应体系包括：25μl 2
×
tap-as pcr mix、2μl 10mmol/ml上游引物、2μl 10mmol/ml下游引物、5μl浓度为50ng/μl的dna基因组模板溶液、16μl纯水，其终体积为50μl。
47.优选地，步骤(2)中，聚合酶链式反应的操作具体如下：将50μl聚合酶链式反应体系放入聚合酶链式反应仪器，反应条件如下：
48.①
94℃预变性5min，
49.②
94℃变性30s，
50.③
60℃退火30s，
51.④
72℃延伸30s，
52.⑤
重复第
②
～
④
步骤30个循环，
53.⑥
72℃延伸5min，最后降温至10℃保存，得到体外扩增产物。
54.优选地，采用上述引物对或上述试剂盒进行检测。
55.本发明的目的之七在于：提供一种中国荷斯坦牛育种改良方法，确定中国荷斯坦牛核心群中种牛的上述snp分子标记，并根据中国荷斯坦牛snp分子标记做出相应的选择：种牛的继代选育参照第一snp分子标记多态性位点的gg基因型、第二snp分子标记多态性位点的cc基因型、第三snp分子标记多态性位点的tt基因型，淘汰第一snp分子标记多态性位点的aa基因型、第二snp分子标记多态性位点的tt基因型、第三snp分子标记多态性位点的cc基因型。
56.本技术人在研究中国荷斯坦牛基因组测序结果中，发现exosc4基因(ensbtag00000014607)3’下游区域位置758897的碱基a突变成碱基g，位置758888的碱基t突变成碱基c，位置758854的碱基c突变成碱基t，均为本技术人新发现的snps。
57.本技术人首次发现exosc4基因的chr14:758897、chr14:758888和chr14:758854位点存在多态性，并与牛产奶量、乳脂率、乳蛋白率、305d产奶量存在着显著或极显著相关。因此本技术人分析了中国荷斯坦牛的exosc4基因的突变位点，发现牛exosc4基因的chr14:758897处存在的突变位点(a突变为g)，chr14:758888处存在的突变位点(t突变为c)，chr14:758854处存在的突变位点(c突变为t)。
58.本技术人在457头中国荷斯坦牛中检测了群体多态性，并分析了该位点多态性与中国荷斯坦牛的产奶量、乳脂率、乳蛋白率、305d产奶量的关联性，发现这些位点与产奶量、乳脂率、乳蛋白率、305d产奶量存在着显著相关，可以作为牛的产奶性状的分子标记。
59.其中，g.758897a》g位点与乳脂率、乳蛋白率达到极显著相关(p《0.01)，且g对于两个性状均为优势等位基因。g.758888t》c位点与乳脂率、305d产奶量和乳蛋白率达到极显著相关(p《0.01)，与产奶量呈显著相关(p《0.05)；c对于乳脂率和乳蛋白率性状均为优势等位基因，t对于305d产奶量性状为优势等位基因。g.758854c》t位点与乳脂率、305d产奶量和乳蛋白率达到极显著相关(p《0.01)，与产奶量呈显著相关(p《0.05)；t对于乳脂率和乳蛋白率性状均为优势等位基因，c对于305d产奶量性状为优势等位基因。
60.本发明可以采集奶牛毛囊样或血样，然后经过dna提取、聚合酶链式反应、基因分型等步骤，即可判断每个个体是否具有较高的产奶量、乳脂率、乳蛋白率、305d产奶量的基因型，用于奶牛的育种中对产奶量、乳脂率、乳蛋白率、305d产奶量的辅助选择，实现种牛的早期选种，甚至在奶牛刚出生时就可准确地进行选留。因此该分子标记方法可大大缩短世代间隔，加快选育进程。
61.本发明方法操作简便，聚合酶链式反应过程中条件要求不高，扩增较容易，提高扩增效率及判断基因型的准确性。
附图说明
62.图1为实施例3中exosc4基因pcr扩增琼脂糖凝胶电泳图。
63.图2为实施例4中exosc4基因的snps测序峰图。
64.图3为实施例4中g.758854c》t位点基因分型的散点图。
65.图4为实施例4中g.758888c》t位点基因分型的散点图。
66.图5为实施例4中g.758897c》t位点基因分型的散点图。
具体实施方式
67.下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。
68.实施例1提取牛的基因组dna
69.在奶牛泌乳期内，采集奶牛血液或毛囊样品，并提取基因组dna，所述基因组dna如seq id no：1所示，具体为包含牛的外泌体成分4(exosc4)基因chr14:758888、chr14:758854、chr14:758897位点的核甘酸序列，全长747bp。
70.实施例2引物设计
71.在牛的外泌体成分4(exosc4)基因的chr10:758246至chr10:759010间设计1对引物，即上游引物和下游引物，上游引物的核酸序列如seq id no：2所示，下游引物的核酸序列如seq id no：3所示，具体如下：
72.上游引物：5
’‑
gctcttcccacagcttgacat-3’；
73.下游引物：5
’‑
gaaccccagtgcagtgacttt-3’。
74.实施例3聚合酶链式反应
75.a、配制聚合酶链式反应体系
76.聚合酶链式反应体系包括上游引物、下游引物、pcr反应缓冲液和牛基因组dna，具体如下：
77.在聚合酶链式反应管中，依次加入25μl 2
×
tap-as pcr mix、2μl10mmol/ml上游引物、2μl 10mmol/ml下游引物、5μl浓度为50ng/μl的dna基因组模板溶液、16μl纯水，其终体积为50μl；
78.b、聚合酶链式反应
79.进行聚合酶链式反应，具体如下：
80.将20μl聚合酶链式反应(pcr)体系放入聚合酶链式反应仪器，反应条件如下：
81.①
94℃预变性5min，
82.②
94℃变性30s，
83.③
60℃退火30s，
84.④
72℃延伸30s，
85.⑤
重复第
②
～
④
步骤30个循环，
86.⑥
72℃延伸5min，最后降温至10℃保存，得到体外扩增产物
87.将此扩增产物用浓度为1.5％的琼脂糖凝胶电泳1h(电泳条件：常温，电压120v)，得到exosc4体外扩增产物的凝胶，其结果如图1所示。
88.实施例4中国荷斯坦牛exosc4基因的测序与基因分型
89.将条带单一明亮的pcr反应产物进行一代测序，测序结果用软件chromas进行分析，比对检测到的序列并结合测序峰图，检测到g.758897a》g、g.758888t》c、g.758854c》t这3个snps。
90.snps测序峰图如图2所示，将实施例1中的dna样品进行飞行质谱分型，获得各个个体的基因型。g.758854c》t位点基因分型的散点图如图3所示，g.758888t》c位点基因分型的散点图如图4所示，g.758897a》g位点基因分型的散点图如图5所示。
91.实施例5中国荷斯坦牛实际检测
92.本技术人对457头中国荷斯坦牛exosc4基因对g.758897a》g、g.758888t》c、
g.758854c》t多态性进行检测，如下表所示：
[0093][0094]
由上表可知：g.758897a》g、g.758888t》c、g.758854c》t均具有多态性。
[0095]
其中，g.758888t》c占比较高的等位基因为t，占比较高的基因型为tt，其等位基因频率和基因型频率分别为0.75和0.57；g.758854c》t占比较高的等位基因为c，占比较高的基因型为cc，其等位基因频率和基因型频率分别为0.75和0.57。
[0096]
三个snps均符合哈代温伯格平衡(p》0.05)，通过多态信息量分析发现，g.758897a》g属于高度多态(pic＝0.5)，而g.758888t》c和g.758854c》t则属于中度多态(0.25《pic《0.5)。
[0097]
实施例6中国荷斯坦牛exosc4基因snps与产奶性能的关联分析
[0098]
利用sas9.4软件的一般混合效应模型(mixed)对457头中国荷斯坦牛的产奶量、乳脂率、乳蛋白率、305d产奶量与snps分别进行关联分析，如下表所示：
[0099]
snp产奶量(kg)乳脂率(％)乳蛋白率(％)305d产奶量(kg)g.758897a》g0.12370.0096**0.00076**0.2663g.758888t》c0.0356*0.00002**0.00007**0.0042**g.758854c》t0.0356*0.00002**0.00007**0.0042**
[0100]
注：*表示p＜0.05，代表显著；**表示p＜0.01，代表极显著。
[0101]
由上表可发现：g.758888t》c位点和g.758854c》t位点与乳脂率、305d产奶量和乳蛋白率达到极显著相关(p《0.01)，与产奶量呈显著相关(p《0.05)。g.758897a》g位点与乳脂率和乳蛋白率达到极显著相关(p《0.01)。
[0102]
实施例7中国荷斯坦牛exosc4基因多态性与产奶性能的关联分析
[0103][0104][0105]
注：表中的结果为最小二乘均值
±
标准差；p-value表示snps遗传效应的显著性；*表示p＜0.05，代表显著；**表示p＜0.01，代表极显著。
[0106]
由上表可知：
[0107]
i、g.758897a》g位点与乳脂率、乳蛋白率极显著关联(p《0.01)。对于乳脂率性状，gg型个体乳脂率比aa和ag型个体要高，且差异分别为极显著(p《0.01)和显著(p《0.05)。对于乳蛋白率性状，gg型个体乳蛋白率比aa型个体要高，且差异显著(p《0.05)。
[0108]
ii、g.758888t》c位点与乳脂率、305d产奶量和乳蛋白率关联极显著(p《0.01)，与产奶量显著关联(p《0.05)。对于产奶量性状，tt、tc和cc之间差异均不显著(p》0.05)，tt型个体均值要高于其他两个基因型。对于乳脂率性状，cc型个体乳脂率比tt和tc型个体要高，且差异都极显著(p《0.01)。对于乳蛋白率性状，cc型个体乳蛋白率比tt型个体要高，且差异极显著(p《0.01)，tc型个体乳蛋白率与cc型和tt型差异不显著(p》0.05)。对于305d产奶量性状，tt型个体和tc型个体比cc型个体要高，且差异都显著(p《0.05)
[0109]
iii、g.758854c》t位点与乳脂率、305d产奶量和乳蛋白率关联极显著(p《0.01)，与产奶量显著关联(p《0.05)。对于产奶量性状，tt、tc和cc之间差异均不显著(p》0.05)，cc型个体均值要高于其他两个基因型。对于乳脂率性状，tt型个体乳脂率比cc和tc型个体要高，且差异都极显著(p《0.01)。对于乳蛋白率性状，tt型个体乳蛋白率比cc型个体要高，且差异极显著(p《0.01)，tc型个体乳蛋白率与cc型和tt型差异不显著(p》0.05)。对于305d产奶量性状，cc型个体和tc型个体比tt型个体要高，且差异都显著(p《0.05)。
[0110]
综上所述，g.758897a》g位点对于乳脂率、乳蛋白率的优良等位基因均为g，优良基因型均为gg型，因此可以选择基因型为gg型的个体留种，提高等位基因g的频率，从而获得乳脂率和乳蛋白率更高的奶牛个体，加快选育进程。
[0111]
g.758888t》c位点对于乳脂率、乳蛋白率的优良等位基因均为c，优良基因型均为cc型，因此可以选择基因型为cc型的个体留种，提高等位基因c的频率，从而获得乳脂率和乳蛋白率更高的奶牛个体；对于产奶量、305d产奶量的优良等位基因均为t，优良基因型均为tt型，因此可以选择基因型为tt型的个体留种，提高等位基因t的频率，从而获得产奶量、305d产奶量更高的奶牛个体加快选育进程。
[0112]
g.758854c》t位点对于乳脂率、乳蛋白率的优良等位基因均为t，优良基因型均为tt型，因此可以选择基因型为tt型的个体留种，提高等位基因t的频率，从而获得乳脂率和乳蛋白率更高的奶牛个体；对于产奶量、305d产奶量的优良等位基因均为c，优良基因型均为cc型，因此可以选择基因型为cc型的个体留种，提高等位基因c的频率，从而获得产奶量、305d产奶量更高的奶牛个体加快选育进程。
[0113]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.中国荷斯坦牛产奶性状相关snp分子标记，其特征在于，为外泌体成分4基因发生突变，所述发生突变的区域位于中国荷斯坦牛基因组的第14号染色体上第758264至759010位点的碱基处，如seq id no：1所示。2.根据权利要求1所述snp分子标记，其特征在于，包括：第一snp分子标记、第二snp分子标记和第三snp分子标记中至少一个；第一snp分子标记位于中国荷斯坦牛基因组的第14号染色体上第758897位点的碱基处，该snp分子标记位点具有a/g多态性；第二snp分子标记位于中国荷斯坦牛基因组的第14号染色体上第758888位点的碱基处，该snp分子标记位点具有t/c多态性；第三snp分子标记位于中国荷斯坦牛基因组的第14号染色体上第758854位点的碱基处，该snp分子标记位点具有c/t多态性。3.根据权利要求1所述snp分子标记，其特征在于，第一snp分子标记多态性位点的gg基因型的乳脂率显著高于aa基因型和ag基因型，gg基因型的乳蛋白率显著高于aa基因型；优选地，第二snp分子标记多态性位点的cc基因型的乳脂率显著高于tt基因型和tc基因型，cc基因型的乳蛋白率显著高于tt基因型；优选地，第三snp分子标记多态性位点的tt基因型的乳脂率显著高于cc基因型和tc基因型，tt基因型的乳蛋白率显著高于cc基因型。4.如权利要求1-3任一项所述snp分子标记在中国荷斯坦牛产奶性状检测或中国荷斯坦牛育种中的应用。5.一种用于检测权利要求1-3任一项所述snp标记的引物对，其特征在于，上游引物为5
’‑
gctcttcccacagcttgacat-3’，下游引物为5
’‑
gaaccccagtgcagtgacttt-3’。6.如权利要求5所述引物对在中国荷斯坦牛产奶性状检测或中国荷斯坦牛育种中的应用。7.一种试剂盒，其特征在于，含有权利要求5所述引物对。8.一种检测中国荷斯坦牛产奶性状的方法，其特征在于，检测如权利要求1-3任一项所述snp分子标记的多态性位点基因型。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，采用权利要求5所述引物对或权利要求7所述试剂盒进行检测。10.一种中国荷斯坦牛育种改良方法，其特征在于，确定中国荷斯坦牛核心群中种牛的如权利要求1或2中所述snp分子标记，并根据中国荷斯坦牛snp分子标记做出相应的选择：种牛的继代选育参照第一snp分子标记多态性位点的gg基因型、第二snp分子标记多态性位点的cc基因型、第三snp分子标记多态性位点的tt基因型，淘汰第一snp分子标记多态性位点的aa基因型、第二snp分子标记多态性位点的tt基因型、第三snp分子标记多态性位点的cc基因型。

技术总结
本发明公开了中国荷斯坦牛产奶性状相关SNP分子标记，为外泌体成分4基因发生突变，所述发生突变的区域位于中国荷斯坦牛基因组的第14号染色体上第758264至759010位点的碱基处，如SEQ ID NO：1所示。本发明公开了上述SNP分子标记在中国荷斯坦牛产奶性状检测或中国荷斯坦牛育种中的应用。本发明公开了用于检测上述SNP标记的引物对。本发明公开了上述引物对在中国荷斯坦牛产奶性状检测或中国荷斯坦牛育种中的应用。本发明公开了一种试剂盒，含有上述引物对。本发明公开了一种检测中国荷斯坦牛产奶性状的方法。本发明公开了一种中国荷斯坦牛育种改良方法。斯坦牛育种改良方法。斯坦牛育种改良方法。


技术研发人员：郑先瑞 殷宗俊 常健飞 吴雅婷 张志勇 时坤鹏
受保护的技术使用者：安徽农业大学
技术研发日：2023.05.08
技术公布日：2023/7/20