一种PCV2抗体效价的检测方法与流程

一种pcv2抗体效价的检测方法
技术领域
1.本发明涉及抗体效价检测技术领域，特别涉及一种pcv2抗体效价的检测方法。


背景技术：

2.猪圆环病毒(pcv)属于圆环病毒科圆环病毒属。病毒粒子直径14－17nm，呈20面体对称结构，无囊膜。现已知pcv有3个血清型，即pcv1、pcv2和pcv3。pcv2基因组主要包括2个开放的阅读框架(orf1和orf2)，其中orf2编码病毒衣壳蛋白(capsid protein，cap)。cap是pcv2的主要的结构蛋白。猪圆环病毒2型(pcv2)是断奶仔猪多系统衰竭综合征，皮炎与肾病综合征的主要病原，该病以免疫抑制和断奶仔猪多系统衰竭为特指，病猪主要表现为生长发育不良、贫血、呼吸困难、腹泻、衰弱、增重迟缓、淋巴结肿大等临床症状。疫苗免疫是控制pcv2感染及其相关疾病的重要手段。目前有全病毒灭活后制备的圆环病毒灭活疫苗、大肠杆菌表达系统表达的pcv2cap抗原制备的大肠杆菌重组圆环灭活疫苗、昆虫细胞杆状病毒表达系统表达的pcv2 cap抗原制备的重组杆状病毒圆环灭活疫苗，其中重组杆状病毒圆环灭活疫苗因其cap蛋白含量高、免疫效果好，被广泛使用。
3.圆环灭活疫苗的研制、生产和使用中有定量检测实验动物pcv2抗体效价的需求。这就需要敏感、特异的抗原含量测定方法。其中，中和实验法检测pcv2抗体效价，需培养细胞和pcv2病毒，耗时长、操作步骤多；elisa方法检测pcv2抗体效价，操作步骤多，耗材、试剂、设备昂贵。
4.间接血凝法(iha)是以红细胞为载体的间接凝集试验，即用已知的抗原致敏红细胞，然后与被检样品在适宜的条件下反应，如果被检样品中含有抗原相应的抗体，则抗原和抗体会发生特异性结合，红细胞随反应的发生出现肉眼可见的凝集现象。iha是一种常用的定性、定量检测抗体的方法。iha常用于定性检测抗体，从而作为疫病诊断方法使用。iha定量检测抗体效价
5.从而评估疫苗免疫效果，一直未被广泛应用。皆因为此方法存在一些缺点：1)不同实验室制备的致敏红细胞的检测结果不一致、不同批次致敏红细胞检测结果不一致；2)某些病毒类抗原按现有的培养方法难以获得高病毒含量的抗原液，需做高倍浓缩后纯化，才能用于iha红细胞的制备，所以iha所用的致敏红细胞的生产成本较高；3)iha方法的使用环节较简单，但建立检测某抗体的iha方法并不容易，各试剂的配方、作用温度、作用时间等细节会导致iha方法不成立。
6.因此，综上所述，有必要开发一种定量检测pcv2抗体效价的iha方法，以解决现存在的间接血凝法不同批次致敏红细胞检测结果不一致、抗原需高倍浓缩的技术问题。


技术实现要素：

7.本发明的主要目的是提出一种测定pcv2抗体效价的间接血凝方法，旨在解决目前间接血凝法中存在的不同批次致敏红细胞检测结果不一致、抗原需高倍浓缩的技术问题。
8.为实现上述目的，本发明提供一种pcv2抗体效价的检测方法，所述pcv2抗体效价
的检测方法包括以下步骤：
9.s10、用稀释液分别梯度稀释被检样品和参照样品，得多个稀释的被检样品和多个稀释的参照样品；
10.s20、向多个稀释的被检样品和多个稀释的参照样品中分别加入致敏红细胞悬液，混合、静置，得多个稀释的被检样品凝集混合液和多个稀释的参照样品凝集混合液，根据多个稀释的被检样品凝集混合液的致敏红细胞凝集情况确定被检样品效价，根据多个稀释的参照样品凝集混合液的致敏红细胞凝集情况确定参照样品效价；多次重复测定参照样品获得参照样品的多个效价测定值，根据参照样品多个效价测定值获得标定的参照样品效价；
11.s30、根据公式计算被检样品的pcv2抗体效价，被检样品的pcv2抗体效价＝(被检样品效价
÷
参照样品效价)
×
标定的参照样品效价。
12.可选地，步骤s10之前还包括配制致敏红细胞悬液，所述配制致敏红细胞悬液配制步骤如下：
13.s101、将绵羊红细胞经洗涤、醛化、鞣化后用缓冲液重悬，得重悬液；
14.s102、所述重悬液中添加pcv2 cap抗原致敏，随后添加防腐剂，得致敏红细胞悬液。
15.可选地，在步骤s101中，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液，其中，所述磷酸盐缓冲液的ph值为6.4～7.2；和/或，
16.所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.01～0.1mol/l。
17.可选地，在步骤s102中，所述pcv2 cap抗原的制备方法包括：
18.将含有pcv2 cap蛋白基因的重组杆状病毒接种昆虫细胞，培养后得到含有pcv2 cap的培养液；将所述培养液离心并层析纯化，得到pcv2 cap抗原。
19.可选地，在步骤s10中，所述稀释液为含兔血清的磷酸盐缓冲液，其中，所述磷酸盐缓冲液的ph值为7～7.4；和/或，
20.所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.01～0.1mol/l。
21.可选地，在步骤s10中，所述被检样品包括含pcv2抗体的猪血清、含pcv2抗体的兔血清和含pcv2抗体的鼠血清中的任一种。
22.可选地，在步骤s10中，所述参照样品包括含pcv2抗体的猪血清、兔血清或鼠血清。
23.可选地，步骤s20所述致敏红细胞凝集情况包括100％致敏红细胞凝集、75％致敏红细胞凝集、50％致敏红细胞凝集、25％致敏红细胞凝集、0％致敏红细胞凝集中的任一种。
24.可选地，所述被检样品效价为多个稀释的被检样品中使致敏红细胞50％凝集的最高稀释倍数；和/或，
25.所述参照样品效价为多个稀释的参照样品中使致敏红细胞50％凝集的最高稀释倍数。
26.可选地，步骤s20中，所述标定的参照样品效价通过以下方式获得：
27.用不少于5批的致敏红细胞检测参照样品获得参照样品的多个效价测定值；
28.计算参照样品的多个效价测定值的几何平均值，作为标定的参照样品效价。
29.本发明公开了一种测定血清中pcv2抗体效价的间接血凝方法，该方法先配制适合的致敏红细胞悬液，获得敏感性高、特异性好的致敏红细胞。
30.同时还设置了参照样品，使得被检样品检测结果与参照样品检测结果比对计算，
能够获得相对准确的检测结果，解决了不同批次致敏红细胞检测结果不一致的问题，由此建立的检测pcv2抗体效价间接血凝方法检测结果稳定、准确，可用于定量pcv2抗体效价，从而评估免疫了pcv2疫苗的实验动物的体液免疫情况。该方法所涉及的均为实验室常用的低价试剂、设备、耗材，每个样品的检测成本低。致敏红细胞、参照样品易于长时间保存，稀释液配方简单、易配制。该方法操作简单、方便快速，无需特殊设备和仪器，全程在2～3小时内完成，适合在研发、质检等环节应用，快速获得抗体效价结果。
附图说明
31.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
32.图1为本发明实施例中致敏红细胞不同凝集程度的实例展示图；
33.图2为本发明实施例5的样品1～8凝集结果图；
34.图3为本发明实施例5的样品9～16凝集结果图；
35.图4为本发明实施例5的样品17～23及参照样品凝集结果图。
具体实施方式
36.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
37.另外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。
38.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
39.猪圆环病毒2型(pcv2)是断奶仔猪多系统衰竭综合征，皮炎与肾病综合征的主要病原，该病以免疫抑制和断奶仔猪多系统衰竭为特指，病猪主要表现为生长发育不良、贫血、呼吸困难、腹泻、衰弱、增重迟缓、淋巴结肿大等临床症状。疫苗免疫是控制pcv2感染及其相关疾病的重要手段。检测实验动物血清中的pcv2抗体效价是评估疫苗质量重要手段。
40.鉴于此，本发明提出一种pcv2抗体效价的检测方法，旨在解决目前间接血凝法中存在的不同批次致敏红细胞检测结果不一致、抗原需高倍浓缩的技术问题。本发明附图中，本发明实施例中判断致敏红细胞不同凝集程度的标准图如附图1所示；图2～图4为本发明实施例5的结果图。
41.本发明提出一种pcv2抗体效价的检测方法，所述pcv2抗体效价的检测方法采用间接血凝法，所述pcv2抗体效价的检测方法包括以下步骤：
42.s10、用稀释液分别梯度稀释被检样品和参照样品，得多个稀释的被检样品和多个稀释的参照样品；
43.s20、向多个稀释的被检样品和多个稀释的参照样品中分别加入致敏红细胞悬液，混合、静置，得多个稀释的被检样品凝集混合液和多个稀释的参照样品凝集混合液，根据多个稀释的被检样品凝集混合液的致敏红细胞凝集情况确定被检样品效价，根据多个稀释的参照样品凝集混合液的致敏红细胞凝集情况确定参照样品效价；多次重复测定参照样品获得参照样品的多个效价测定值，根据参照样品多个效价测定值获得标定的参照样品效价；
44.s30、根据公式计算被检样品的pcv2抗体效价，被检样品的pcv2抗体效价＝(被检样品效价
÷
参照样品效价)
×
标定的参照样品效价。
45.本发明公开了一种测定血清中pcv2抗体效价的间接血凝方法，该方法用先配制适合的致敏红细胞悬液。此方法获得的致敏红细胞的敏感性高、特异性好。同时，本发明还设置了参照样品，使得被检样品检测结果与参照样品检测结果比对计算，能够获得相对准确的检测结果，解决了不同批次致敏红细胞检测结果不一致的问题。由此建立的检测pcv2抗体效价间接血凝方法检测结果稳定、准确，可用于定量pcv2抗体效价，从而评估疫苗质量。
46.进一步地，步骤s10之前还包括配制致敏红细胞悬液，所述配制致敏红细胞悬液配制步骤如下：
47.s101、将绵羊红细胞经洗涤、醛化、鞣化后用缓冲液重悬，得重悬液；
48.s102、所述重悬液中添加pcv2 cap抗原致敏，随后添加防腐剂，得致敏红细胞悬液。
49.具体地，步骤s101操作步骤如下：将绵羊红细胞经洗涤液1洗涤、戊二醛和/或甲醛醛化、洗涤液1洗涤、鞣酸鞣化、洗涤液2洗涤，获得含红细胞体积浓度为1％～5％的醛化鞣化红细胞；
50.将醛化鞣化红细胞离心，沉淀的红细胞用缓冲液重悬，得重悬液，再向其中加入等体积的缓冲液稀释的pcv2 cap抗原，37℃孵育20～60分钟，用稀释液洗涤，用稀释液重悬，获得红细胞体积浓度为1％的致敏红细胞悬液；
51.随后，向所述重悬液中添加1％体积的防腐剂，获得最终的致敏红细胞悬液，用以备后续实验取用。
52.需要说明的是上述所用试剂具体为：所述洗涤液1为0.01～0.1mol/l的ph7.0～7.4的磷酸盐缓冲液；
53.所述洗涤液2为0.01～0.1mol/l的ph6.2～6.6的磷酸盐缓冲液；
54.所述缓冲液为0.01～0.1mol/l的ph6.2～7.2的磷酸盐缓冲液；
55.所述稀释液为含1％健康兔血清体积浓度的0.01～0.1mol/l的ph7.0～7.4的磷酸盐缓冲液；
56.所述防腐剂为1％质量体积浓度的叠氮钠或硫柳汞。
57.其中，所述鞣酸鞣化的具体操作为：用洗涤液1配制质量体积浓度为1:10000～1:50000的鞣酸溶液，与1％～5％体积浓度的醛化红细胞等体积混合，37℃孵育10～30分钟。
58.所述戊二醛和/或甲醛醛化包括3种方法，具体如下：
59.方法1：用洗涤液1配制0.5％～2.5％质量体积浓度的戊二醛，与5％～10％体积浓度的红细胞等体积混合，2～8℃、搅拌条件下孵育2～10小时，用洗涤液1洗2～4次，用洗涤
液1重悬为5％～10％体积浓度的红细胞，即为醛化红细胞；
60.方法2：用洗涤液1配制1％～5％质量体积浓度的甲醛，与5％～10％体积浓度的红细胞等体积混合，室温、搅拌条件下孵育16～24小时，用洗涤液1洗2～4次，用洗涤液1重悬为5％～10％体积浓度的红细胞，即为醛化红细胞；
61.方法3：用洗涤液1配制0.5％～2.5％质量体积浓度的戊二醛，与5％～10％体积浓度的红细胞等体积混合，2～8℃、搅拌条件下孵育2～10小时后用洗涤液1洗2～4次，用洗涤液1重悬为5％～10％体积浓度的红细胞，再用洗涤液1配制1％～5％质量体积浓度的甲醛，与5％～10％体积浓度的红细胞等体积混合，室温、搅拌条件下孵育16～24小时，用洗涤液1洗2～4次，用洗涤液1重悬为5％～10％体积浓度的红细胞，即为醛化红细胞。
62.进一步地，为了解决现存在的抗原需高倍浓缩的技术问题，在步骤s102中，所述pcv2 cap抗原的制备方法包括：将含有pcv2 cap蛋白基因的重组杆状病毒接种昆虫细胞，培养后得到含有pcv2 cap的培养液；将所述含有pcv2 cap的培养液离心并层析纯化，得到pcv2 cap抗原。
63.需要说明的是：本发明用含有pcv2 cap蛋白基因的重组杆状病毒接种昆虫细胞，收获病毒培养液，离心获得培养液上清，培养液上清中pcv2 cap蛋白含量高，培养液上清经层析方法纯化获得含量和纯度均较高的pcv2 cap抗原，获得的pcv2 cap抗原约1000倍稀释后仍可用于致敏红细胞，解决了现有技术中“抗原需高倍浓缩”的问题。本发明使用的昆虫细胞-杆状病毒表达系统主要含两个物质，1是表达pcv2 cap蛋白的重组杆状病毒，2是昆虫细胞，表达的蛋白自行组装形成了pcv2病毒样颗粒，而且量很多。将这个培养液纯化，获得pcv2 cap抗原(液)，另外，实际中，大肠杆菌表达系统也能制备高pcv2 cap蛋白含量的抗原。优选地，本实施例选用pcv2 cap抗原。
64.此方法获得的致敏红细胞可用于间接血凝方法检测猪、兔、鼠血清的pcv2抗体效价，从而评估疫苗免疫实验动物后抗体产生情况。同时该方法制备的pcv2 cap致敏用抗原，成本低(可以高倍稀释后使用)，建立的方法敏感性、特异性好。
65.进一步地，在步骤s102中，所述pcv2 cap抗原区别于pcv2全病毒，是因为理论上在实验过程中发现，使用所述pcv2 cap抗原，有如下2点优势：
66.1)理论上，pcv2全病毒接种哺乳动物细胞扩繁pcv2全病毒，由此获得的pcv2全病毒量少，需高倍浓缩才有可能致敏红细胞并获得较优结果，但试验中15倍浓缩的pcv2全病毒培养液致敏的红细胞，也不能被pcv2阳性血清凝集(详见实施例1中的相关实验)；含有pcv2 cap蛋白基因的重组杆状病毒接种昆虫细胞获得的培养液中pcv2 cap蛋白含量高，并且cap蛋白自我组装形成了pcv2病毒样颗粒，pcv2病毒样颗粒是不含遗传物质的，与pcv2全病毒的形态、免疫原性和反应原性高度相近或相同。所以杆状病毒-昆虫细胞表达系统制备的pcv2 cap抗原含量高、反应原性好，建立的检测方法更敏感。
67.2)pcv2全病毒接种哺乳动物细胞扩繁pcv2全病毒，病毒灭活前要严格做到生物安全，避免散毒；杆状病毒不感染脊椎动物，生物安全方面具有优势。
68.优选地，s10步骤中，用稀释液分别梯度稀释被检样品和参照样品，得稀释后的被检样品和稀释后的参照样品；
69.进一步地，进行s10步骤时，所述稀释液为1％健康的兔血清的磷酸盐缓冲液，其中，所述磷酸盐缓冲液的ph值为7～7.4；和/或，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.01～0.1mol/
l。
70.具体地，步骤s10的操作为：在96孔血凝板各孔中加入0.025ml稀释液，各行第1孔分别加入0.025ml的被检样品或参照样品，第1孔混匀后取0.025ml加入至第2孔，如此第1孔开始2倍系列稀释至第11孔，第11孔混匀后弃去0.025ml，获得不同稀释倍数的被检样品和不同稀释倍数的参照样品，第12孔为稀释液孔(即阴性对照孔)。
71.优选地，在s20步骤中，分别向所述稀释的被检样品和所述稀释的参照样品加入致敏红细胞悬液混合、静置后获得凝集混合液，所述凝集混合液的结果包括使所述致敏红细胞50％凝集，其中，使所述致敏红细胞悬液50％凝集的最高稀释倍数为效价；
72.具体地，步骤s20的具体操作为：
73.向不同稀释度的被检样品、不同稀释度的参照样品的孔和阴性对照孔中加入所述致敏红细胞悬液0.025ml，将96孔血凝板置于振荡器上高速振荡混匀10～20秒；将96孔血凝板室温静置，等阴性对照孔呈现清晰“点儿”状时，判定各孔凝集情况，以使致敏红细胞50％凝集的最高稀释倍数分别为被检样品效价和参照样品效价。
74.进一步地：所述被检样品包括含pcv2抗体的猪血清、含pcv2抗体的兔血清和含pcv2抗体的鼠血清中的任一种，所述参照样品包括含pcv2抗体的猪、兔、鼠血清。换言之，通过本技术的这个方法可以测定猪血清中的pcv2抗体，也可以测定兔血清中的pcv2抗体，也可以测定鼠血清中的pcv2抗体。
75.需要说明的是：致敏红细胞凝集判定方法为：
76.100％凝集，即完全凝集，红细胞呈细沙粒样均匀铺于孔底，记录为++++或#；
77.75％凝集，红细胞呈细沙粒样均匀铺于孔底，但有极少量或少量红细胞沉积于孔底，形成“点儿”状，记录为+++；
78.50％凝集，“点儿”的面积小于等于0％凝集“点儿”的面积的50％，“点儿”的直径小于等于0％凝集“点儿”的直径的7/10；“点儿”的颜色明显淡于0％凝集“点儿”的颜色，记录为++；
79.25％凝集，“点儿”的面积略小于0％凝集“点儿”的面积，“点儿”的直径略小于0％凝集“点儿”的直径；“点儿”的颜色略淡于0％凝集“点儿”的颜色，记录为+；
80.0％凝集，即不凝集，红细胞沉积于孔底，形成“点儿”状，“点儿”的面积、直径、颜色同阴性对照孔的“点儿”的面积、直径、颜色，记录为-。
81.阴性对照孔中的红细胞出现钮扣状沉积时判定被检样品效价，即红细胞0％凝集、红细胞不凝集、红细胞沉积于孔底、红细胞在孔底形成“点儿”状。以使致敏红细胞50％凝集的样品的最高稀释度为该待测样品的间接血凝效价，如无50％凝集则以75％，如也无75％凝集则以100％凝集的最高稀释度为该待测样品的间接血凝效价。举例，如32倍稀释的样品使致敏红细胞50％凝集且32是使致敏红细胞50％凝集的最高稀释倍数，则样品的效价为32，记录为32或25或5log2，其中5log2为业内的常用记录方法。
82.具体地，100％致敏红细胞凝集、75％致敏红细胞凝集、50％致敏红细胞凝集、25％致敏红细胞凝集、0％致敏红细胞凝集的样式图片如图1所示。
83.优选地，在s30步骤中，根据公式计算被检样品的pcv2抗体效价，被检样品的pcv2抗体效价＝(被检样品效价
÷
参照样品效价)
×
标定的参照样品效价，其中，所述被检样品效价为被检样品中使致敏红细胞50％凝集的最高稀释倍数；所述参照样品效价为参照样品
中使致敏红细胞50％凝集的最高稀释倍数。
84.首先标定的参照样品效价是已知的，所述标定的参照样品效价为经过多人次、使用多批次致敏红细胞测得效价的几何平均值；被检样品的pcv2抗体效价＝(被检样品效价
÷
参照样品效价)
×
标定的参照样品效价。其中，所述标定的参照样品效价的标定方法包括：用不少于5批的致敏红细胞检测参照样品效价，每批红细胞检测不少于3次；
85.将测得的参照样品的效价计算几何平均值，即为标定的参照样品效价。举例，如5log2、7log2、9log2、6log2、7log2、8log2的几何平均值为7log2。举例说明几何平均值和算数平均值计算方法的区别：32(25)、128(27)、512(29)的几何平均值是2(5+7+9)
÷
3＝27＝128；32、128、512的算数平均值是(32+128+512)
÷
3＝224。
86.综上可知，本发明建立了检测血清中pcv2抗体效价的间接血凝方法。用于致敏红细胞的pcv2 cap抗原的制备方法包括以下步骤：1)表达pcv2cap蛋白的重组杆状病毒接种昆虫细胞并培养数日；2)将培养物离心，获得的培养液上清中含有pcv2 cap抗原；3)培养液上清经层析方法纯化后获得用于致敏红细胞的pcv2 cap抗原。创新的使用了杆状病毒表达系统制备的pcv2 cap抗原致敏红细胞，获得了准确的、敏感的、特异的定量检测pcv2抗体效价的方法；通过设置参照样品，使抗体效价结果更稳定。由此建立的检测血清中pcv2抗体效价的间接血凝方法，可用评价pcv2疫苗的免疫效果。
87.以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。
88.实施例1致敏红细胞最优抗原种类和最优致敏浓度的研究
89.1.1材料
90.常规方法制备的1％醛化-鞣酸化绵羊红细胞。
91.抗原1：表达pcv2 cap蛋白的重组杆状病毒接种昆虫细胞并培养数日后，将培养物离心获得的培养液上清，培养液上清经3倍浓缩和层析纯化后的样品。
92.抗原2：pcv2全病毒接种适宜哺乳动物细胞，在适宜条件效培养数日后，将培养物离心获得的培养液上清，培养液上清经30倍浓缩和层析纯化后的样品。
93.0.1mol/l ph 6.4的磷酸盐缓冲液(简称ph6.4缓冲液)。
94.稀释液：含有1％健康兔血清的ph7.2的0.1mol/l的磷酸盐缓冲液。
95.pcv2疫苗免疫猪的血清，用稀释液100倍稀释后作为被检样品(在实施例1中称为被检样品)。
96.1.2方法
97.用ph6.4缓冲液分别稀释抗原1，使稀释倍数为800、1600、3200、6400、12800、25600；用ph6.4缓冲液分别稀释抗原2，使稀释倍数为2、4、8、16、32、64。
98.1％醛化-鞣酸化绵羊红细胞与各稀释度的抗原1和抗原2以1:1的体积比混合，37℃孵育30min，离心沉积红细胞用稀释液悬起，制成1％致敏红细胞悬液。
99.(1)96孔v型底血凝板，各孔加入稀释液25μl；
100.(2)各行第1孔加入被检样品25μl，从第1孔开始进行2倍倍比稀释至第11孔，混匀后弃去25μl；第12孔为阴性对照孔；
101.(3)各行加入不同抗原不同稀释度致敏的红细胞25μl，震荡血凝板混匀，室温静置1.5～2小时，第12孔孔底红细胞出现钮扣状沉积时判定效价结果；
102.(4)被检样品效价最高的致敏红细胞对应的抗原的最高稀释度为最适抗原和稀释度。
103.1.3结果
104.被检样品的间接血凝效价见表1。3200倍稀释的抗原1致敏红细胞均可用于测定猪血清的pcv2抗体效价。抗原2致敏红细胞不能测定猪血清的pcv2抗体效价。
105.本实施例所用的抗原1是表达pcv2 cap蛋白的重组杆状病毒接种昆虫细胞并培养数日后，将培养物离心获得的培养液上清，培养液上清经3倍浓缩和层析纯化后的样品。抗原1致敏红细胞的最适稀释倍数是3200倍。由此可知：采用本发明pcv2 cap蛋白基因的重组杆状病毒接种昆虫细胞，培养后，得到pcv2 cap抗原，抗原含量较高，抗原不需要高倍浓缩即可用于致敏红细胞。
106.本实施例所用的抗原2是pcv2全病毒接种适宜哺乳动物细胞，在适宜条件效培养数日后，将培养物离心获得的培养液上清，培养液上清经30倍浓缩和层析纯化后的样品。抗原2经2倍稀释致敏红细胞，无法测定猪血清的pcv2抗体效价。由此可知：15倍浓缩的pcv2全病毒培养液上清致敏红细胞用于测定pcv2抗体效价，方法不成立。
107.表1被检样品的间接血凝效价(单位log2)
108.抗原1稀释倍数8001600320064001280025600被检样品效价≥11≥1111961抗原2稀释倍数248163264被检样品效价＜1＜1＜1＜1＜1＜1
109.实施例2不同批次抗原致敏红细胞检测参照样品的结果比较
110.2.1材料
111.常规方法制备的1％醛化-鞣酸化绵羊红细胞；
112.表达pcv2 cap蛋白的重组杆状病毒接种昆虫细胞并培养数日后，将培养物离心获得的培养液上清，经层析纯化后的样品：抗原1～抗原5。上述抗原制备后-40℃保存了不同时长(0～5年不等)。
113.0.1mol/l ph 6.4的磷酸盐缓冲液(简称ph6.4缓冲液)。
114.稀释液：含有1％健康兔血清的ph7.2的0.1mol/l的磷酸盐缓冲液。
115.参照样品：100倍稀释的猪血清。
116.2.2方法
117.2.2.1确定抗原的最优致敏稀释度
118.ph6.4缓冲液稀释抗原1～抗原5，使稀释倍数为250、500、1000、2000、4000、8000倍。加入等体积的1％醛化-鞣酸化绵羊红细胞混合，37℃孵育30min，离心沉积红细胞用稀释液原体积重悬，制成1％致敏红细胞悬液。
119.获得上述致敏红细胞分别检测参照样品的效价，其中，参照样品效价最高(与最高效价差1log2或2log2也视为最高效价)的致敏红细胞对应的抗原的最高稀释度为最适抗原和稀释度，测试结果见表2。
120.2.2.2各抗原以确定的最优稀释度分别致敏红细胞，各制备20ml 1％致敏红细胞。
121.2.2.3以各抗原制备的致敏红细胞检测参照样品效价，检测3次。
122.2.3结果
123.2.3.1抗原1～抗原5最优致敏稀释倍数分别为1000、1000、1000、1000、500。
124.表2被检样品效价(log2)
[0125][0126]
2.3.2制备的红细胞检测参照样品，结果见表3。据此结果，将参照样品的效价计算几何平均值，取整数值，所以定为9log2。
[0127]
表3检测结果(log2)
[0128][0129]
实施例3制备致敏红细胞
[0130]
3.1材料
[0131]
常规方法制备的1％醛化-鞣酸化绵羊红细胞
[0132]
表达pcv2 cap蛋白的重组杆状病毒接种昆虫细胞并培养数日后，将培养物离心获得的培养液上清，再经层析纯化获得的样品(简称抗原1)，经最优致敏浓度研究确定其最优致敏浓度为1000倍稀释。
[0133]
0.1mol/l ph 6.4的磷酸盐缓冲液(简称ph6.4缓冲液)。
[0134]
稀释液：含有1％健康兔血清的ph7.2的0.1mol/l的磷酸盐缓冲液。
[0135]
3.2方法
[0136]
最优致敏浓度是致敏红细胞的抗原的最低使用量，实际使用中增加使用量会使致敏效果更有保证。所以本次配制抗原溶液：100ml ph6.4缓冲液中加入250μl抗原1，使稀释倍数为400倍。
[0137]
100ml 1％醛化-鞣酸化绵羊红细胞与100ml抗原溶液混合，37℃孵育30min，离心
沉积红细胞用100ml稀释液悬起，添加1％硫柳汞1ml混匀，制成1％致敏红细胞悬液。
[0138]
3.3结果
[0139]
配制了100ml 1％致敏红细胞悬液。
[0140]
实施例4检测猪、兔、小鼠血清的特异性、敏感性
[0141]
4.1材料
[0142]
实施例3制备的1％致敏红细胞
[0143]
稀释液：含有1％健康兔血清的ph7.2的磷酸盐缓冲液。
[0144]
样品1～样品6分别为：猪、兔、小鼠pcv2阴性血清，猪、兔、小鼠pcv2阳性血清。样品7～样品11为常见猪病毒病的猪阳性血清，分别为猪瘟、猪蓝耳、猪伪狂犬、猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻的猪阳性血清。
[0145]
参照样品：pcv2疫苗免疫猪的血清，100倍稀释后分装，-20℃保存，其标定的效价为9log2。
[0146]
4.2方法
[0147]
样品1～样品6，用稀释液100倍稀释后做后续检测。
[0148]
(1)96孔v型底血凝板，各孔加入稀释液25μl；
[0149]
(2)第1列每孔分别加入样品1～样品6、参照样品，各25μl，从第1孔开始进行2倍倍比稀释至第11孔，混匀后弃去25μl；
[0150]
(3)每孔加入致敏红细胞25μl。振荡血凝板使内容物混匀，室温静置1.5～2.5小时，第12孔孔底红细胞出现钮扣状沉积时判定结果；
[0151]
(4)判定各孔凝集结果及各样品效价、参照样品效价；
[0152]
(5)修正后的被检样品效价＝(被检样品效价
÷
参照样品效价)
×
标定的参照样品效价。
[0153]
4.3结果
[0154]
检测结果见表4。猪、兔、小鼠pcv2阴性血清效价均小于1log2；猪、兔、小鼠pcv2阳性血清效价分别为10log2、8log2、9log2；参照样品效价为9log2。说明本方法的特异性、敏感性较优，由此建立的检测pcv2抗体效价间接血凝方法检测结果敏感、特异，可用于定量pcv2抗体效价，从而评估免疫pcv2疫苗的实验动物的体液免疫情况。
[0155]
表4检测结果记录表
[0156][0157]
实施例5本方法检测猪血清
[0158]
5.1材料
[0159]
3个批次的1％致敏红细胞，x1批、x2批、x3批
[0160]
稀释液：含有1％健康兔血清的ph7.2的磷酸盐缓冲液。
[0161]
样品1～样品20为免疫了pcv2疫苗的猪的血清，简称猪阳性血清。
[0162]
样品21～样品23为未免疫pcv2疫苗的猪的血清，简称猪阴性血清。
[0163]
参照样品：pcv2疫苗免疫猪的血清，100倍稀释后分装，-20℃保存，其标定的效价为9log2。
[0164]
5.2方法
[0165]
样品1～样品23，用稀释液100倍稀释后做后续检测。
[0166]
(1)96孔v型底血凝板，各孔加入稀释液25μl；
[0167]
(2)第1列每孔分别加入样品1～样品20、参照样品、样品21～样品23，各25μl，从第1孔开始进行2倍倍比稀释至第11孔，混匀后弃去25μl；
[0168]
(3)每孔加入致敏红细胞25μl。振荡血凝板使内容物混匀，室温静置1.5～2.5小时，第12孔孔底红细胞出现钮扣状沉积时判定结果；
[0169]
(4)判定各孔凝集结果及各样品效价、参照样品效价；
[0170]
(5)修正后的被检样品效价＝(被检样品效价
÷
参照样品效价)
×
标定的参照样品效价。
[0171]
5.3结果
[0172]
x1批红细胞检测的凝集情况见图2～图4，检测结果见表5。猪阴性血清效价均不高于1log2；猪阳性血清效价1log2～13log2(样品5稀释至17log2重复检测，效价为13log2)。
[0173]
由表5和图2～4得到：x2批红细胞测得的效价与x1和x3结果不一致的较多；x2批红细胞修正后的效价与x1和x3结果多数一致。说明通过参照样品的检测值计算修正后的样品效价的方法可以使最终检测结果值更准确，即用不同批次致敏红细胞检测获得的样品的间接血凝效价稳定、有可比性。
[0174]
表5检测结果记录表(log2)
[0175]
[0176][0177]
以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之类，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。

技术特征：
1.一种pcv2抗体效价的检测方法，其特征在于，所述pcv2抗体效价的检测方法包括以下步骤：s10、用稀释液分别梯度稀释被检样品和参照样品，得多个稀释的被检样品和多个稀释的参照样品；s20、向多个稀释的被检样品和多个稀释的参照样品中分别加入致敏红细胞悬液，混合、静置，得多个稀释的被检样品凝集混合液和多个稀释的参照样品凝集混合液，根据多个稀释的被检样品凝集混合液的致敏红细胞凝集情况确定被检样品效价，根据多个稀释的参照样品凝集混合液的致敏红细胞凝集情况确定参照样品效价；多次重复测定参照样品获得参照样品的多个效价测定值，根据参照样品多个效价测定值获得标定的参照样品效价；s30、根据公式计算被检样品的pcv2抗体效价，被检样品的pcv2抗体效价＝(被检样品效价
÷
参照样品效价)
×
标定的参照样品效价。2.如权利要求1所述的pcv2抗体效价的检测方法，其特征在于，步骤s10之前还包括配制致敏红细胞悬液，所述致敏红细胞悬液配制步骤如下：s101、将绵羊红细胞经洗涤、醛化、鞣化后用缓冲液重悬，得重悬液；s102、所述重悬液中添加pcv2 cap抗原致敏，随后添加防腐剂，得致敏红细胞悬液。3.如权利要求2所述的pcv2抗体效价的检测方法，其特征在于，在步骤s101中，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液：其中，所述磷酸盐缓冲液的ph值为6.4～7.2；和/或，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.01～0.1mol/l。4.如权利要求2所述的pcv2抗体效价的检测方法，其特征在于，在步骤s102中，所述pcv2 cap抗原的制备方法包括：将含有pcv2 cap蛋白基因的重组杆状病毒接种昆虫细胞，培养后得到含有pcv2 cap的培养液；将所述培养液离心并层析纯化，得到pcv2 cap抗原。5.如权利要求1所述的pcv2抗体效价的检测方法，其特征在于，在步骤s10中，所述稀释液为含兔血清的磷酸盐缓冲液：其中，所述磷酸盐缓冲液的ph值为7～7.4；和/或，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.01～0.1mol/l。6.如权利要求1所述的pcv2抗体效价的检测方法，其特征在于，在步骤s10中，所述被检样品包括：含pcv2抗体的猪血清、含pcv2抗体的兔血清和含pcv2抗体的鼠血清中的任一种。7.如权利要求1所述的pcv2抗体效价的检测方法，其特征在于，在步骤s10中，所述参照样品包括：含pcv2抗体的猪血清、兔血清或鼠血清。8.如权利要求1所述的pcv2抗体效价的检测方法，其特征在于，步骤s20所述致敏红细胞凝集情况包括100％致敏红细胞凝集、75％致敏红细胞凝集、50％致敏红细胞凝集、25％致敏红细胞凝集、0％致敏红细胞凝集中的任一种。9.如权利要求1所述的pcv2抗体效价的检测方法，其特征在于，所述被检样品效价为多个稀释的被检样品中使致敏红细胞50％凝集的最高稀释倍数；和/或，所述参照样品效价为多个稀释的参照样品中使致敏红细胞50％凝集的最高稀释倍数。
10.如权利要求1所述的pcv2抗体效价的检测方法，其特征在于，步骤s20中，所述标定的参照样品效价通过以下方式获得：用不少于5批的致敏红细胞检测参照样品获得参照样品的多个效价测定值；计算参照样品的多个效价测定值的几何平均值，为标定的参照样品效价。

技术总结
本发明公开了一种PCV2抗体效价的检测方法，包括以下步骤：用稀释液分别梯度稀释被检样品和参照样品，得多个稀释的被检样品和多个稀释的参照样品；再加入致敏红细胞悬液混合得多个稀释的被检样品和参照样品的凝集混合液，根据凝集混合液的致敏红细胞凝集情况确定被检样品和参照样品的效价，多次重复测定参照样品获得标定的参照样品效价；根据公式计算，被检样品的PCV2抗体效价＝(被检样品效价


技术研发人员：李晶梅 韩兴 朱薇 张飞雁 刘项羽 郑良益 李文静 郑佳 王焕君 谢红玲 李婷婷
受保护的技术使用者：国药集团动物保健股份有限公司
技术研发日：2023.03.30
技术公布日：2023/7/21