一种扩增华南稻育种相关数量性状基因位点的多重PCR引物组合的制作方法

一种扩增华南稻育种相关数量性状基因位点的多重pcr引物组合
技术领域
1.本发明涉及一种扩增华南稻育种相关数量性状基因位点的多重pcr引物组合，以及采用该多重pcr引物组合的华南稻育种相关数量性状基因位点的扩增体系和试剂盒，以及采用该扩增体系获取华南稻育种相关数量性状基因位点的序列的方法和华南稻育种相关数量性状基因位点的检测方法，属于水稻分子生物学技术领域。


背景技术：

2.粮食事关国运民生，粮食安全也是国家安全的重要基础。不断增长的人口、不断减少的耕地面积及愈发恶劣的自然环境，使得我国乃至全球的粮食安全面临极大的挑战。
3.水稻作为重要的粮食作物之一，为全球近一半人口提供主食。我国稻区共分为华南稻区、长江上游稻区、长江中游稻区、长江下游稻区、东北稻区、华北西北稻区等六大区。
4.其中，华南稻区跨热带和亚热带气候区，主要包括广东、广西、福建、海南四个省(区)，是我国主要的水稻产地之一，其水稻播种面积占到我国的20％左右，并且华南稻区作为世界水稻的起源驯化中心之一，拥有丰富的稻种资源，也是中国近代水稻育种和矮化育种的发源地。
5.近40年来，华南地区科研工作者育成一系列全国知名水稻品种，如常规稻“桂朝2号”、“双桂1号”和“黄华占”；不育系“博a”和“丰田a”；恢复系“华占”、“桂99”和“广恢998”。据国家水稻中心数据记录，到2020年经农业部确认的超级稻品种有133个，其中由华南地区选育的品种有25个，占总数的18.8％。
6.当然，与其他稻区一样，华南稻区同样面临着水稻优质种质资源发掘和利用滞后、育种突破性进展缓慢、遗传背景同质化明显等问题。
7.目前关于分子设计育种的研究策略主要包括以下内容：可以通过高通量测序的方式进行基因组de novo和重测序，获得该物种的参考基因组，一次性鉴定物种全部基因组资源，充分挖掘该物种的所有变异信息(snp、indel、cnv、sv等)，为后续位点筛选工作的展开奠定基础；可以利用测序获得的snp位点定制高通量或中通量的snp检测芯片，通过qtl定位、gwas、选择性清除等策略找到目标性状相关的snp位点，实现分子标记的筛选和性状定位；还可以采用低密度候选snp位点定制的方式，进一步对大规模样本进行基因分型，满足常规应用的分子标记辅助育种需求。
8.随着水稻功能基因组学和基因组学的快速发展，越来越多的水稻数量性状位点和基因被发掘和克隆。针对这些数量性状基因的优异等位开发与其高度连锁的分子标记，进行分子标记对杂交后代进行筛选，可以快速准确的找到携带目标基因型的育种后代材料，提高水稻育种效率。虽然已有几百个控制产量、品质、抗性等重要农艺性状的水稻数量性状基因被克隆，但是仅有少数基因被应用于分子辅助选择育种，大量优异等位基因还没有被应用于分子育种。此外，现有的分子辅助选择技术大多依赖的是与优异等位基因紧密连锁的分子标记进行筛选，而不是针对数量性状位点的关键变异进行筛选，有一定的错误率。
9.目前，发明人经文献整合分析获得了多个华南稻育种相关数量性状基因，希望对这些育种相关数量性状基因进行筛选，并利用多重pcr引物组合，一次性捕获多个育种相关数量性状基因的位点序列，且对这些基因位点序列进行靶向测序检测，分析育种相关数量性状基因与其农艺性状的关系，为挖掘华南稻优质种质资源提供理论依据，对推动华南稻育种创新具有重要意义。


技术实现要素：

10.为解决上述技术问题，本发明第一方面提供了一种用于扩增华南稻育种相关数量性状基因位点的多重pcr引物组合，其中，
11.所述多重pcr引物组合包括第1～17引物对；
12.所述第1～17引物对的上游引物序列分别如seq id no:1、seq id no:3、seq id no:5、seq id no:7、seq id no:9、seq id no:11、seq id no:13、seq id no:15、seq id no:17、seq id no:19、seq id no:21、seq id no:23、seq id no:25、seq id no:27、seq id no:29、seq id no:31、seq id no:33所示；
13.所述第1～17引物对的下游引物序列分别如seq id no:2、seq id no:4、seq id no:6、seq id no:8、seq id no:10、seq id no:12、seq id no:14、seq id no:16、seq id no:18、seq id no:20、seq id no:22、seq id no:24、seq id no:26、seq id no:28、seq id no:30、seq id no:32、seq id no:34所示。
14.在本发明的一个优选实施方案中，将所述第1～17引物对置于同一个引物池中进行pcr扩增。
15.本发明第二方面提供了一种华南稻育种相关数量性状基因位点的扩增体系，其中，所述扩增体系包括用于扩增的缓冲体系和如上述的多重pcr引物组合。
16.本发明第三方面提供了一种试剂盒，其中，所述试剂盒所采用的引物为上述的多重pcr引物组合。
17.本发明第四方面提供了一种获取华南稻育种相关数量性状基因位点的序列的方法，其中，所述方法包括以下依次进行的步骤：
18.步骤1)提取华南稻的基因组dna；
19.步骤2)采用如上述的扩增体系对所述步骤1)所获得的基因组dna进行pcr扩增，并对获得的扩增产物进行纯化，得到华南稻育种相关数量性状基因位点的序列片段的混合物。
20.在本发明的一个优选实施方案中，在所述步骤2)中，采用如权利要求3所述的扩增体系对所述步骤1)所获得的基因组dna进行第一轮多重pcr反应；再对所述第一轮多重pcr反应的产物进行磁珠纯化，将所述磁珠纯化的产物作为第二轮pcr反应的模板，采用引物对a进行第二轮pcr反应；将所述第二轮pcr反应富集后的产物作为第三轮pcr反应的模板，采用引物对b进行第三轮pcr反应，获得华南稻育种相关数量性状基因位点的测序片段的混合物；所述引物对a的上游引物序列如seq id no:35所示；所述引物对a的下游引物序列如seq id no:36所示；所述引物对b的上游引物序列为atcacg；所述引物对b的下游引物序列为gacgac。
21.本发明第五方面提供了一种华南稻育种相关数量性状基因位点的检测方法，其
中，所述检测方法包括采用如上述的方法获得华南稻育种相关数量性状基因位点的序列片段的混合物，并以该混合物作为样本构建测序文库，并进行测序分析。
22.可以理解的，在本发明范围内，本发明的上述各项技术特征和在下文(如实施例中)具体描述的各项技术特征之间可以相互组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不一一赘述。
附图说明
23.图1为本技术具体实施方案的第1至4部分的操作流程图。
具体实施方式
24.本技术的发明人经过广泛而深入地研究，整合分析了目前已公开的多个华南稻育种相关数量性状基因以及突变信息，并针对这些基因位点及其突变信息设计了大量的叠瓦式、多重pcr引物组合，通过大量实验验证，最终筛选了11个华南稻育种相关数量性状基因(fgr、wx、alk、gs3、gl7、pi1、pi2、pita、xa7、xa23、bph30)以及用于扩增这些基因位点的多重pcr引物组合；这些pcr引物组合不仅能够从水稻基因组上通过单管操作一次性捕获多个华南稻育种相关数量性状基因，并有效避免位点之间的相互干扰，提高准确性，且降低了交叉污染的风险；此外，这些引物之间基本没有相互作用，避免了引物二聚体的形成，减少了非特异性的扩增；因此，采用本技术的多重pcr引物组合及其扩增体系，大大削减了现有技术的繁琐操作，降低了成本、提高了扩增效率，更重要的是，能够直接构建测序文库并匹配现有的测序平台(例如目前主流的二代测序平台)。对于水稻育种工作者来说，能够一次性捕获多个育种相关数量性状基因的位点序列，且对这些基因位点序列进行靶向测序检测，分析育种相关数量性状基因与其农艺性状的关系，为挖掘华南稻优质种质资源提供理论依据，便于后续能够更快更准确地设计或验证华南稻育种路线，极大地提高了育种的效率。
25.以下将结合具体实施方式对本发明进行详细描述。但这些实施方式并不限制本发明，本领域的普通技术人员根据这些实施方式所做出的结构、方法、或功能上的变换均包含在本发明的保护范围内。
26.下面实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到(例如，常规生化试剂商店购买得到的)。
27.下述第1-4部分的操作流程图，具体参见图1。
28.1.用于扩增华南稻育种相关数量性状基因位点的多重pcr引物组合
29.本技术的发明人整合分析了目前已公开的华南稻育种相关数量性状基因信息以及突变信息，并针对这些基因位点及其突变信息设计了大量的叠瓦式、多重pcr引物组合。一方面为保证这些引物组合能够覆盖多个华南稻育种相关数量性状基因位点，另一方面排除位点之间的、引物之间的相互干扰，发明人对这些候选引物对进行了大量实验验证，最终筛选了11个华南稻育种相关数量性状基因(fgr、wx、alk、gs3、gl7、pi1、pi2、pita、xa7、xa23、bph30)以及能够一次性捕获这些基因位点的多重pcr引物组合。
30.具体如下表1所示。
31.表1
32.[0033][0034]
2.获取华南稻育种相关数量性状基因位点的测序片段
[0035]
在本发明的一个具体实施方案中，获取华南稻育种相关数量性状基因位点的序列片段的方法，包括以下依次进行的步骤：
[0036]
步骤1)提取华南稻的基因组dna；
[0037]
步骤2)对所述步骤1)所获得的基因组dna进行pcr扩增，并对获得的扩增产物进行纯化，得到华南稻育种相关数量性状基因位点的序列片段的混合物。
[0038]
步骤1)中，提取华南稻的基因组dna的具体方法，可以采用现有技术中市售的全基
因组dna提取试剂盒及其提取方法，或者其他已公开的提取试剂及方法。
[0039]
步骤1)中，华南稻的样本可采用种子、幼苗、叶片、穗子等组织或器官，优选种子或叶片。
[0040]
具体在本实施例中，取华南稻样品的叶片(分别取12种不同品种的华南稻：安丰b、吉丰b、广泰b、润b、荣3b、新泰b、泰丰b、象牙香占、广恢1002、19香、华占粤香430；由广东省农业科学院水稻研究所提供)。
[0041]
将叶片剪直径约2-3厘米的部分，置于96深孔板中，每孔加入2粒5mm钢珠及400μltps溶液，60hz，1min进行破碎；65℃烘箱加热20min，期间轻微颠倒混匀；在4000rpm离心20min，吸取上清液200μl转移至新的离心管中，加入等体积预冷的异丙醇，轻轻颠倒混匀，4000rpm离心20min；弃上清液，加入400μl 75％乙醇，洗涤2遍，获得全基因组dna，过夜至晾干为止，加入200μl无菌水溶解备用。
[0042]
在本发明的一个具体实施方案中，在所述步骤2)中，对所述步骤1)所获得的基因组dna进行第一轮多重pcr反应；再对所述第一轮多重pcr反应的产物进行磁珠纯化，将所述磁珠纯化的产物作为第二轮pcr反应的模板，采用引物对a进行第二轮pcr反应；将所述第二轮pcr反应富集后的产物作为第三轮pcr反应的模板，再采用引物对b进行第三轮pcr反应，由此获得华南稻育种相关数量性状基因位点的测序片段的混合物。
[0043]
具体在本实施例中，步骤(2)中，第一轮多重pcr反应的反应管中加入上述第1～17引物对，采用tag酶扩增体系(购自南京诺唯赞公司2
×
tag plusmastermix ii(dye plus))。
[0044]
每个反应管加入50ng上述步骤1)提取的叶片gdna，第一轮多重pcr反应的反应体系：supermix(5x)5微升，引物对2.5微升，加入rnase freewater补足25微升。
[0045]
第一轮多重pcr反应条件如下：盖子加热至105℃；94℃预热5min；98℃变性15s；60℃退火20min；72℃延伸2min；重复4个循环；98℃变性15s；60℃退火2min；72℃延伸2min；重复18个循环；72℃保持10min。
[0046]
具体在本实施例中，对第一轮多重pcr产物(大小不同的华南稻育种相关数量性状基因)进行磁珠纯化，具体操作：磁珠混匀后，室温静置30min，取12μl pcr产物，22μl rnase free water，吹打混匀30次。加入34μl磁珠，吹打混匀30次，室温静置5min，磁珠吸附至澄清；上清液放置到新管中备用，上清液管中加入11μl磁珠，吹打混匀30次，室温静置5min，磁珠吸附至澄清，弃上清；向磁珠中加入120μl 85％乙醇，室温静置30s，磁珠吸附至澄清，弃上清；室温静置一分钟，等待乙醇完全挥发。向管中加入20μlte，吹打混匀30次，室温静置5min，磁珠吸附至澄清，收集上清于新管中，取5μl跑电泳检测即可。
[0047]
具体在本实施例中，将上述磁珠纯化的产物作为第二轮pcr反应的模板，采用引物a对进行第二轮pcr反应。引物对a的上游引物序列如seq idno:35所示(5
’‑
acgacgtgtcgagttcaggt-3’)；引物对a的下游引物序列如seq id no:36所示(5
’‑
cagtgagtcgccacaggtca-3’)。
[0048]
具体在本实施例中，第二轮pcr反应体系：supermix(5x)5微升，引物对a 2微升，磁珠纯化的产物2微升，加入rnase free water16微升。
[0049]
第二轮pcr反应条件如下：95℃预热5min；重复1个循环；98℃变性15s；60℃退火1min；70℃延伸30s；72℃延伸30s；重复20个循环。将第二轮pcr产物进行琼脂糖电泳，简单
胶回收，获得富集后的产物。
[0050]
具体在本实施例中，将第二轮pcr富集后的产物，作为第三轮pcr(建库pcr)模板，采用引物b对进行第三轮pcr反应。引物对b的上游引物序列为：5
’‑
atcacg-3’；引物对b的下游引物序列为：5
’‑
gacgac-3’。
[0051]
具体在本实施例中，第三轮pcr反应体系：supermix 10微升，引物对b 2微升，第二轮回收产物2微升，taq enzyme 0.25微升，加入rnase freewater补足25微升。
[0052]
第三轮pcr反应条件如下：95℃预热15min；重复1个循环；98℃变性15s；65℃退火1.5min；70℃延伸2min；72℃延伸2min；重复4个循环；98℃变性15s；68℃退火45s；70℃延伸30s；72℃延伸30s；重复13个循环；72℃1min；25℃1min。第三轮pcr产物进行琼脂糖电泳,简单胶回收后，作为后续荧光定量pcr模板。
[0053]
3、测序(华南稻育种相关数量性状基因位点的检测方法)
[0054]
将上述第2部分获得的华南稻育种相关数量性状基因位点的测序片段的混合物(第三轮pcr反应产物)，构建测序文库，并进行测序分析。
[0055]
在本技术的一个具体实施方案中，构建二代测序文库，上二代测序平台(例如，roche/454flx、illumina/solexa genomeanalyzer、applied biosystems solid system)进行测序。
[0056]
具体在本实施例中，选取定量在10ng/μl的样本dna，进行片段化处理，消化引物并进行磷酸化，随后根据所选择的测序平台进行接头序列pcr反应，对产物进行磁珠纯化后获得构建的二代测序文库，qpcr测文库浓度，质检后，上二代测序平台进行测序。
[0057]
4.效果数据
[0058]
本技术发明人选取了12种不同品种的华南稻叶片进行了上述第1-3部分的操作，捕获华南稻育种相关数量性状基因位点的序列，并进行测序，以及水稻基因组分析软件分析；例如对于测序获得的原始数据采用torrent suite进行分析，主要包括信号处理、碱基召唤、pcr多克隆的剔除、测序质量评分、比对到对应水稻品种的全基因组参考序列等，再采用coverageanalysis插件分析测序深度及覆盖度等，分析结果参见下表3。
[0059]
表3
[0060]
[0061][0062]
附注：上表1中，参考1和参考2采用“日本晴”水稻种子dna与动物dna的混合物，作为抗干扰测试的参考样本；参考2的dna样本的起始量为10ng，作为低浓度对照。
[0063]
从上表1的结果可以看出，常规的12种不同品种的华南稻叶片的测序结果对于目标基因位点的捕获效率都达到了97％以上，覆盖度达到97％以上，所有目标基因位点的测序深度都达了1000倍以上。这说明，采用本发明的多重pcr引物组合能够通过单管操作一次性捕获多个华南稻育种相关数量性状基因位点，并有效避免多个位点间干扰。
[0064]
此外，采用本技术的扩增体系大大削减了现有技术的繁琐操作，降低了成本、提高了效率；具体来说，采用本技术具体实施方式第1-3部分的方法，获取测序片段、构建文库以及二代测序，整个过程制需要约6.0小时(相比现有技术的方法，从核酸到文库一般要20小时以上)，极大地提高了扩增和测序的操作效率；对于水稻育种工作者来说，能够快速、方便且低成本地获取华南稻育种相关数量性状基因位点，便于后续能够更快更准确地设计或验证育种路线，提高了育种的效率。
[0065]
应当理解，上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方式或变更均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种用于扩增华南稻育种相关数量性状基因位点的多重pcr引物组合，其特征在于，所述多重pcr引物组合包括第1～17引物对；所述第1～17引物对的上游引物序列分别如seq id no:1、seq id no:3、seq id no:5、seq id no:7、seq id no:9、seq id no:11、seq id no:13、seq id no:15、seq id no:17、seq id no:19、seq id no:21、seq id no:23、seq id no:25、seq id no:27、seq id no:29、seq id no:31、seq id no:33所示；所述第1～17引物对的下游引物序列分别如seq id no:2、seq id no:4、seq id no:6、seq id no:8、seq id no:10、seq id no:12、seq id no:14、seq id no:16、seq id no:18、seq id no:20、seq id no:22、seq id no:24、seq id no:26、seq id no:28、seq id no:30、seq id no:32、seq id no:34所示。2.如权利要求1所述的多重pcr引物组合，其特征在于，将所述第1～17引物对置于同一个引物池中进行pcr扩增。3.一种华南稻育种相关数量性状基因位点的扩增体系，其特征在于：所述扩增体系包括用于扩增的缓冲体系和如权利要求1或2所述的多重pcr引物组合。4.一种试剂盒，其特征在于：所述试剂盒所采用的引物为权利要求1或2所述的多重pcr引物组合。5.一种获取华南稻育种相关数量性状基因位点的序列的方法，其特征在于，所述方法包括以下依次进行的步骤：步骤1)提取华南稻的基因组dna；步骤2)采用如权利要求3所述的扩增体系对所述步骤1)所获得的基因组dna进行pcr扩增，并对获得的扩增产物进行纯化，得到华南稻育种相关数量性状基因位点的序列片段的混合物。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：在所述步骤2)中，采用如权利要求3所述的扩增体系对所述步骤1)所获得的基因组dna进行第一轮多重pcr反应；再对所述第一轮多重pcr反应的产物进行磁珠纯化，将所述磁珠纯化的产物作为第二轮pcr反应的模板，采用引物对a进行第二轮pcr反应；将所述第二轮pcr反应富集后的产物作为第三轮pcr反应的模板，采用引物对b进行第三轮pcr反应，获得华南稻育种相关数量性状基因位点的测序片段的混合物；所述引物对a的上游引物序列如seq id no:35所示；所述引物对a的下游引物序列如seq id no:36所示；所述引物对b的上游引物序列为atcacg；所述引物对b的下游引物序列为gacgac。7.一种华南稻育种相关数量性状基因位点的检测方法，其特征在于：所述检测方法包括采用如权利要求6所述的方法获得华南稻育种相关数量性状基因位点的测序片段的混合物，并以该混合物作为样本构建测序文库，并进行测序分析。

技术总结
本发明提供了一种扩增华南稻育种相关数量性状基因位点的多重PCR引物组合，以及采用该多重PCR引物组合的华南稻育种相关数量性状基因位点的扩增体系和试剂盒，以及采用该扩增体系获取华南稻育种相关数量性状基因位点的序列的方法和华南稻育种相关数量性状基因位点的检测方法；采用本发明的多重PCR引物组合及其扩增体系，能够通过单管操作一次性捕获多个华南稻育种相关数量性状基因位点的序列片段，直接构建测序文库并匹配现有的测序平台；特别是对于水稻育种工作者来说，能够快速、方便且低成本地获取多个华南稻育种相关数量性状基因信息，便于后续能够更快更准确地设计或验证育种路线，极大地提高了育种的效率。极大地提高了育种的效率。极大地提高了育种的效率。


技术研发人员：刘迪林 王攀 柳武革 方玉
受保护的技术使用者：上海中科荃银分子育种技术有限公司
技术研发日：2023.05.24
技术公布日：2023/7/22