胰腺癌循环肿瘤细胞的表面标志物及其应用的制作方法

1.本发明涉及肿瘤诊断和治疗领域，具体涉及一种胰腺癌循环肿瘤细胞的表面标志物及其应用。


背景技术：

2.循环肿瘤细胞(circulating tumor cell，简称ctc)是存在于外周血中的各类肿瘤细胞的统称。因自发或诊疗操作从实体肿瘤病灶(原发灶、转移灶)脱落，大部分ctc在进入外周血后发生凋亡或被吞噬，少数能够逃逸并锚着发展成为转移灶，增加恶性肿瘤患者死亡风险。ctc检测通过捕捉检测外周血中痕量存在的ctc，监测ctc类型和数量变化的趋势，以便实时监测肿瘤动态、评估治疗效果，实现实时个体治疗。
3.ctc检测适用于通过血行转移的实体肿瘤，包括鼻咽癌、食管癌、肺癌、乳腺癌、肝癌、胆管癌、胃癌、胰腺癌、结直肠癌、肾癌、膀胱癌、卵巢癌、前列腺癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、骨肉癌等肿瘤。ctc检测已于2019年被写入乳腺癌检测指南。
4.现有的检测ctc手段包括物理法、免疫法等。物理法主要是通过微流体力学原理，在微流控芯片上，利用细胞的大小，分离循环肿瘤细胞(一般来说肿瘤细胞比血细胞大一些)。然而，由于循环肿瘤细胞的大小并不均一，而且细胞本身具有一定的柔性，加之肿瘤细胞数量比例低，因此，用物理方法分离缺乏特异性。
5.随着ctc检测的深入研究，免疫筛选已经越来越被重视，效率也是其他方法不可比拟的。免疫法筛选ctc技术包括正筛选和负筛选两种。负筛选法，即用针对表面特异性抗原的抗体将白细胞捕获、去除，理论上剩下没有被捕获的细胞就是ctc。这种方法的优点是：抗体成熟，容易获得，捕获白细胞的效率高。缺点是：针对白细胞的抗体可以非特异性的结合一些状态较差的ctc，因此，降低了ctc的检出效率。
6.正筛选法即免疫富集法，是通过上皮来源的肿瘤细胞表面特异性标志物分子的抗体，用免疫捕获等方式抓捕ctc，从而达到检测的目的。这种方法的优点是：对于ctc的状态并不敏感，因此，只要ctc表达捕获标志物，就能被检测出来。缺点是：不同类型的肿瘤，ctc表面的标志物存在一定的差异，所以用相对单一的标志物富集筛选ctc必然存在一定程度的漏检。例如目前，免疫富集法使用的ctc表面的标志物主要是黏附分子epcam和细胞角蛋白等。这种固定的抗体组合显然不能适用于所有类型的肿瘤。因此，找到特定肿瘤ctc表面特定的标志物，并将这些标志物联合使用，将会大大提高肿瘤病人血液中ctc的富集筛选和检出效率。


技术实现要素：

7.针对现有的ctc富集手段或富集标志物种类的不足，本发明通过对胰腺癌患者的ctc和wbc进行单细胞测序，并用生物信息技术手段对测序结果进行大数据分析，归纳总结出一系列ctc表面独有的新的标志物。进一步，与大量胰腺癌患者蛋白表达谱和ctc表达谱群体测序的结果进行比对，找出共有的ctc表面特有标志物。在此基础上，用上述新的标志
物对胰腺癌细胞系和胰腺癌患者血液进行富集(捕获)测试，遴选出具有富集能力的表面标志物，优化出新的捕获抗体的最佳组合，进行免疫富集筛选。通过上述方法筛选出来的新的表面标志物的抗体或抗体组合大大提高了ctc的捕获富集效率，可以为监测肿瘤动态、评估治疗效果、实现实时个体治疗提供了更加准确的支持，具有巨大的市场价值和应用前景。
8.在一方面，本发明提供一种用于检测或捕获样本中的胰腺癌循环肿瘤细胞ctc的产品，其中，所述产品用于检测所述样本中的细胞表面标志物基因表达产物的水平，所述细胞表面标志物选自mfsd2b、itga2、pde3a、ptprn、oxtr、adra2a、bambi和slc24a中的一种或多种。
9.在一方面，本发明提供一种检测样本中的细胞表面标志物基因表达产物水平的产品在制备检测或捕获样本中的胰腺癌循环肿瘤细胞ctc的试剂、试剂盒或阵列中的用途，所述细胞表面标志物选自mfsd2b、itga2、pde3a、ptprn、oxtr、adra2a、bambi和slc24a中的一种或多种，其中：
10.所述产品用于检测所述样本中的细胞表面标志物基因表达产物的水平，如果检测到的所述细胞表面标志物基因表达产物的水平高于参比水平，则确定存在胰腺癌循环肿瘤细胞ctc；或
11.所述产品用于捕获样本中的胰腺癌循环肿瘤细胞ctc。
12.在一方面，本发明提供一种用于诊断受试者中的胰腺癌或确定受试者中发生胰腺癌的风险的细胞表面标志物表达产物，其中，所述细胞表面标志物选自mfsd2b、itga2、pde3a、ptprn、oxtr、adra2a、bambi和slc24a中的一种或多种。
13.在一方面，本发明提供一种检测样本中细胞表面标志物基因表达产物水平的产品在制备诊断受试者中的胰腺癌或确定受试者中发生胰腺癌的风险的试剂、试剂盒或阵列中的用途，其中，所述细胞表面标志物选自mfsd2b、itga2、pde3a、ptprn、oxtr、adra2a、bambi和slc24a中的一种或多种。
14.在一方面，本发明提供一种从样品中捕获胰腺癌循环肿瘤细胞ctc的方法，所述方法包括：使所述样品与靶向胰腺癌循环肿瘤细胞ctc上的细胞表面标志物的产品接触以捕获循环肿瘤细胞，其中，所述细胞表面标志物选自mfsd2b、itga2、pde3a、ptprn、oxtr、adra2a、bambi和slc24a中的一种或多种，所述产品被固定化在固体支持物的表面上。
15.在一方面，本发明提供一种从样品中捕获胰腺癌循环肿瘤细胞ctc的装置，所述装置包括具有细胞捕获表面的通道，其中靶向胰腺癌循环肿瘤细胞ctc上的细胞表面标志物的产品固定至所述细胞捕获表面。
16.在一方面，本发明提供一种用于检测或捕获样本中的胰腺癌循环肿瘤细胞ctc的试剂盒或阵列，其中，所述试剂盒或阵列包含所述的产品。
17.在一方面，本发明提供一种辅助诊断受试者中的胰腺癌或确定受试者中发生胰腺癌的风险的试剂盒或阵列，其中，所述试剂盒或阵列包含所述的产品。
附图说明
18.图1示出了胰腺癌循环肿瘤细胞表面标志物基因的筛选。其中，图1a示出了胰腺癌循环肿瘤细胞表面标志物的基因表达丰度分布；图1b示出了胰腺癌循环肿瘤细胞表面标志物蛋白水平表达特异性。
19.图2示出了初步筛选的循环肿瘤细胞表面标志物：mfsd2b、itga2、pde3a、ptprn、oxtr、adra2a、bambi和slc24a3，这些蛋白在细胞膜结构上的区段分布。其中，图2a示出了mfsd2b、pde3a、oxtr和bambi在细胞膜结构上的区段分布，图2b示出了itga2、ptprn、adra2a和slc24a3在细胞膜结构上的区段分布。
20.图3示出了样本捕获收集、计数装置及流程示意图。胰腺癌患者的外周静脉全血流经固定了epcam、ca199和新的标志物抗体的微流控芯片，肿瘤细胞被芯片富集，并将富集的细胞进行荧光染色计数的流程。其中，图3a为捕获收集装置，图3b为荧光扫描计数系统，图3c为样本富集分离及计数流程示意图。
21.图4示出了富集筛选胰腺癌细胞su.86.86的效率。其中，su.86.86细胞流经分别固定了itga2、ptprn、oxtr、bambi、mfsd2b、adra2a、pde3a和slc24a3抗体的微流控芯片，各芯片对su.86.86细胞的捕获富集效率。捕获富集效率由高到低依次为itga2、ptprn、oxtr、bambi、mfsd2b、adra2a、pde3a和slc24a3。
22.图5示出了su.86.86细胞流经分别固定了epcam抗体联合mfsd2b、itga2、pde3a、ptprn、oxtr、adra2a、bambi或slc24a3抗体的微流控芯片，各组芯片对su.86.86细胞的捕获富集效率。其中，epcam抗体联合itga2、ptprn、oxtr或bambi抗体的捕获效率较高，明显高于单独使用epcam抗体的捕获效率。
23.图6示出了su.86.86细胞流经分别固定了ca199抗体联合mfsd2b、itga2、pde3a、ptprn、oxtr、adra2a、bambi或slc24a3抗体的微流控芯片，各组芯片对su.86.86细胞的捕获富集效率。其中，ca199抗体联合itga2、ptprn、oxtr或bambi抗体的捕获效率较高，明显高于单独使用ca199抗体的捕获效率。
24.图7示出了su.86.86细胞流经分别固定了ca199和epcam抗体组合联合mfsd2b、itga2、pde3a、ptprn、oxtr、adra2a、bambi或slc24a3抗体的微流控芯片，各组芯片对su.86.86细胞的捕获富集效率。其中，ca199和epcam抗体组合联合itga2、ptprn、oxtr或bambi抗体的捕获效率较高，明显高于ca199和epcam抗体组合的捕获效率。
25.图8示出了su.86.86细胞流经分别固定了ca199和epcam抗体组合联合itga2和ptprn抗体组合、itga2和oxtr抗体组合、itga2和bambi抗体组合、ptprn和oxtr抗体组合、ptprn和bambi抗体组合、或oxtr和bambi抗体组合的捕获效率较高，明显高于ca199和epcam抗体组合的捕获效率。
26.图9示出了用ca199、epcam、itga2和ptprn组合抗体以及ca199、epcam、oxtr和ptprn组合抗体包被芯片，培养四种胰腺癌细胞capan-1、cfpac-1、hs 766t、su.86.86，每种细胞计数1000个，分别将这1000个四种胰腺癌细胞以一定的流速流经芯片，并用收集液收集芯片捕获的细胞，计数并计算组合抗体对四种胰腺癌细胞的捕获能力。ca199和epcam抗体组合联合itga2和ptprn抗体组合、或ptprn和oxtr抗体组合，对四种胰腺癌细胞的捕获富集效率高，均高于ca199和epcam抗体组合的捕获效率。
27.图10示出了ca199和epcam抗体组合联合itga2和ptprn抗体组合，对混合在血液中的四种胰腺癌细胞的捕获富集效率，明显高于ca199和epcam抗体组合的捕获效率。
28.图11示出了ca199和epcam抗体组合联合itga2和ptprn抗体组合，对10例胰腺癌患者的血液样本进行ctc捕获富集，ca199和epcam抗体组合联合itga2和ptprn抗体组合捕获富集ctc的个数总体高于ca199和epcam抗体组合的捕获富集ctc个数。
具体实施方式
29.在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
30.本文中，术语“个体”，“患者”，或“受试者”可互换使用且指想要治疗的任何单一动物，更优选哺乳动物(包括非人动物，诸如例如猫，犬，马，家兔，动物园动物，牛，猪，绵羊，和非人灵长类)。在特定实施方案中，本文中的患者是人。患者可以是“癌症患者”，即罹患癌症，或有风险罹患癌症，或罹患癌症的一种或多种症状的患者。
31.本文中，术语“肿瘤”指所有赘生性细胞生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，及所有癌前和癌性细胞和组织。
32.本文中，术语“癌症”和“癌性”指或描述哺乳动物中典型地以不受调节的细胞生长为特征的生理疾患。
33.本文中，术语“癌症”、“癌性”、“细胞增殖性病症”、“增殖性病症”和“肿瘤”在本文中提到时并不互相排斥。
34.本文中，术语“病症”是会受益于治疗的任何状况，包括但不限于慢性和急性病症或疾病，包括那些使哺乳动物易患上所讨论病症的病理状况。
35.本文中，术语“肿瘤细胞”指肿瘤或其样品中存在的任何肿瘤细胞。可使用本领域已知的和/或本文中描述的方法来区分肿瘤细胞与肿瘤样品中可能存在的其它细胞，例如基质细胞和肿瘤浸润性免疫细胞。
36.本文中，术语“循环肿瘤细胞”或“ctc”是指从肿瘤脱落并在血液中(即在循环中)存在的肿瘤细胞。可用于从血液的其它成分中识别和/或分离ctcs的细胞标记(例如标记基因)在下文中加以描述。在一些实施方式中，ctc可为胰腺癌ctc。
37.本文中，术语“细胞表面”的使用是根据其在本领域的正常含义，因此包括可通过与蛋白和其它分子结合而接近的细胞外部。
38.本文中，术语“肿瘤细胞表面标记物”指这样一些生物分子，例如蛋白质、碳水化合物、糖蛋白等。所述生物分子专门或者优选或者差异性地在肿瘤细胞上表达，和/或被发现与肿瘤细胞相关，因此可以作为肿瘤的优选或特异性靶标。在具体的实施方式中，优势表达可以是与生物体中其他细胞相比的优势表达，或者是生物体中特定区域内的优势表达(例如，在特定器官或组织中)。
39.本文中，术语“样本”或“测试样本”是指从生物有机体获取或分离的样本，例如来自受试者的肿瘤样本。示例性的生物样本包括但不限于：生物流体样本、血清、血浆、尿液、唾液、肿瘤样本、肿瘤活检物和/或组织样本等。该术语还包括上述样本的混合物。术语“测试样本”还包括未处理或经预处理的(或经预加工的)生物学样本。在一些实施方式中，测试样本可以包括来自受试者的细胞。在一些实施方式中，测试样本可以是肿瘤细胞测试样本，例如样本可以包括癌细胞、来自肿瘤的细胞和/或肿瘤活检物。在一些实施方式中，测试样本可以是血液样本。测试样本可通过从受试者中移除细胞样本而获得，但也可以通过使用先前分离的细胞(例如，在之前的时间点分离以及由同一人或另一人分离)来完成。此外，测试样本可以是新鲜采集或以前采集的样本。
40.本文中，术语“抗原”涉及包含表位的物质，针对所述表位指导和/或产生免疫应答。优选地，本发明的上下文中的抗原是一种分子，任选地在加工之后，诱导免疫反应的，优选是抗原特异性的。术语“抗原”特别包括蛋白、肽、多糖、核酸，尤其是rna和dna，以及核苷酸。
41.本文中，术语“抗体”是指一种糖蛋白，其包含通过二硫键相互连接的至少两条重(h)链和两条轻(l)链，并且包括包含其抗原结合部分的任何分子。术语“抗体”包括单克隆抗体和抗体片段或抗体衍生物，包括但不限于人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体，例如scfv抗体片段和抗原结合抗体片段，例如fab和fab’片段，还包括抗体的所有重组形式，例如在原核生物中表达的抗体、非糖基化的抗体以及本文所述的任何抗原结合抗体片段和衍生物。每条重链由重链可变区(本文缩写为vh)和重链恒定区组成。每条轻链由轻链可变区(在本文中缩写为vl)和轻链恒定区组成。vh和vl区可以进一步细分为高变区，称作互补决定区(cdr)，其穿插于被称作框架区(fr)的更保守的区域。每个vh和vl由3个cdr和4个fr组成，从氨基端到羧基端按以下顺序排列：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白结合至宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(c1q)。
42.本文中，术语“检测”包括任何检测手段，包括直接和间接检测。
43.在一方面，本发明提供一种用于检测或捕获样本中的胰腺癌循环肿瘤细胞ctc的产品，其中，所述产品用于检测所述样本中的细胞表面标志物基因表达产物的水平，所述细胞表面标志物选自mfsd2b、itga2、pde3a、ptprn、oxtr、adra2a、bambi和slc24a中的一种或多种。
44.在一方面，本发明提供一种检测样本中的细胞表面标志物基因表达产物水平的产品在制备检测或捕获样本中的胰腺癌循环肿瘤细胞ctc的试剂、试剂盒或阵列中的用途，所述细胞表面标志物选自mfsd2b、itga2、pde3a、ptprn、oxtr、adra2a、bambi和slc24a中的一种或多种，其中：
45.所述产品用于检测所述样本中的细胞表面标志物基因表达产物的水平，如果检测到的所述细胞表面标志物基因表达产物的水平高于参比水平，则确定存在胰腺癌循环肿瘤细胞ctc；或
46.所述产品用于捕获样本中的胰腺癌循环肿瘤细胞ctc。
47.在一方面，本发明提供一种用于诊断受试者中的胰腺癌或确定受试者中发生胰腺癌的风险的细胞表面标志物表达产物，其中，所述细胞表面标志物选自mfsd2b、itga2、pde3a、ptprn、oxtr、adra2a、bambi和slc24a中的一种或多种。
48.在一方面，本发明提供一种检测样本中细胞表面标志物基因表达产物水平的产品在制备诊断受试者中的胰腺癌或确定受试者中发生胰腺癌的风险的试剂、试剂盒或阵列中的用途，其中，所述细胞表面标志物选自mfsd2b、itga2、pde3a、ptprn、oxtr、adra2a、bambi和slc24a中的一种或多种。
49.在一方面，本发明提供一种从样品中捕获胰腺癌循环肿瘤细胞ctc的方法，所述方法包括：使所述样品与靶向胰腺癌循环肿瘤细胞ctc上的细胞表面标志物的产品接触以捕获循环肿瘤细胞，其中，所述细胞表面标志物选自mfsd2b、itga2、pde3a、ptprn、oxtr、
adra2a、bambi和slc24a中的一种或多种，所述产品被固定化在固体支持物的表面上。
50.在一方面，本发明提供一种从样品中捕获胰腺癌循环肿瘤细胞ctc的装置，所述装置包括具有细胞捕获表面的通道，其中靶向胰腺癌循环肿瘤细胞ctc上的细胞表面标志物的产品固定至所述细胞捕获表面。
51.在一些实施方式中，所述装置是微流体装置。
52.在一些实施方式中，所述表达产物为核酸。
53.在一些实施方式中，利用选自于由如下所组成的组中的方法，将所述产品用于对所述表达产物的水平进行确定：rt-pcr；northern印迹；基于微阵列的表达分析；下一代测序以及rna原位杂交。
54.在一些实施方式中，利用定量rt-pcr，将所述产品用于对所述表达产物的水平进行确定。
55.在一些实施方式中，所述表达产物为多肽。
56.在一些实施方式中，利用选自于由如下所组成的组中的方法，将所述产品用于对所述表达产物的水平进行确定：western印迹；免疫沉淀；酶联免疫吸附测定法；放射性免疫测定法；夹心测定法；荧光原位杂交；免疫组织学染色；免疫荧光测定法；质谱法；facs以及免疫电泳测定法。
57.在一些实施方式中，所述细胞表面标志物还包含ca199和/或epcam。
58.在一些实施方式中，所述细胞表面标志物包含选自下述的任意一个的胞表面标志物的组合：
59.(1)epcam，以及选自itga2、ptprn、oxtr和bambi中的任意一个细胞表面标志物；
60.(2)ca199，以及选自itga2、ptprn、oxtr和bambi中的任意一个细胞表面标志物；
61.(3)ca199和epcam，以及选自itga2、ptprn、oxtr和bambi中的任意一个细胞表面标志物；
62.(4)ca199和epcam，以及选自itga2和ptprn组合、itga2和oxtr组合、itga2和bambi组合、ptprn和oxtr组合、ptprn和bambi组合、和oxtr和bambi组合中的任意一个组合。
63.在一些具体实施方式中，所述细胞表面标志物包含ca199、epcam、itga2和ptprn组合或ca199、epcam、oxtr和ptprn组合。
64.在一些实施方式中，所述产品是细胞表面标志物的抗体。
65.在一些具体实施方式中，所述抗体是单克隆抗体。
66.在一方面，本发明提供一种用于检测或捕获样本中的胰腺癌循环肿瘤细胞ctc的试剂盒或阵列，其中，所述试剂盒或阵列包含前述的产品。
67.在一方面，本发明提供一种辅助诊断受试者中的胰腺癌或确定受试者中发生胰腺癌的风险的试剂盒或阵列，其中，所述试剂盒或阵列包含前述的产品。
68.本发明针对现有ctc捕获产品存在的不足，对分离得到的胰腺癌患者的ctc样本数据进行单细胞测序，并与公共数据库的胰腺癌数据进行比对分析，筛选出一系列胰腺癌患者血液中ctc潜在的表面标志物。进一步，通过生物信息学分析，遴选出胰腺癌的候选的循环肿瘤细胞表面标志物(itga2、ptprn、oxtr、bambi、mfsd2b、adra2a、pde3a和slc24a3)。将这些标志物单独或多个与目前广泛使用的标志物(epcam和ca199)进行组合，利用包被有表面标志物抗体的微流控芯片，通过芯片捕获实验，在体外对胰腺癌细胞系和胰腺癌患者血
液样本的ctc进行捕获富集筛选测试，分析了表面标志物的真实性和有效性；并优化、筛选出捕获ctc效率较高的抗体组合(即，ca199+epcam+itga2+ptprn，以及ca199+epcam+oxtr+ptprn)。相比已有的ctc富集筛选产品，本发明使用针对新的表面标志物的抗体或抗体组合显著提高了胰腺癌患者血液中ctc细胞的富集数量和病人血液样本ctc的检出率，大大降低了漏检率，解决了以往胰腺癌患者血液ctc检出率低，检出量少的问题；大大提高了ctc的捕获富集效率，为更多胰腺癌肿瘤患者监测肿瘤动态、评估治疗效果，为医生对病人实现实时精准化个体治疗提供了有力的支持，具有巨大的市场价值和应用前景，为更多的肿瘤患者造福。
69.下面，参考具体实施例更详细地描述本发明，然而，实施例仅用于说明目的，对于本发明不具有限制作用。
70.实施例
71.实施例1：循环肿瘤细胞表面标志物的筛选与确定
72.1)循环肿瘤细胞表面标志物基因的筛选和分析
73.用流式分选技术收集胰腺癌患者血液中的循环肿瘤细胞，并进行单细胞测序。同时查找已发表的胰腺癌患者血液样本单细胞测序数据并进行比较分析。利用cellranger、seurat等分析工具，获得胰腺癌患者循环肿瘤细胞及血液样本中不同细胞类型表达谱信息，比较循环肿瘤细胞与血液中其他类型细胞的基因表达差异，解析胰腺癌患者循环肿瘤细胞特异性表达谱信息及异质性特征，寻找循环肿瘤细胞特有的表面标志物的编码基因。在此基础上，将这些特有的循环肿瘤细胞表面标志物的基因与公共数据库中胰腺癌患者的肿瘤蛋白表达谱和循环肿瘤细胞群体测序表达谱进行比对，找出上述样本共有的表面标志物基因mfsd2b、itga2、pde3a、ptprn、oxtr、adra2a、bambi和slc24a3(图1a和图1b)。筛选出的上述表面标志物基因在各类细胞中的表达水平比对结果显示，其在ctc中的表达水平远高于其他种类的细胞。
74.2)对上述步骤1)中分析出的基因进行蛋白序列分析
75.从上述标志物中筛选具有跨膜区段和胞外区段且表达量相对较高的标志物进行测试。初步筛选的循环肿瘤细胞表面标志物包括：mfsd2b、itga2、pde3a、ptprn、oxtr、adra2a、bambi和slc24a3。图2示出了初步筛选的循环肿瘤细胞表面标志物：mfsd2b、itga2、pde3a、ptprn、oxtr、adra2a、bambi和slc24a3，上述蛋白在细胞膜结构上的区段分布(图2a和图2b)。
76.3)用表面标志物对应的抗体对胰腺癌细胞进行捕获富集
77.首先将采集到的外周血进行分离，分离出的细胞经泵缓慢流经包被表面标志物抗体组合的微流控芯片。具有表面标志物的细胞被芯片捕获富集，然后将捕获的细胞进行洗脱收集，洗脱收集的细胞用荧光染色试剂进行染色，最后用荧光计数仪扫描计数。
78.用上述步骤2)中筛选的标志物的抗体进行相关肿瘤细胞富集筛选实验，包括胰腺癌细胞系以及胰腺癌肿瘤患者的血液样本。通过实验验证上述表面标志物对胰腺癌肿瘤细胞和血液中ctc的富集筛选能力。
79.结果显示：用ca199、epcam、oxtr和ptprn组合抗体包被芯片对胰腺癌细胞系以及胰腺癌肿瘤患者的血液样本中ctc的富集筛选能力远高于ca199和epcam单一抗体的富集筛选能力。产品的装置如图3所示，主要包括2大部分：一是捕获收集装置，该部分包括微流体
注射泵，包被有不同表面标志物的组合抗体，以及收集装置。二是荧光扫描计数系统，该系统可以对加样槽内的细胞进行扫描，然后根据不同的荧光颜色进行计数统计。
80.4)用胰腺癌细胞系su.86.86验证候选标志物的富集筛选能力
81.制备或购买mfsd2b、itga2、pde3a、ptprn、oxtr、adra2a、bambi和slc24a3抗体，mfsd2b抗体(货号：orb185620，厂家：biorbyt)；itga2抗体(货号：a72031-100，厂家：epigentek)；pde3a抗体(货号：np_000912，厂家：unitedstatesbiological)；ptprn抗体(货号：pa5-64913，厂家：thermo)；oxtr抗体(货号：o8251-04c-100ug，厂家：unitedstatesbiological)；adra2a抗体(货号：ls-b7669-50，lifespanbiosciences)；bambi抗体(货号：nbp2-58990，厂家：novusbiologicals)；slc24a3抗体(货号：df4524，厂家：affinitybiosciences)。用上述抗体分别或组合包被芯片，测试每种抗体对胰腺癌细胞富集筛选能力。
82.本实验中，选用胰腺癌经典细胞su.86.86作为实验细胞。用抗体包被好芯片后，将培养好的su.86.86细胞计数，每组1000个细胞，以一定的速度流经芯片，用收集液收集芯片捕获的细胞并进行计数。计数不同抗体对su.86.86胰腺癌细胞的捕获能力。
83.先单独使用上述标志物中的任意一种的抗体测试捕获富集胰腺癌肿瘤细胞能力(实验结果见(a))，然后用上述标志物抗体继续与epcam和/或ca199抗体分别或重叠组合，测试叠加抗体捕获富集胰腺癌肿瘤细胞能力(实验结果见(b)-(e))。
84.实验结果如下：
85.(a)包被单独一种抗体富集捕获细胞数百分比
86.由图4可见，通过单一抗体富集筛选实验，筛选出的标志物对su.86.86细胞均具有一定的捕获富集能力，捕获富集效率由高到低依次为itga2、ptprn、oxtr、bambi、mfsd2b、adra2a、pde3a和slc24a3。
87.(b)上述抗体分别与epcam抗体组合，测试捕获富集细胞数百分比(输入细胞总数)
88.由图5可见，epcam抗体联合itga2、ptprn、oxtr或bambi抗体的捕获效率较高，明显高于单独使用epcam抗体的捕获效率。
89.(c)上述抗体分别与ca199抗体组合，测试捕获富集细胞数百分比(输入细胞总数))
90.由图6可见，ca199抗体联合itga2、ptprn、oxtr或bambi抗体的捕获效率较高，明显高于单独使用ca199抗体的捕获效率。
91.(d)上述抗体分别与ca199和epcam抗体组合，测试抗体的叠加捕获富集胰腺癌细胞数百分比(输入细胞总数)
92.由图7可见，ca199和epcam抗体组合联合itga2、ptprn、oxtr或bambi抗体的捕获效率较高，明显高于ca199和epcam抗体组合的捕获效率。
93.(e)ca199和epcam抗体与筛选出的四种抗体两两组合，测试组合抗体捕获富集胰腺癌细胞数百分比(输入细胞总数)
94.由图8可见，ca199和epcam抗体组合联合itga2和ptprn抗体组合、itga2和oxtr抗体组合、itga2和bambi抗体组合、ptprn和oxtr抗体组合、ptprn和bambi抗体组合、或oxtr和bambi抗体组合的捕获效率较高，明显高于ca199和epcam抗体组合的捕获效率。
95.由以上实验可知，通过胰腺癌细胞系su.86.86实验，选出了效率较高的捕获抗体：
itga2、ptprn、oxtr、bambi、mfsd2b、adra2a、pde3a和slc24a3，其中，itga2，ptprn，oxtr和bambi抗体的捕获效率更高。将epcam和ca199组合抗体与itga2、ptprn、oxtr和bambi上述4种抗体分别单独联合使用，或与itga2、ptprn、oxtr和bambi上述4种抗体组合两两联合使用，其捕获效率均显著高于现有的epcam和ca199单独或联合的捕获方案。ca199、epcam、itga2和ptprn组合抗体以及ca199、epcam、oxtr和ptprn组合抗体是效率较高的两个组合方案，捕获效率分别可达98％和95％。
96.实施例2：组合抗体对不同胰腺癌细胞的捕获效率
97.用ca199、epcam、itga2和ptprn组合抗体以及ca199、epcam、oxtr和ptprn组合抗体包被芯片，培养四种胰腺癌细胞capan-1、cfpac-1、hs 766t、su.86.86，每种细胞计数1000个，分别将上述1000个四种胰腺癌细胞加入到7.5ml上样液中混匀，自动进样泵将样品以一定的流速泵入芯片，将芯片捕获富集的细胞收集后进行荧光染色，用荧光扫描仪扫描计数，计算组合抗体对四种胰腺癌细胞的捕获能力。
98.结果显示：ca199和epcam抗体组合联合itga2和ptprn抗体组合、或ptprn和oxtr抗体组合，对四种胰腺癌细胞的捕获富集效率高，均高于ca199和epcam抗体组合的捕获效率。
99.实施例3：组合抗体对血液中不同胰腺癌细胞的捕获效率
100.由实施例2可见，ca199、epcam、itga2和ptprn四种抗体组合对几个典型的胰腺癌细胞捕获富集能力优于ca199、epcam、oxtr和ptprn抗体组合。因此，在本实施例中，只用ca199、epcam、itga2和ptprn四种抗体组合后包被芯片，将培养的四种胰腺癌细胞capan-1、cfpac-1、hs 766t、su.86.86，每种细胞计数1000个，分别将1000个上述四种胰腺癌细胞加入7.5ml健康人全血中，混匀后用红细胞裂解液处理，收集的细胞沉淀再加入7.5ml保护液形成细胞混悬液，自动进样泵将细胞混悬液以一定的流速泵入芯片，将芯片捕获富集的细胞收集后进行荧光染色，并用荧光扫描仪扫描计数，计算组合抗体对全血中四种胰腺癌细胞的捕获能力。
101.以一定的流速流经芯片，用收集液收集芯片捕获的细胞，并用荧光marker对收集的细胞进行荧光染色。扫描计数后计算芯片对全血中四种胰腺癌细胞的捕获能力。
102.结果显示：ca199和epcam抗体组合联合itga2和ptprn抗体组合，对混合在血液中的四种胰腺癌细胞的捕获富集效率，明显高于ca199和epcam抗体组合的捕获效率。
103.实施例4：组合抗体对胰腺癌患者血液中ctc的捕获能力
104.用ca199、epcam、itga2和ptprn四种抗体组合后包被芯片，抽取7.5ml胰腺癌患者全血，并用红细胞裂解液进行处理，收集的细胞沉淀再加入7.5ml保护液形成细胞混悬液，自动进样泵将细胞混悬液以一定的流速泵入芯片，用收集液收集芯片捕获的细胞，并用荧光marker对收集的细胞进行荧光染色。用荧光扫描计数仪对样本进行扫描计数分析，记录组合抗体包被芯片对胰腺癌患者血液中ctc的捕获数量。
105.结果显示：ca199和epcam抗体组合联合itga2和ptprn抗体组合，对10例胰腺癌患者的血液样本进行ctc捕获富集，ca199和epcam抗体组合联合itga2和ptprn抗体组合捕获富集ctc的个数总体高于ca199和epcam抗体组合的捕获富集ctc个数。

技术特征：
1.一种用于检测或捕获样本中的胰腺癌循环肿瘤细胞ctc的产品，其中，所述产品用于检测所述样本中的细胞表面标志物基因表达产物的水平，所述细胞表面标志物选自mfsd2b、itga2、pde3a、ptprn、oxtr、adra2a、bambi和slc24a中的一种或多种。2.一种检测样本中的细胞表面标志物基因表达产物水平的产品在制备检测或捕获样本中的胰腺癌循环肿瘤细胞ctc的试剂、试剂盒或阵列中的用途，所述细胞表面标志物选自mfsd2b、itga2、pde3a、ptprn、oxtr、adra2a、bambi和slc24a中的一种或多种，其中：所述产品用于检测所述样本中的细胞表面标志物基因表达产物的水平，如果检测到的所述细胞表面标志物基因表达产物的水平高于参比水平，则确定存在胰腺癌循环肿瘤细胞ctc；或所述产品用于捕获样本中的胰腺癌循环肿瘤细胞ctc。3.一种用于诊断受试者中的胰腺癌或确定受试者中发生胰腺癌的风险的细胞表面标志物表达产物，其中，所述细胞表面标志物选自mfsd2b、itga2、pde3a、ptprn、oxtr、adra2a、bambi和slc24a中的一种或多种。4.一种检测样本中细胞表面标志物基因表达产物水平的产品在制备诊断受试者中的胰腺癌或确定受试者中发生胰腺癌的风险的试剂、试剂盒或阵列中的用途，其中，所述细胞表面标志物选自mfsd2b、itga2、pde3a、ptprn、oxtr、adra2a、bambi和slc24a中的一种或多种。5.一种从样品中捕获胰腺癌循环肿瘤细胞ctc的方法，所述方法包括：使所述样品与靶向胰腺癌循环肿瘤细胞ctc上的细胞表面标志物的产品接触以捕获循环肿瘤细胞，其中，所述细胞表面标志物选自mfsd2b、itga2、pde3a、ptprn、oxtr、adra2a、bambi和slc24a中的一种或多种，所述产品被固定化在固体支持物的表面上。6.一种从样品中捕获胰腺癌循环肿瘤细胞ctc的装置，所述装置包括具有细胞捕获表面的通道，其中靶向胰腺癌循环肿瘤细胞ctc上的细胞表面标志物的产品固定至所述细胞捕获表面；优选地，所述装置是微流体装置。7.如权利要求1所述的产品、权利要求2、4或所述的用途或权利要求3所述的表达产物，其中，所述表达产物为核酸；优选地，利用选自于由如下所组成的组中的方法，将所述产品用于对所述表达产物的水平进行确定：rt-pcr；northern印迹；基于微阵列的表达分析；下一代测序以及rna原位杂交；更优选地，利用定量rt-pcr，将所述产品用于对所述表达产物的水平进行确定。8.如权利要求1所述的产品、权利要求2或4所述的用途或权利要求3所述的表达产物，其中，所述表达产物为多肽；优选地，利用选自于由如下所组成的组中的方法，将所述产品用于对所述表达产物的水平进行确定：western印迹；免疫沉淀；酶联免疫吸附测定法；放射性免疫测定法；夹心测定法；荧光原位杂交；免疫组织学染色；免疫荧光测定法；质谱法；facs以及免疫电泳测定法。9.如权利要求1、7-8中任一项所述的产品、权利要求2、4、7-8中任一项所述的用途权利要求3、7-8中任一项所述的表达产物、权利要求5所述的方法或权利要求6所述的装置，其
中，所述细胞表面标志物还包含ca199和/或epcam；优选地，所述细胞表面标志物包含选自下述的任意一个的胞表面标志物的组合：(1)epcam，以及选自itga2、ptprn、oxtr和bambi中的任意一个细胞表面标志物；(2)ca199，以及选自itga2、ptprn、oxtr和bambi中的任意一个细胞表面标志物；(3)ca199和epcam，以及选自itga2、ptprn、oxtr和bambi中的任意一个细胞表面标志物；(4)ca199和epcam，以及选自itga2和ptprn组合、itga2和oxtr组合、itga2和bambi组合、ptprn和oxtr组合、ptprn和bambi组合、和oxtr和bambi组合中的任意一个组合；更优选地，所述细胞表面标志物包含ca199、epcam、itga2和ptprn组合或ca199、epcam、oxtr和ptprn组合。10.如权利要求1、7-9中任一项所述的产品、权利要求2、4、7-9中任一项所述的用途或权利要求3、7-9中任一项所述的表达产物、权利要求5或9所述的方法或权利要求6或9所述的装置，其中，所述产品是细胞表面标志物的抗体；优选地，所述抗体是单克隆抗体。11.一种用于检测或捕获样本中的胰腺癌循环肿瘤细胞ctc的试剂盒或阵列，其中，所述试剂盒或阵列包含权利要求1、7-10中任一项所述的产品。12.一种辅助诊断受试者中的胰腺癌或确定受试者中发生胰腺癌的风险的试剂盒或阵列，其中，所述试剂盒或阵列包含权利要求1、7-10中任一项所述的产品。

技术总结
本发明提供一种胰腺癌循环肿瘤细胞的表面标志物及其应用。其中，所述细胞表面标志物选自MFSD2B、ITGA2、PDE3A、PTPRN、OXTR、ADRA2A、BAMBI和SLC24A中的一种或多种。本发明使用针对新的胰腺癌循环肿瘤细胞(CTC)的表面标志物的抗体或抗体组合显著提高了胰腺癌患者血液中CTC细胞的富集数量和病人血液样本CTC的检出率，大大降低了漏检率；大大提高了CTC的捕获富集效率，为更多胰腺癌肿瘤患者监测肿瘤动态、评估治疗效果，为医生对病人实现实时精准化个体治疗提供了有力的支持，具有巨大的市场价值和应用前景，为更多的肿瘤患者造福。为更多的肿瘤患者造福。


技术研发人员：石虎兵 孔祥菊 徐琪
受保护的技术使用者：成都普瑞康生物科技有限公司
技术研发日：2023.03.07
技术公布日：2023/7/21