一种草地贪夜蛾鱼尼丁受体I4734位点突变检测方法与应用

一种草地贪夜蛾鱼尼丁受体i4734位点突变检测方法与应用
技术领域
1.本发明属于农业生物检测方法领域，具体是涉及一种草地贪夜蛾鱼尼丁受体i4734l、i4734v、i4734m突变分子快速检测方法。


背景技术：

2.草地贪夜蛾是2018年联合国粮农组织向全球发布预警的重要农业害虫，具有迁飞速度快、繁殖能力强、暴食为害重、防治难度大等特点。该虫于2019年1月在我国云南发现入侵，迅速扩散到我国26个省，并在我国云南、广东和海南等华南地区定殖，周年繁殖为害。草地贪夜蛾寄主范围广，可为害水稻、玉米、小麦、高粱、甘蔗、马铃薯、花生等350余种作物，迁入我国后主要为害玉米，对我国的玉米生产和粮食安全造成了严重威胁。2020年9月15日，农业农村部《一类农作物病虫害名录》公布，草地贪夜蛾因造成巨大农业损失入选虫害名录。
3.目前化学防治依然是控制草地贪夜蛾为害的最快速和有效手段，长期过度的依赖化学防治，使得田间草地贪夜蛾种群对多种杀虫剂的敏感性下降，产生了抗药性问题，增加了防治的困难。双酰胺类杀虫剂是作用于鱼尼丁受体(ryanodine receptor,ryr)的新型杀虫剂，目前草地贪夜蛾对双酰胺类杀虫剂仍处于低水平抗性，但抗药性有所增加。在国外有报道表明田间种群与敏感种群相比，其对氯虫苯甲酰胺和氟苯虫酰胺的抗性分别为225倍和5400倍。其它鳞翅目害虫如小菜蛾，早已通过测序检测到i4734位点具有的多种突变形态与双酰胺类杀虫剂抗药性增加有关，国内也有报道说明在田间种群中发现了草地贪夜蛾ryr受体存在上i4734m、i4734l、i4734v杂合突变。因此有必要进一步加强草地贪夜蛾田间种群ryr受体上i4734位点的突变频率监测。
4.环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,lamp)，是一种新型的核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4条特异引物，在链置换dna聚合酶的作用下，进行60～70℃恒温扩增，15～60分钟左右即可实现十亿倍以上的核酸扩增，具有操作简单、特异性强、产物易检测等特点。在dna合成时，从脱氧核糖核酸三磷酸底物(dntps)中析出的焦磷酸离子与反应溶液中的镁离子反应，产生大量焦磷酸镁沉淀，呈现白色。lamp变色预混液包含可视化的ph指示剂，在lamp扩增反应中产生大量质子，引发ph值的下降，从而使反应液颜色从粉红色变为黄色。因此，可以把颜色变化作为反应的指标，只用肉眼观察就能鉴定扩增与否，而不需要繁琐的电泳和紫外观察。由于环介导等温扩增反应不需要专用的变温设备pcr仪和昂贵的试剂，在田间检测基因类型中有广泛的应用前景。


技术实现要素：

5.本发明目的在于提供一种草地贪夜蛾ryr受体上i4734位点多种突变形态包括i4734l、i4734v、i4734m的突变快速检测技术，通过设计包含突变位点的特异性引物、lamp反应体系的配置、反应温度和时间、结果判定标准等四个主要技术环节，建立能够便捷准确
的检测草地贪夜蛾ryr受体上i4734位点多种突变形态的分子生物学方法。
6.为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
7.本发明的一个方面，本发明提供了一种基于环介导等温扩增技术(lamp)对草地贪夜蛾尼丁受体4734位点突变检测的引物组合，所述突变包括i4734l、i4734v、i4734m中的一种或多种，所述引物组合包括内引物fip/bip和外引物f3/b3，其中i4734l、i4734v、i4734m的内引物fip序列相同，bip序列不同，分别为:
8.fip-i4734l、v、m：tctagtgcatcgtcgtcctctctatctctttctaaataccctcta(seq id no.1)，
9.bip-i4734l：gacgaagacttcttctacatggaggagcgagcgacacgatggagtg(seq id no.2)，
10.bip-i4734v：gacgaagacttcttctacatggagcagcgagcgacacgatggagtg(seq id no.3)，
11.bip-i4734m：gacgaagacttcttctacatggagcatagcgagcgacacgatggagt g(seq id no.4)，
12.进一步的，i4734l、i4734v、i4734m的外引物f3/b3也相同，序列分别为:
13.f3：aggatatttctttctcaataccg(seq id no.5)，
14.b3：gatggtagtacccgatgag(seq id no.6)。
15.本发明的一个方面，本发明提供了一种基于环介导等温扩增技术(lamp)对草地贪夜蛾鱼尼丁受体4734位点突变的检测方法，所述突变包括i4734l、i4734v、i4734m中的一种或多种，所述方法包括如下步骤：
16.(1)提取草地贪夜蛾幼虫或成虫基因组dna，制备gdna模板；
17.(2)在反应容器中建立lamp反应体系，所述体系包括lamp反应液、特异性引物组，gdna模板，并补充无菌水；
18.(3)将lamp反应体系放入恒温容器中进行恒温孵育反应；
19.(4)结果判定：反应结束后，反应液不变色的样品为非突变体，反应液变色的样品为突变体；
20.所述特异性引物组包括扩增i4734l、i4734v、i4734m的内引物fip/bip和外引物f3/b3，其中i4734l、i4734v、i4734m的内引物fip序列相同，bip序列不同，分别为:
21.fip-i4734l、v、m：tctagtgcatcgtcgtcctctctatctctttctaaataccctcta(seq id no.1)，
22.bip-i4734l：gacgaagacttcttctacatggaggagcgagcgacacgatggagtg(seq id no.2)，
23.bip-i4734v：gacgaagacttcttctacatggagcagcgagcgacacgatggagtg(seq id no.3)，
24.bip-i4734m：gacgaagacttcttctacatggagcatagcgagcgacacgatggagt g(seq id no.4)，
25.进一步的，i4734l、i4734v、i4734m的外引物f3/b3也相同，序列分别为:
26.f3：aggatatttctttctcaataccg(seq id no.5)，
27.b3：gatggtagtacccgatgag(seq id no.6)。
28.本发明的一个实施例中，所述lamp反应液包括2
×
warmstart lamp预混液试剂盒。
29.本发明的一个实施例中，所述lamp反应体系包括2
×
warmstart lamp预混液试剂12.5μl、gdna模板1.0μl、内引物fip/bip和外引物f3/b3混合液7.5μl、用无菌水补足25μl反应体系。
30.本发明的一个实施例中，所述内引物fip/bip的浓度为2.0-2.5μmol
·
l-1；所述外引物f3/b3的浓度为0.6-0.7μmol
·
l-1。
31.本发明的一个实施例中，本发明所述的恒温孵育，不需要使用专用的pcr仪器，在水浴锅、金属浴或者保温瓶中保持恒温在60～70℃即可，恒温孵育时间为30～90min。优选的本发明的恒温孵育反应温度为65～70℃，反应时间为60～75min。
32.本发明的一个实施例中，结果判定时i4734位点无论突变成l、v、m或者包含其中的2-3种突变形态，所含的反应溶液的颜色变化为黄色，不含i4734突变的反应溶液的颜色仍为粉色。
33.本发明中通过添加上述引物组，可以实现对ile(ata)4734let(cta)、ile(ata)4734val(gta)、ile(ata)4734met(atg)纯合和杂合突变体的特异性扩增，而对ile(ata)4734非突变体无法扩增。
34.本发明的一个方面，本发明还提供了一种基于环介导等温扩增技术(lamp)对草地贪夜蛾尼丁受体4734位点突变检测的试剂盒，所述试剂盒包括本发明特别设计的引物组seq id no.1～6。
35.本发明的一个方面，本发明还提供了一种基于环介导等温扩增技术(lamp)对草地贪夜蛾尼丁受体4734位点突变检测的试剂盒，所述试剂盒包括提取草地贪夜蛾幼虫或成虫基因组dna提取试剂、lamp反应液、以及本发明特别设计的引物组seq id no.1～6。
36.本发明的一个方面，本发明还提供了试剂盒在防治草地贪夜蛾中的应用，利用本发明的试剂盒对草地贪夜蛾中的i4734位点进行突变检测，所述突变包括i4734l、i4734v、i4734m。
37.有益效果
38.本发明采用基于lamp核酸扩增方法，扩增模板在低至10个拷贝或者更少情况下，仍然能出极低量的模板中扩增出目的片段，扩增产物是模板原始量的十亿倍以上，比传统pcr检测技术高出100到1000倍，灵敏度高。
39.本发明筛选的检测草地贪夜蛾鱼尼丁受体i4734l、v、m突变的内引物4条，包含突变的内引物3条，外引物1对。只有当这内外4条引物与鱼尼丁受体上6个区段完全匹配的情况下才能够进行lamp扩增，有一个碱基无法匹配也就不能进行lamp扩增，检测的准确性高。
40.本发明优化的恒温孵育温度和时间为68℃和80min，而普通pcr反应需要专门的变温设备，耗时90min，再加上电泳检测和测序确认则需要2～3天才能完成。因而本发明具有耗时短和操作简单的优点。
41.本发明设计的草地贪夜蛾鱼尼丁受体i4734l、i4734v、i4734m突变的内引物和外引物，只要ile(ata)4734发生let(cta)、vai(gta)、met(atg)突变，无论是纯合突变还是杂合突变或者有2-3种突变形态均能进行lamp扩增，从而使反应液由粉色变为黄色，而ile(ata)4734非突变体无法扩增，反应液仍为粉色。本发明方法实现了草地贪夜蛾对作用于鱼尼丁受体(ryanodine receptor,ryr)的双酰胺类杀虫剂抗性靶标多种突变的高灵敏快速
分子检测。
42.本发明不依赖任何专门的仪器设备实现现场高通量快速检测，检测结果易于鉴定，适合基层植保人员进行检测使用。
附图说明
43.图1：草地贪夜蛾鱼尼丁受体i4734l突变的lamp引物设计位置。
44.图2：草地贪夜蛾鱼尼丁受体i4734v突变的lamp引物设计位置。
45.图3：草地贪夜蛾鱼尼丁受体i4734m突变的lamp引物设计位置。
46.图4：草地贪夜蛾鱼尼丁受体i4734l突变的lamp检测结果，其中，a为颜色变化图；b为电泳检测图；c为基因测序峰图。
47.图5：草地贪夜蛾鱼尼丁受体i4734v突变的lamp检测结果，其中，a为颜色变化图；b为电泳检测图；c为基因测序峰图。
48.图6：草地贪夜蛾鱼尼丁受体i4734m突变的lamp检测结果，其中，a为颜色变化图；b为电泳检测图；c为基因测序峰图。
49.图7：草地贪夜蛾鱼尼丁受体多种突变形态的lamp检测图，a为颜色变化图；b为电泳检测图。
具体实施方式
50.实施例1：
51.实施例1：lamp反应的特异性和准确性验证试验
52.1.实验材料
53.昆虫dna提取试剂盒tianamp genomic dna kit购于天根公司，质粒提取试剂盒fa stpure plasmid mini kit、dna聚合酶、rna酶和核酸清除剂均购于南京喏唯赞公司，war mstart colorimetric lamp(m1800s)购于neb公司，fast mutagenesis system快速突变试剂盒购于全式金公司，rnase-free双蒸无菌水购于生工公司。
54.2.实验步骤
55.2.1草地贪夜蛾基因组dna提取
56.(1)收集安徽省不同地区的田间草地贪夜蛾幼虫或成虫，分别收集在不同的灭菌离心管中。
57.(2)倒入液氮，将洗净后的草地贪夜蛾幼虫或成虫研磨至粉末。
58.(3)将粉末离心至管底，加入200μl缓冲液ga，震荡至彻底悬浮。
59.(4)加入20μl proteinase k混匀后，在56℃放置3h。每小时颠倒混合样品2-3次。
60.(5)加入200μl缓冲液gb，充分颠倒混匀，70℃放置10min，溶液变清亮。
61.(6)加入200μl无水乙醇，充分震荡15s，此时可能出现絮状沉淀。
62.(7)将上一步溶液都加入一个吸附柱cb3中(吸附柱放入收集管中)12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱cb3放回收集管中。
63.(8)向吸附柱cb3中加入500μl缓冲液gd，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱cb3放回收集管中。
64.(9)向吸附柱cb3中加入600μl漂洗液pw，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱
cb3放回收集管中。
65.(10)将吸附柱cb3放回收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液，将吸附柱cb3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
66.(11)将吸附柱cb3转入一个干净的离心管中，向吸附膜中央部位悬空滴加50μl洗脱缓冲液te，室温静置5min，12000rpm离心2min，将草地贪夜蛾基因组dna溶液收集到离心管中，备用。
67.2.2草地贪夜蛾鱼尼丁受体基因的克隆与鉴定
68.在国家基因库下载草地贪夜蛾的基因组数据，通过同源搜索获取草地贪夜蛾鱼尼丁受体的基因组序列，根据该序列设计用于克隆包含编码i4734位点的上下游引物。上游引物序列为：tattcgacgaggggcatgtc；下游引物序列为：ctccgtgcatctaccact。引物由滁州通用生物公司合成，纯化方式为rpc。扩增草地贪夜蛾鱼尼丁受体基因组序列的pcr反应体如下：2
×
phanta flash master mix 12.5μl，草地贪夜蛾基因组模板1.0μl，上下游引物(10μm)各1.0μl，无菌水9.5μl；反应程序为95℃预变性3min，以下3个过程循环35次：95℃变性15s、60℃退火15s、72℃延伸2min，72℃彻底延伸5min。将pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外凝胶成像系统中检测目的条带大小是否符合实验预期，将目的条带切胶，送往滁州通用生物公司进行测序鉴定。
69.2.3草地贪夜蛾鱼尼丁受体基因的定点突变
70.(1)根据定点突变原理设计鱼尼丁受体i4734位点突变引物。
71.引物(component)序列(sequence)i4734l-fatcgtgtcgctcgctctactcatcggi4734l-rcagcgagcgacacgatggagtgcagti4734v-fatcgtgtcgctcgctgtactcatcggi4734v-rgagcgagcgacacgatggagtgcagti4734m-fcgtgtcgctcgctatgctcatcgggti4734m-rgatagcgagcgacacgatggagtgca
72.(2)配置pcr体系
73.组分(component)体积(volume)plasmid1-10ngforwardprimer(10μm)1.0μlreverseprimer(10μm)1.0μl2xtranstratfastpfuflypcrsupermix25μlnuclease-freewaterupto50μl
74.(3)按照程序进行pcr扩增
75.94℃2-5min循环25个：94℃20s55℃20s72℃1min72℃10min
76.(4)取10μl pcr产物，1％琼脂糖凝胶电泳检测。
77.(5)加入1μl dmt酶于pcr产物中，混匀，37℃孵育1h。
78.(6)加入2-5μl dmt酶消化产物于50μl感受态细胞中(在感受态细胞刚刚解冻时加入连接产物)，轻弹混匀，冰浴20-30min。
79.(7)42℃水浴热激45s，立刻置于冰上2min。
80.(8)加入250μl平衡至室温的soc或者lb培养基，200rpm、37℃培养1h。
81.(9)将适宜抗性的平板在37℃培养箱中预热。
82.(10)取100-200μl菌液均匀地涂在平板上，37℃培养箱中过夜培养。
83.(11)挑取蓝色斑摇菌测序。
84.2.4草地贪夜蛾鱼尼丁受体基因质粒提取
85.(1)准备工作：检查buffer p1中中是否已经加入rnasea，检查bufferpw2中是否已经加入无水乙醇，检查buffer p2、p3和pw1是否出现沉淀。
86.(2)取10ml过夜培养的菌液加入离心管中，1000rpm(11500xg)离心1min后弃培养基收集菌体。
87.(3)向步骤2中加入250μl bufferp2，温和上下颠倒8-10次，使菌体充分裂解。
88.(4)向步骤3中加入350μl bufferp3，立即温和上下颠倒8-10次让溶液彻底中和buf fer p2,此时应出现白色絮状沉淀，12000rpm(13400xg)离心10min。
89.(5)将吸附柱置于收集管中，将步骤4上清用移液器小心转移至吸附柱，注意不要吸到沉淀，12000rpm(13400xg)离心1min。倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。
90.(6)加入500μl的buffer pw1至吸附柱中。12000rpm(13400xg)离心1min。倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。
91.(7)加入600μl的buffer pw2至吸附柱中。12000rpm(13400xg)离心1min。倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。
92.(8)重复步骤7。
93.(9)将吸附柱放回收集管中。12000rpm(13400xg)离心1min干燥吸附柱，目的是将吸附柱中残留的漂洗液彻底去除。
94.(10)将吸附柱置于一个新的灭菌的离心管中，加入30μl elution buffer至吸附柱膜中央。室温静置2min后12000rpm(13400xg)离心1min洗脱dna。
95.(11)弃去吸附柱，dna产物保存于-20℃冰箱，防止dna降解。
96.2.5lamp引物的设计与筛选
97.根据上述已经验证的草地贪夜蛾ryr的基因组序列，按照lamp设计引物原理，使用在线设计网站http://primerexplorer.jp/e/index.html，利用primer explorer v5程序设计lamp引物，再根据ile(ata)4734发生let(cta)、vai(gta)、met(atg)突变位点进行引物特异性筛选，i4734l、i4734v和i4734m的lamp引物结合的6个位点分别如附图1、附图2和附图3所示，具体的引物序列如下表所示：
98.i4734l、v、m引物组:
[0099][0100]
2.6lamp反应体系的配置与孵育
[0101]
首先将所有lamp引物稀释到10μm，其中i4734l、v、m引物组按照fip-l引物8μl、fip-v引物8μl、fip-m引物8μl，bip引物24μl、f3引物3μl、b3引物3μl比例进行混合。使用neb公司的warmstart colorimetric lamp(m1800s)试剂盒，在200μl离心管中加入以下组分：warmstart colorimetric lamp 2
×
master mix 12.5μl，草地贪夜蛾基因组模板1.0-3.0μl，lamp引物混合物(10
×
)7.5μl，无菌水2.0-4.0μl，配置成25.0μl的lamp反应体系。
[0102]
将配置好的lamp反应体系用封口膜密封后放入水浴锅中65℃加热60-80min观察颜色变化。颜色变化后取3μl样品，用2％的琼脂糖凝胶电泳检测验证。
[0103]
3.实验结果
[0104]
通过筛选和实验验证草地贪夜蛾鱼尼丁受体i4734l突变的lamp引物组与模板的6个结合位置如附图1所示。
[0105]
通过筛选和实验验证草地贪夜蛾鱼尼丁受体i4734v突变的lamp引物组与模板的6个结合位置如附图2所示。
[0106]
通过筛选和实验验证草地贪夜蛾鱼尼丁受体i4734m突变的lamp引物组与模板的6个结合位置如附图3所示。
[0107]
通过i4734l的lamp反应体系颜色变化(附图4中a)，电泳条带检测(附图4中b)和基因测序验证(附图4中c)确认4734位点ata
→
cta纯合突变(泳道1、4和7)可以进行lamp扩增，从而使反应液由粉色变为黄色，而4734位点cta非突变体(泳道2、5和8)和清水对照(泳道3、6和9)无法扩增，反应液仍为粉色。
[0108]
通过i4734v的lamp反应体系颜色变化(附图5中a)，电泳条带检测(附图5中b)和基因测序验证(附图5中c)确认4734位点ata
→
gta纯合突变(泳道1、4和7)可以进行lamp扩增，从而使反应液由粉色变为黄色，而4734位点cta非突变体(泳道2、5和8)和清水对照(泳道3、6和9)无法扩增，反应液仍为粉色。
[0109]
通过i4734m的lamp反应体系颜色变化(附图6中a)，电泳条带检测(附图6中b)和基
因测序验证(附图6中c)确认4734位点ata
→
atg纯合突变(泳道1、4和7)可以进行lamp扩增，从而使反应液由粉色变为黄色，而4734位点cta非突变体(泳道2、5和8)和清水对照(泳道3、6和9)无法扩增，反应液仍为粉色。
[0110]
实施例2：草地贪夜蛾鱼尼丁受体i4734l、v、m多种突变形态的快速检测方法的建立
[0111]
1.实验材料
[0112]
本部分使用的实验材料与实施例1相同。
[0113]
2.实验步骤
[0114]
2.1田间草地贪夜蛾基因组dna的提取与制备
[0115]
本部分田间草地贪夜蛾基因组dna的提取与制备步骤与实施例1中草地贪夜蛾基因组dna提取相同。
[0116]
2.2草地贪夜蛾鱼尼丁受体i4734位点的测序检测
[0117]
本部分田间草地贪夜蛾鱼尼丁受体i4734的测序检测步骤与实施例1中草地贪夜蛾鱼尼丁受体的克隆与鉴定相同。
[0118]
2.3草地贪夜蛾鱼尼丁受体i4734l、v、m位点定点突变的测序检测
[0119]
本部分草地贪夜蛾鱼尼丁受体i4734l、v、m的测序检测步骤与实施例1中草地贪夜蛾鱼尼丁受体的定点突变与鉴定相同。
[0120]
2.4草地贪夜蛾鱼尼丁受体i4734l、v、m突变质粒的提取
[0121]
本部分草地贪夜蛾鱼尼丁受体i4734l、v、m的突变质粒提取步骤与实施例1中草地贪夜蛾鱼尼丁受体i4734l、v、m的突变质粒提取步骤相同。
[0122]
2.5草地贪夜蛾鱼尼丁受体i4734l、v、m突变的lamp检测
[0123]
本部分田间草地贪夜蛾鱼尼丁受体多种突变形态的lamp检测步骤与实施例1中lamp反应体系的配置与孵育相同。
[0124]
3.实验结果
[0125]
通过lamp反应体系颜色变化(附图7中a)，电泳条带检测(附图7中b)确认4734位点ata
→
cta纯合突变(泳道3)、4734位点ata
→
gta纯合突变(泳道4)、4734位点ata
→
atg纯合突变(泳道5)和ata
→
cta纯合突变加ata
→
gta纯合突变混合模板(泳道6)、4734位点ata
→
cta纯合突变加ata
→
atg纯合突变混合模板(泳道7)、4734位点ata
→
gta纯合突变模板加ata
→
atg纯合突变混合模板(泳道8)以及4734位点ata
→
cta纯合突变加ata
→
gta纯合突变加ata
→
atg纯合突变模板(泳道9)均可以进行lamp扩增，从而使反应液由粉色变为黄色；而4734位点ata非突变体(泳道1)以及清水对照(泳道2)均不变色。dna测序结果与lamp检测结果一致，表明本发明所建立的草地贪夜蛾鱼尼丁受体i4734l、v、m多种形态突变快速检测方法可行且准确性高，准确率高达100％。
[0126]
以上内容是结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明，不能认定本发明具体实施只局限于这些说明，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的构思的前提下，还可以做出若干简单的推演或替换，都应当视为属于本发明所提交的权利要求书确定的保护范围。

技术特征：
1.一种基于环介导等温扩增技术（lamp）对草地贪夜蛾尼丁受体4734位点突变检测的引物组合，其特征在于，所述突变包括i4734l、i4734v、i4734m中的一种或多种，所述引物组合包括内引物fip/bip和外引物f3/b3，其中i4734l、i4734v、i4734m的内引物fip序列相同，bip序列不同，分别为:fip-i4734l、v、m：tctagtgcatcgtcgtcctctctatctctttctaaataccctcta（seq id no.1），bip-i4734l：gacgaagacttcttctacatggaggagcgagcgacacgatggagtg（seq id no.2），bip-i4734v：gacgaagacttcttctacatggagcagcgagcgacacgatggagtg （seq id no.3），bip-i4734m：gacgaagacttcttctacatggagcatagcgagcgacacgatggagtg（seq id no.4）；进一步的，i4734l、i4734v、i4734m的外引物f3/b3也相同，序列分别为:f3：aggatatttctttctcaataccg（seq id no.5），b3：gatggtagtacccgatgag（seq id no.6）。2.一种基于环介导等温扩增技术（lamp）对草地贪夜蛾鱼尼丁受体4734位点突变的检测方法，其特征在于，所述突变包括i4734l、i4734v、i4734m中的一种或多种，所述方法包括如下步骤：（1）提取草地贪夜蛾幼虫或成虫基因组dna，制备gdna模板；（2）在反应容器中建立lamp反应体系，所述体系包括lamp反应液、特异性引物组，gdna模板，并补充无菌水；（3）将lamp反应体系放入恒温容器中进行恒温孵育反应；（4）结果判定：反应结束后，反应液不变色的样品为非突变体，反应液变色的样品为突变体；所述特异性引物组包括扩增i4734l、i4734v、i4734m的内引物fip/bip和外引物f3/b3，其中i4734l、i4734v、i4734m的内引物fip序列相同，bip序列不同，分别为:fip-i4734l、v、m：tctagtgcatcgtcgtcctctctatctctttctaaataccctctabip-i4734l：gacgaagacttcttctacatggaggagcgagcgacacgatggagtgbip-i4734v：gacgaagacttcttctacatggagcagcgagcgacacgatggagtgbip-i4734m：gacgaagacttcttctacatggagcatagcgagcgacacgatggagtg；进一步的，i4734l、i4734v、i4734m的外引物f3/b3也相同，序列分别为:f3：aggatatttctttctcaataccgb3：gatggtagtacccgatgag。3.根据权利要求2所述的草地贪夜蛾鱼尼丁受体i4734位点突变的检测方法，其特征在于，所述步骤（2）中，所述lamp反应液包括2
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warmstart lamp预混液试剂盒。4. 根据权利要求2所述的草地贪夜蛾鱼尼丁受体i4734位点突变的检测方法，其特征在于，所述步骤（2）中，所述lamp反应体系包括2
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warmstart lamp预混液试剂 12.5 μl、gdna模板1.0 μl、内引物fip/bip和外引物f3/b3混合液7.5 μl、用无菌水补足25 μl反应体系。5. 根据权利要求2所述的草地贪夜蛾鱼尼丁受体i4734位点突变的检测方法，其特征在于，所述内引物fip/bip的浓度为2.0-2.5 μmol
· l-1
；所述外引物f3/b3的浓度为0.6-0.7 μmol
· l-1
。
6. 根据权利要求2所述的草地贪夜蛾鱼尼丁受体i4734位点突变的检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中，反应温度为65~70℃，反应时间为60~75 min。7.根据权利要求2所述的草地贪夜蛾鱼尼丁受体i4734位点突变的检测方法，其特征在于，所述步骤(4)中，i4734位点无论突变成l、v、m或者包含其中的2-3种突变形态，所含的反应溶液的颜色变化为黄色，不含i4734突变的反应溶液的颜色仍为粉色。8.一种基于环介导等温扩增技术（lamp）对草地贪夜蛾尼丁受体4734位点突变检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物组。9.一种基于环介导等温扩增技术（lamp）对草地贪夜蛾尼丁受体4734位点突变检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括提取草地贪夜蛾幼虫或成虫基因组dna提取试剂、lamp反应液、权利要求1所述的引物组。10.权利要求9-10任一所述的试剂盒在防治草地贪夜蛾中的应用，其特在在于，利用所述试剂盒对草地贪夜蛾中的i4734位点进行突变检测。

技术总结
本发明属于农业生物技术领域，尤其涉及一种草地贪夜蛾鱼尼丁受体的突变检测。本发明基于环介导等温扩增技术（LAMP）建立了草地贪夜蛾鱼尼丁受体在4734位点包括包括I4734L、I4734V、I4734M在内的多种突变形态的突变快速检测方法。本发明检测方法通过在草地贪夜蛾鱼尼丁受体I4734L位点设计2对特异性引物，I4734V和I4734M与I4734L共用三条引物包括FIP、F3、B3，不同突变形态的BIP引物不同，以此进行LAMP扩增，根据反应产物颜色判定是否为草地贪夜蛾鱼尼丁受体I4734位点突变个体。本发明方法稳定性高、耗时短、操作简便、灵敏度高，适合田间快速检测草地贪夜蛾对双酰胺类杀虫剂抗药性的分子检测，为草地贪夜蛾综合防治提供依据。供依据。供依据。


技术研发人员：盛成旺 卢静波 吴惠子 张默晗 蒋兴川 廖敏 操海群
受保护的技术使用者：安徽农业大学
技术研发日：2023.03.31
技术公布日：2023/7/21