一种人血白蛋白糖基化蛋白去除的方法与流程

1.本发明属于生物大分子分离纯化领域，具体涉及一种人血白蛋白糖基化蛋白去除的方法。


背景技术：

2.人血清白蛋白(hsa)是人体血浆中的主要蛋白质成分，在血浆中含量为38-42g/l，占血浆总蛋白的60％，它是由585个氨基酸组成的单一非糖基化多肽链组成，形成一个分子量为66.5kda的心形分子。临床上，hsa常用于治疗严重低蛋白血症和创伤性休克，一般用剂量超过10g/剂。
3.近些年，医药行业对人血白蛋白的需求激增，导致人血白蛋白供不应求。迄今为止，hsa主要是通过分离人类血浆生产而来，但是这种方法存在两个问题，一是人体血浆供应有限、产量低、价格昂贵，且主要依靠国外进口，在2021年人血白蛋白的进口量高达60％，而其他年限的进口量也在50％左右；二是血液的来源不同，存在血液来源感染病原体的潜在风险。基因重组技术可以有效解决以上问题，因此，开发基因工程制备重组人血白蛋白的方法具有重大意义。
4.基因重组制备蛋白的方式分为原核表达系统：主要利用大肠杆菌和枯草杆菌等，但是存在分泌量低、分离纯化复杂等问题；真核表达系统：以毕赤酵母生产重组系统为主要的表达系统，如green cross利用巴士毕赤酵母制备的rhsa在日本已投入iii期临床试验，英国delat公司和日本yoshiotmi公司也利用酵母实现人血清白蛋白的表达，但外源基因会作为杂质存在于最终产物使纯化过程更复杂，且许多蛋白质在翻译后修饰表现为糖基化，会影响蛋白质构象的稳定性、免疫原性、清除率。除此之外，如武汉禾川生物制药利用植物系统水稻基因表达获取人血白蛋白的技术显示已投入ii期临床试验，但主要用于培养基辅料注射级别的制备仍然在研究阶段。
5.为了解决重组蛋白的规模化应用问题，开发高效、简单、低成本的纯化技术也是亟需解决的问题。目前利用到的纯化方法主要有多步层析组合分离纯化或利用超滤或者透析的方法，但这些方法步骤复杂、成本较贵，对糖基化蛋白选择性低，不能简单有效地去除人血白蛋白中的糖基化蛋白。


技术实现要素：

6.本发明利用高载量硼酸填料解决重组人血白蛋白工业化生产中糖基化蛋白去除的难题，即保证hsa的回收率，又可以除去糖基化蛋白。该纯化方法步骤少，操作简单，同时由于硼酸填料的高载量特性，可以有效的降低成本和时间，有利于重组hsa的规模化提纯。
7.一种人血白蛋白糖基化蛋白去除的方法，使用以高载量硼酸为填料的液相色谱法，纯化方法为流穿模式，流动相选自pb+nacl、pbs，线速度≤360cm/h，所述硼酸填料的结构式为
[0008][0009]
其中基质为表面含有羟基的聚合物，r1为环氧基或者卤素，r2为o、n、s，r3为c2～c5，r4为c1～c4，n为1-50的整数。
[0010]
进一步地，主要包含以下步骤：
[0011]
1)平衡：平衡体系选自pb+nacl，pbs；
[0012]
2)上样：重组人血白蛋白原样；
[0013]
3)后平衡：后平衡体系与步骤1)中所述的平衡体系一致；
[0014]
4)洗脱：洗脱体系选自甲酸，柠檬酸，醋酸钠，醋酸钠+tris，tris+山梨醇+edta。
[0015]
进一步地，所述pb可为20-50mm，nacl可为100-500mm，pbs为50mm。
[0016]
进一步地，所述平衡方法具体为，3cv，线速度≤360cm/h。
[0017]
进一步地，所述上样方法具体为，按载量100-200mg/ml计，泵入重组人血白蛋白原样，驻留时间5min，收集流穿液。上样液可为精纯前或精纯后，一般为精纯后样品。
[0018]
进一步地，所述后平衡方法具体为，3cv，线速度≤360cm/h。
[0019]
进一步地，所述甲酸为0.1％，所述柠檬酸为20mm，所述醋酸钠为100mm，所述醋酸钠+tris的浓度为100mm tris+50mm醋酸钠，所述tris+山梨醇+edta的浓度为100mm tris+200mm山梨醇+50mm edta。
[0020]
进一步地，所述洗脱方法具体为，3cv，线速度≤360cm/h。
[0021]
进一步地，色谱柱为monomix hc60-boronate，柱温为室温，检测波长uv 280nm。
[0022]
本发明中的主要原理是利用硼酸亲和填料中的硼酸与顺式二羟基化合物之间的共价配位作用实现目标物的分离纯化。在碱性条件下，硼酸基团能与糖基化蛋白中的顺式二羟基结构作用，生成稳定的五元环络合物，糖基化蛋白被介质填料吸附；另外由于采用的是苏州赛分科技高载量新型硼酸亲和填料，其中的硼酸基团含量多，可在流穿模式下快速分离纯化，既能保证样品的稳定性，又能保持较高的上样量。平衡体系的流动相可采用nacl+pb(nah2po4和na2hpo4的磷酸盐缓冲液)，pbs(nacl、kcl、kh2po4和na2hpo4的混合磷酸盐缓冲液)或tris-hcl(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液)等盐溶液，其ph＝7.0-8.0，加盐的目的主要防止非特异性结合和离子作用，降低静电排斥力，所以一般ph值为弱碱性条件。
[0023]
在洗脱环节中，既可采用甲酸，柠檬酸，醋酸钠，醋酸钠+tris等酸性溶液(ph＝2.5-5.0)洗脱，在酸性条件下络合被打开，糖基化蛋白分子从填料上解吸附，所以洗脱一般为酸性条件ph＝2.5-5.0，线速度≤360cm/h即可。此外，也可采用tris+山梨醇+edta等弱碱性溶液洗脱，其原理主要是利用含有与亲和配基硼酸基团具有亲和结合作用的小分子化合物溶液为洗脱剂，通过与硼酸基团的竞争性结合，脱附目标产物，洗脱条件温和，有利于保护目标产物的生物活性。在该体系下，洗脱液中的山梨醇的浓度高于填料基球表面结合的糖基化蛋白浓度，洗脱液中山梨醇与糖基化蛋白竞争硼酸位点，使糖蛋白脱落随洗脱液流
出。
[0024]
通常情况下，在洗脱环节后还需要通过再生方法清洗填料，使填料可重复使用，再生环节中使用的流动相主要为醋酸钠+nacl或tris-hcl+nacl溶液。
[0025]
有益效果：
[0026]
1)批次处理量大：本发明中，利用赛分科技生产的高载量的硼酸填料，上样量可达到100～200mg/ml，大大提高生产效率，缩短生产周期，降低生产成本及风险。
[0027]
2)收率及纯度高：monomix hc60-boronate填料以高聚物微球为基质，粒径为60μm，粒径均一，具有良好的物理化学稳定性，且层析介质表面经赛分科技特殊处理，具有更好的亲水性，最大程度地避免了与生物类样品的非特异性吸附，其次硼酸亲和为特异性结合，整体收率大于97％，纯度大于99％。
附图说明
[0028]
图1为实施例1重组人血白蛋白纯化图谱；
[0029]
图2为实施例1纯化后人血蛋白流穿液1的hplc图谱；
[0030]
图3为实施例5纯化后人血蛋白流穿液5的hplc图谱；
[0031]
图4为原液重组人血白蛋白的hplc分离放大图谱。
具体实施方式
[0032]
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式。相反地，提供这些实施方式的目的是使对本发明公开内容理解更加透彻全面。
[0033]
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
[0034]
实施例1
[0035]
色谱柱规格：monomix hc60-boronate(25mm
×
100mm)；
[0036]
流动相：a：20mm pb+150mm nacl(ph＝7.5)；
[0037]
b：0.1％甲酸(ph＝2.5)；
[0038]
检测器波长：uv 280nm；
[0039]
色谱柱温度：室温。
[0040]
实验步骤
[0041]
①
平衡：100％a(20mm pb+150mm nacl)，3cv，线速度为360cm/h；
[0042]
②
上样：按载量100mg/ml计进样，驻留时间5min，收集流穿液1；
[0043]
③
后平衡：100％a(20mm pb+150mm nacl)，2cv，线速度为360cm/h；
[0044]
④
洗脱：100％ b(0.1％甲酸)，3cv，线速度为360cm/h；
[0045]
⑤
再生：0.1m醋酸钠+0.5m nacl(ph＝3.5)，3cv，线速度为360cm/h。
[0046]
实施例2
[0047]
色谱柱规格：monomix hc60-boronate(25mm
×
100mm)；
[0048]
流动相：a：50mm pbs(ph＝7.5)；
[0049]
b：100mm tris+50mm醋酸钠(ph＝5.0)；
[0050]
检测器波长：uv 280nm；
[0051]
色谱柱温度：室温。
[0052]
实验步骤
[0053]
①
平衡：100％a，3cv，线速度为300cm/h；
[0054]
②
上样：按载量200mg/ml计进样，驻留时间5min，收集流穿液2；
[0055]
③
后平衡：100％a，3cv，线速度为300cm/h；
[0056]
④
洗脱：100％b，3cv，线速度为300cm/h；
[0057]
⑤
再生：0.1m醋酸钠+0.5m nacl(ph＝3.5)，3cv，线速度为300cm/h。
[0058]
实施例3
[0059]
色谱柱规格：monomix hc60-boronate(25mm
×
100mm)；
[0060]
流动相：a：20mm pb+150mm nacl(ph＝7.5)；
[0061]
b：20mm柠檬酸(ph＝3.0)；
[0062]
检测器波长：uv 280nm；
[0063]
色谱柱温度：室温。
[0064]
实验步骤
[0065]
①
平衡：100％a，3cv，线速度为240cm/h；
[0066]
②
上样：按载量120mg/ml计进样，驻留时间5min，收集流穿液3；
[0067]
③
后平衡：100％a，3cv，线速度为240cm/h；
[0068]
④
洗脱：100％ b，3cv，线速度为240cm/h；
[0069]
⑤
再生：0.1m tris-hcl+0.5m nacl(ph＝8.0)，5cv，线速度为240cm/h；实施例4
[0070]
色谱柱规格：monomix hc60-boronate(25mm
×
200mm)；
[0071]
流动相：a：50mm pb+500mm nacl(ph＝7.5)；
[0072]
b：100mm醋酸钠(ph＝3.5)；
[0073]
检测器波长：uv 280nm；
[0074]
色谱柱温度：室温。
[0075]
实验步骤
[0076]
①
平衡：100％a，3cv，线速度为300cm/h；
[0077]
②
上样：按载量150mg/ml计进样，驻留时间5min，收集流穿液4；
[0078]
③
后平衡：100％a，3cv，线速度为300cm/h；
[0079]
④
洗脱：100％ b，3cv，线速度为300cm/h；
[0080]
⑤
再生：100％ b，5cv，线速度为300cm/h；
[0081]
实施例5
[0082]
色谱柱规格：monomix hc60-boronate(25mm
×
300mm)；
[0083]
流动相：a：30mm pb+200mm nacl(ph＝7.5)；
[0084]
b：100mm tris+200mm山梨醇+50mm edta(ph＝7.5)；
[0085]
检测器波长：uv 280nm；
[0086]
色谱柱温度：室温。
[0087]
实验步骤
[0088]
①
平衡：100％a，3cv，线速度为200cm/h；
[0089]
②
上样：按载量180mg/ml计进样，驻留时间5min，收集流穿液5；
[0090]
③
后平衡：100％a，3cv，线速度为200cm/h；
[0091]
④
洗脱：100％b，3cv，线速度为200cm/h；
[0092]
⑤
再生：0.1m醋酸钠+0.5m nacl(ph＝3.5)，3cv，线速度为200cm/h。
[0093]
纯化结果分析
[0094]
将纯化后的流穿液1-5采用hplc分析：
[0095]
色谱柱：proteomix por20-cona(20μm，4.6
×
50mm)
[0096]
流动相：a：50mm乙酸钠+200mm氯化钠+1mm氯化钙+1mm氯化镁(ph＝5.3)
[0097]
b：a+100mmα-甲基-d-甘露糖苷
[0098]
流速：0.5ml/min；
[0099]
检测器波长：uv 280nm；
[0100]
柱温：室温；
[0101]
进样量：20μl纯化后流穿液1-5。
[0102]
原样品hplc检测
[0103]
色谱柱规格：proteomix por20-cona(20μm，4.6
×
50mm)
[0104]
流动相：a：50mm乙酸钠+200mm氯化钠+1mm氯化钙+1mm氯化镁(ph＝5.3)
[0105]
b：a+100mmα-甲基-d-甘露糖苷
[0106]
流速：0.5ml/min；
[0107]
检测器波长：uv 280nm；
[0108]
柱温：室温；
[0109]
进样量：20μl重组人血白蛋白原样(100mg/ml)。
[0110]
回收率计算方法：
[0111][0112]
流穿液中白蛋白：根据液相测试浓度，依照样品标准曲线计算其质量(mg)。
[0113]
重组白蛋白进样质量＝层析柱体积*进样量(mg)。
[0114]
纯度计算方法：
[0115][0116]
流穿液中白蛋白：根据液相测试浓度，依照样品标准曲线计算其质量(mg)。
[0117]
糖基化蛋白质量：根据液相测试浓度，依照样品标准曲线计算其质量(mg)。
[0118]
实施例1-5的回收率及纯度
[0119][0120]
以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种人血白蛋白糖基化蛋白去除的方法，其特征在于，使用以高载量硼酸为填料的液相色谱法，纯化方法为流穿模式，流动相选自pb+nacl、pbs，线速度≤360cm/h，所述硼酸填料的结构式为其中基质为表面含有羟基的聚合物，r1为环氧基或者卤素，r2为o、n、s，r3为c2～c5，r4为c1～c4，n为1-50的整数。2.根据权利要求1所述的人血白蛋白糖基化蛋白去除的方法，其特征在于，主要包含以下步骤：1)平衡：平衡体系选自pb+nacl，pbs；2)上样：重组人血白蛋白原样；3)后平衡：后平衡体系与步骤1)中所述的平衡体系一致；4)洗脱：洗脱体系选自甲酸，柠檬酸，醋酸钠，醋酸钠+tris，tris+山梨醇+edta。3.根据权利要求2所述的人血白蛋白糖基化蛋白去除的方法，其特征在于，所述pb可为20-50mm，nacl可为100-500mm，pbs为50mm。4.根据权利要求3所述的人血白蛋白糖基化蛋白去除的方法，其特征在于，所述平衡方法具体为，3cv，线速度≤360cm/h。5.根据权利要求2所述的人血白蛋白糖基化蛋白去除的方法，其特征在于，所述上样方法具体为，按载量100-200mg/ml计，泵入重组人血白蛋白原样，驻留时间5min，收集流穿液。6.根据权利要求3所述的人血白蛋白糖基化蛋白去除的方法，其特征在于，所述后平衡方法具体为，3cv，线速度≤360cm/h。7.根据权利要求2所述的人血白蛋白糖基化蛋白去除的方法，其特征在于，所述甲酸为0.1％，所述柠檬酸为20mm，所述醋酸钠为100mm，所述醋酸钠+tris的浓度为100mm tris+50mm醋酸钠，所述tris+山梨醇+edta的浓度为100mm tris+200mm山梨醇+50mm edta。8.根据权利要求7所述的人血白蛋白糖基化蛋白去除的方法，其特征在于，所述洗脱方法具体为，3cv，线速度≤360cm/h。9.根据权利要求1-8所述的人血白蛋白糖基化蛋白去除的方法，其特征在于，色谱柱为monomix hc60-boronate，柱温为室温，检测波长uv 280nm。

技术总结
本发明公开了一种人血白蛋白糖基化蛋白去除的方法，使用以高载量硼酸为填料的液相色谱法，纯化方法为流穿模式，流动相选自PB+NaCl、PBS，线速度≤360cm/h，该方法不仅能解决工业生产的人血白蛋白糖基化去除问题，而且具有易放大、成本低、周期短、收率高、纯度好、生产风险低、工艺路径简单、可规模化处理，对产品开发人员专业能力要求低等优点。发人员专业能力要求低等优点。


技术研发人员：张松 李莹 胡新妹
受保护的技术使用者：苏州赛分科技股份有限公司
技术研发日：2023.05.12
技术公布日：2023/7/22