一种以木糖为原料合成中长链PHA的菌株及其构建方法和应用

一种以木糖为原料合成中长链pha的菌株及其构建方法和应用
技术领域
1.本发明属于功能微生物技术领域，具体涉及一种以木糖为原料合成中长链pha的菌株及其构建方法和应用。


背景技术：

2.目前，大量塑料用于短期应用，除非有适当的废物回收与管理体系，否则所产生的废物会导致额外的环境破坏。例如，传统石化塑料所带来的残留物污染对于陆地和海洋生物的生存都产生了极大的威胁，同时由于其极难降解，对于环境和人类健康也是极大的隐患；而可降解的生物塑料则可大大减少这种危害。总之，石化塑料是不可持续的，应该开发生物基可降解塑料，以避免石化塑料造成的种种问题。
3.聚羟基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoate,pha)是一类由多种微生物生产的生物可降解高分子材料，由于其优越的物理化学性质和材料学特性，可用作包装和组织工程材料。根据单体的链长，pha可分为两类，即短链pha(scl-pha)和中长链pha(mcl-pha)。因mcl-pha独特的理化和材料特性而比scl-pha具有更广泛的应用范围。恶臭假单胞菌kt2440(p.putida kt2440)是一株生物安全的环境微生物，并且具有成熟的遗传操作系统，因而被越来越多地用作以各种生物技术为目的的外源代谢途径表达的最优底盘。而且，p.putida kt2440能够以葡萄糖、脂肪酸和甘油作为碳源生产mcl-pha。目前，mcl-pha的应用受到限制主要是因为较高的生产成本，而原材料的成本(主要是碳源)大概占其总生产成本的50％以上。通过利用价格低廉的底物，比如木质纤维素水解物中的木糖，是降低底物成本的有效手段。然而，目前还没有关于能够利用木糖生产mcl-pha的微生物菌株的报道。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种以木糖为原料合成mcl-pha的菌株及其构建方法，为降低mcl-pha生产成本提供有效手段。
5.本发明的目的还在于提供一种以木糖合成mcl-pha的生产方法，大大降低mcl-pha的生产成本，有利于推动mcl-pha的实际应用。
6.本发明提供了一种以木糖为原料合成中长链pha的菌株，以恶臭假单胞菌(pseudomonasputida)菌株为基础菌株，含有木糖代谢途径基因和磷酸戊糖途径基因组成的木糖代谢模块；
7.所述木糖代谢途径基因由木糖异构酶基因和木酮糖激酶基因组成或由木糖异构酶基因、木酮糖激酶基因和木糖转运蛋白基因组成；
8.所述磷酸戊糖途径基因包括转醛醇酶基因和转酮醇酶基因。
9.优选的，所述木糖异构酶基因的核苷酸序列如seq id no:1所示；
10.所述木酮糖激酶基因的核苷酸序列如seq id no:2所示；
11.所述木糖转运蛋白基因的核苷酸序列如seq id no:3所示；
12.所述转醛醇酶基因的核苷酸序列如seq id no:4所示；
13.所述转酮醇酶基因的核苷酸序列如seq id no:5所示。
14.优选的，所述木糖代谢模块中包含p13启动子。
15.优选的，所述恶臭假单胞菌菌株包括以下一种或几种：恶臭假单胞菌kt2440菌株和恶臭假单胞菌ktu-u27精简菌株和恶臭假单胞菌ktu-u27δgcd-p46ca菌株；
16.所述恶臭假单胞菌ktu-u27精简菌株是在恶臭假单胞菌ktu-u13菌株的基础上敲除基因组岛序列；
17.所述恶臭假单胞菌ktu-u27δgcd-p46ca菌株是在所述恶臭假单胞菌ktu-u27精简菌株的基础上敲除葡萄糖脱氢酶基因，同时用p46启动子强化pha合酶操纵子和丙酮酸脱氢酶基因的表达。
18.本发明提供了一种所述以木糖为原料合成中长链pha的菌株的构建方法，包括以木糖为原料合成中长链pha的菌株的构建方法；
19.所述以木糖为原料合成中长链pha的菌株的构建方法，以下步骤：
20.1)构建含由木糖异构酶基因和木酮糖激酶基因组成的木糖代谢基因或由木糖异构酶基因、木酮糖激酶基因和木糖转运蛋白基因组成的木糖代谢基因的重组质粒；
21.2)将步骤1)中重组质粒转入恶臭假单胞菌菌株中，形成重组菌株；
22.3)将磷酸戊糖途径基因整合至所述重组菌株的基因组中，得到以木糖为原料合成中长链pha的菌株；
23.优选的，步骤1)中，构建方法为用引物y-uf、y-ur及y-df、y-dr扩增出基因组插入位点上下游同源臂up和dn，利用同源重组的方法将插入片段y及上下游同源臂同时整合到自杀质粒pku的ecor i位点，构建得到基因片段插入载体pku-y；
24.所述插入片段y为由木糖异构酶基因和木酮糖激酶基因组成木糖代谢基因、由木糖异构酶基因、木酮糖激酶基因和木糖转运蛋白基因组成的木糖代谢基因。
25.优选的，当所述插入片段y为由木糖异构酶基因和木酮糖激酶基因组成的木糖代谢基因时，所述插入片段y由seq id no:1和seq id no:2组成；
26.所述插入片段y为由木糖异构酶基因、木酮糖激酶基因和木糖转运蛋白基因组成的木糖代谢基因时，所述插入片段y由seq id no:1，seq id no:2和seq id no:3组成；
27.本发明提供了所述菌株在以木糖为碳源发酵生产中长链pha中的应用。
28.本发明提供了一种以木糖为碳源发酵生产中长链pha的方法，包括以下步骤：
29.将所述菌株经过驯化培养，接种至以木糖为碳源的发酵培养基中，经好氧发酵，得到中长链pha；
30.所述驯化培养，先将所述菌株接种入驯化培养基中培养，所得菌液再次接入发酵培养基中培养；
31.所述驯化培养培养基为17.11g/lna2hpo4·
12h2o、3.0g/lkh2po4、1.0g/lnh4cl、0.5g/lnacl、1μl/l微量元素液、碳源和104.4g/lmgso4，ph值为7.0～7.2；所述微量元素液包括以下含量成分：0.1mol/l hcl、9.7g fecl3、7.8g cacl2、0.218g cocl2·
6h2o、0.156g cuso4·
5h2o、0.118g nicl2、0.105g crcl3·
6h2o；木糖的浓度为10g/l；
32.所述发酵培养基为17.11g/lna2hpo4·
12h2o、3.0g/l kh2po4、1.0g/lnh4cl、0.5g/lnacl、1μl/l微量元素液、碳源和104.4g/lmgso4，ph值为7.0～7.2；所述微量元素液包括以
下含量成分：0.1mol/l hcl、9.7g fecl3、7.8g cacl2、0.218g cocl2·
6h2o、0.156g cuso4·
5h2o、0.118g nicl2、0.105g crcl3·
6h2o；木糖的浓度为20g/l。
33.本发明提供的以木糖为原料合成中长链pha的菌株，是以恶臭假单胞菌菌株为基础菌株，利用基因工程手段构建含有木糖代谢途径基因和磷酸戊糖途径基因组成的木糖代谢模块的工程菌株。本发明构建的菌株能够以木糖为碳源发酵生产中长链pha，较以葡萄糖、脂肪酸和甘油为碳源生产中长链pha而言，能够大大降低中长链pha的生产成本，有利于在中长链pha生产企业推广应用。
34.进一步的，本发明具体限定了作为基础菌株的恶臭假单胞菌菌株包括以下一种或几种：恶臭假单胞菌kt2440菌株和恶臭假单胞菌ktu-u27精简菌株和恶臭假单胞菌ktu-u27δgcd-p46ca菌株。实验证明，与原始菌株(恶臭假单胞菌ktu-u13菌株)相比，恶臭假单胞菌ktu-u27精简菌株能够极大提高中长链pha的产量。
35.本发明提供了一种以木糖为碳源发酵生产中长链pha的方法，解决了目前工业生产菌株不能以木糖为碳源生产mcl-pha的技术问题，为解决生产mcl-pha过高成本提供有效手段。
附图说明
36.图1为以木糖为原料合成中长链pha代谢途径示意图；
37.图2为木糖代谢基因xylab和xylabe功能验证结果，其中a为xylab表达载体的构建，以表达质粒pbbr1-mcs-2的自身启动子plac作为xylab的启动子；b为xylabe表达载体的构建，以表达质粒bbr1-mcs-2的自身启动子plac作为xylabe的启动子；c为ktu、ktu-pbbr-xylab以及ktu-pbbr-xylabe第一代转接至驯化培养基中的生长曲线和木糖残糖量；d为ktu，ktu-pbbr-xylab以及ktu-pbbr-xylabe完成适应性实验室进化的生长曲线和木糖残糖量；
38.图3为基因片段插入载体构建示意图；
39.图4为基因片段敲除载体构建示意图；
40.图5为基因组精简菌株ktu-u27的构建；a为kt2440染色体上10个gis的物理位置；b为pcr检测鉴定基因组精简菌株ktu-u27结果，其中m：dnamarker；1：ktu为模板；2：p.putida突变株作为模板；3：以ddh2o为模板；所用引物为筛选双交换菌株的引物；
41.图6为木糖代谢工程菌株ktu-p13-xylabe-ptac-tt、27-p13-xylabe-ptac-tt和27a-p13-xylabe-ptac-tt摇瓶发酵结果，其中cdw为细胞干重，phayield为pha产量与细胞干重之比；所有木糖代谢工程菌株在20g/l木糖发酵培养基中30℃，180rpm发酵培养84h；
42.图7为gc定性木糖代谢工程菌株生产pha的单体组成结果；根据各个标准品在gc的保留时间，确定木糖代谢工程菌株生产pha的各个单体组成；c6：3-羟基己酸；c8:3-羟基辛酸；c10:3-羟基癸酸；c12:3-羟基月桂酸；c14:3-羟基十四烷酸。
具体实施方式
43.本发明提供了一种以木糖为原料合成中长链pha的菌株，以恶臭假单胞菌菌株为基础菌株，含有木糖代谢途径基因和磷酸戊糖途径基因组成的木糖代谢模块；
44.所述木糖代谢途径基因由木糖异构酶基因和木酮糖激酶基因组成或由木糖异构
酶基因、木酮糖激酶基因和木糖转运蛋白基因组成；
45.所述磷酸戊糖途径基因包括转醛醇酶基因和转酮醇酶基因。
46.在本发明中，所述恶臭假单胞菌菌株包括以下一种或几种：恶臭假单胞菌kt2440菌株和恶臭假单胞菌ktu-u27精简菌株和恶臭假单胞菌ktu-u27δgcd-p46ca菌株。所述恶臭假单胞菌kt2440菌株为现有技术
1.报道的菌株。
47.在本发明中，所述恶臭假单胞菌ktu-u27精简菌株是在恶臭假单胞菌ktu-u13菌株的基础上敲除基因组岛(gis)序列。所述恶臭假单胞菌ktu-u13菌株为现有技术
2.报道的菌株。所述恶臭假单胞菌ktu-u27精简菌株的构建方法，优选构建gis敲除载体，将所述gis敲除载体转入p.putida ktu-u13菌株中，经筛选培养和鉴定，得到ktu-u27精简菌株。所述构建gis敲除载体的方法，优选用引物x-uf、x-ur及x-df、x-dr扩增出ktu-u13基因组中gis的上下游同源臂up和dn，接着通过同源重组的方法将上下游同源臂同时整合到自杀质粒pku的ecor i位点，构建得到基因敲除载体pku-δx。在本发明实施例中，所述自杀质粒pku是本实验室保藏并构建的质粒。所述同源重组的方法优选使用sparkjade公司生产的无缝克隆试剂盒完成。所述筛选培养优选以卡那霉素(kan)和5-氟尿嘧啶(5-fu)作为筛选标记进行筛选培养。所述鉴定，优选采用pcr扩增和dna测序完成。所述pcr扩增用筛选双交换的引物x-yf和x-yr检测，经鉴定得到基因组精简菌株ktu-u27。通过基因组精简，进一步增强代谢模块中目的基因的表达，从而有利于进一步提高mcl-pha产量。
48.在本发明中，为了进一步增强基因组精简菌株ktu-u27合成mcl-pha的能力，本发明敲除葡萄糖脱氢酶(gcd)基因，使碳源更多地流向mcl-pha的合成来进一步增加其产量；另外，利用p.putida kt2440的内源强启动子p46强化pha合酶(phac)操纵子和丙酮酸脱氢酶(acoa)基因的表达，进而提高pha的合成能力，得到所述恶臭假单胞菌ktu-u27δgcd-p46ca菌株，具体构建方法，优选为以上所述的同源重组结合自杀质粒pku建立的无痕基因编辑方法来实现目的基因的敲除以及强启动子的插入。
49.在本发明中，木糖代谢模块包括木糖代谢途径基因和磷酸戊糖途径基因。所述木糖代谢途径基因中，所述木糖异构酶基因的核苷酸序列优选如seq id no:1所示，所述木酮糖激酶基因的核苷酸序列优选如seq id no:2所示，所述木糖转运蛋白基因的核苷酸序列优选如seq id no:3所示，来源于大肠杆菌(escherichia coli)mg1655菌株。实验证明，由木糖异构酶基因、木酮糖激酶基因和木糖转运蛋白基因组成木糖代谢途径基因比由木糖异构酶基因和木酮糖激酶基因组成木糖代谢途径基因使重组菌株更加能快速利用木糖，但是就中长链pha产量而言，两者没有显著差异。所述磷酸戊糖途径基因包括转醛醇酶基因和转酮醇酶基因。所述转醛醇酶基因的核苷酸序列优选如seq id no:4所示。所述转酮醇酶基因的核苷酸序列优选如seq id no:5所示。所述木糖代谢模块中，包含启动子启动木糖代谢途径基因的表达。所述启动子包括plac启动子或强启动子p13。所述p13的核苷酸序列如seq id no:6所示。所述plac启动子的核苷酸序列如seq id no:7所示。所述p13为p.putida ktu菌株内源强启动子，有利于进一步增强目标基因的表达水平。p.putida利用磷酸戊糖途径用于生物合成而不是分解代谢，因此提高磷酸戊糖途径的表达量可以提高工程菌株在木糖中的生长。所述磷酸戊糖途径基因优选采用ptac启动子进行启动表达。所述ptac启动子的核苷酸序列如seq id no:8所示。
50.本发明提供了一种所述以木糖为原料合成中长链pha的菌株的构建方法，包括以
木糖为原料合成中长链pha的菌株的构建方法。
51.在本发明中，所述以木糖为原料合成中长链pha的菌株的构建方法，包括以下步骤：
52.1)构建含由木糖异构酶基因和木酮糖激酶基因组成的木糖代谢基因或由木糖异构酶基因、木酮糖激酶基因和木糖转运蛋白基因组成的木糖代谢基因的重组质粒；
53.2)将步骤1)中重组质粒转入恶臭假单胞菌菌株中，形成重组菌株；
54.3)将木糖代谢基因以及磷酸戊糖途径基因整合至p.putida基因组中，得到以木糖为原料合成中长链pha的菌株。
55.在本发明中，所述重组质粒的构建方法，优选为将由木糖异构酶基因和木酮糖激酶基因组成的木糖代谢基因(xylab基因)或由木糖异构酶基因、木酮糖激酶基因和木糖转运蛋白基因组成的木糖代谢基因(xylabe)连接至自杀质粒pku中，经过验证，得到重组质粒。所述自杀质粒pku优选为携带upp基因pk18mobsacb。所述连接的方法优选用引物y-uf、y-ur及y-df、y-dr扩增出基因组插入位点上下游同源臂up和dn，利用同源重组的方法将插入片段y及上下游同源臂同时整合到自杀质粒pku的ecor i位点，构建得到基因片段插入载体pku-y；所述插入片段y为由木糖异构酶基因和木酮糖激酶基因组成木糖代谢基因、由木糖异构酶基因、木酮糖激酶基因和木糖转运蛋白基因组成的木糖代谢基因。当所述插入片段y为由木糖异构酶基因和木酮糖激酶基因组成的木糖代谢基因时，所述插入片段y由seq id no:1和seq id no:2组成；所述插入片段y为由木糖异构酶基因、木酮糖激酶基因和木糖转运蛋白基因组成的木糖代谢基因时，所述插入片段y由seq id no:1，seq id no:2和seq id no:3组成。
56.在本发明中，将所述重组质粒转入恶臭假单胞菌菌株中的方法，优选基于在p.putida ktu中建立的自杀质粒pku结合upp反向筛选标记的无痕基因编辑方法
3.完成。
57.在本发明中，当含有p13启动子时，优选在重组质粒转入恶臭假单胞菌菌株后，利用无痕基因编辑方法将p13启动子插入到木糖代谢基因前面，从而替换plac启动子。
58.在本发明中，将磷酸戊糖途径基因整合入所述重组菌株中的方法优选与上述无痕基因编辑方法相同，在此不做赘述。
59.本发明提供了一种以木糖为碳源发酵生产中长链pha的方法，包括以下步骤：
60.将所述菌株经过驯化培养，接种至以木糖为碳源的发酵培养基中，经好氧发酵，得到中长链pha。
61.在本发明中，所述驯化培养，是先将所述菌株接种入驯化培养基中培养，所得菌液再次接入发酵培养基中培养。所述驯化培养培养基为17.11g/lna2hpo4·
12h2o、3.0g/l kh2po4、1.0g/lnh4cl、0.5g/lnacl、1μl/l微量元素液、5～10g/l碳源和104.4g/lmgso4，ph值为7.0～7.2；其中微量元素液包括以下含量成分：0.1mol/l hcl、9.7g fecl3、7.8g cacl2、0.218gcocl2·
6h2o、0.156g cuso4·
5h2o、0.118gnicl2、0.105g crcl3·
6h2o；所述碳源为木糖，木糖的浓度优选为10g/l。所述发酵培养基的配方与驯化培养基略有不同，木糖的浓度优选为20g/l。在所述驯化培养时，在观察到有明显菌种生长迹象时，再分别转接至驯化培养基中继续驯化，直至每代之间的生长延滞期几乎保持一致即完成适应性实验室进化。在本发明实施例中，要完成适应性实验室进化优选在驯化培养基中培养5～10次。
62.在本发明中，所述好氧发酵的方法，优选为采用摇瓶发酵培养时，以1％的接种量
接种至发酵培养基后，在30℃，180r/min条件下发酵84h。
63.在本发明中，生产的中长链pha采用gc-ms检测方法和定量分析，结果表明，以木糖为碳源的菌株生产的中长链pha，单体包括3-羟基己酸、3-羟基辛酸、3-羟基癸酸、3-羟基月桂酸和3-羟基十四烷酸。
64.下面结合实施例对本发明提供的一种以木糖为原料合成中长链pha的菌株及其构建方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
65.实施例1
66.木糖代谢基因的功能验证
67.以大肠杆菌(escherichia coli)mg1655为模板，以seq id no:11-seq id no:14所述引物，并以如下所述的基因pcr扩增体系及反应条件克隆得到木糖异构酶(xyla)基因，木酮糖激酶(xylb)基因以及木糖转运蛋白(xyle)基因，将xyla和xylb基因(xylab基因)以及将xyla、xylb基因和xyle基因(即xylabe)分别连接至表达质粒pbbr1mcs-2的hindiii位点，启动子为质粒自身启动子plac，得到表达质粒pbbr1-plac-xylab和pbbr1-plac-xylabe，具体方法如下：大肠杆菌(escherichia coli)mg1655的dna为模板，进行pcr扩增，扩增体系使用vazyme高保真聚合酶系列对目的片段进行扩增。得到各基因片段。
68.各基因的pcr扩增引物如表1所示。
69.表1各基因的pcr扩增引物
[0070][0071]
pcr体系如下：
[0072][0073]
pcr反应条件：
[0074]
[0075][0076]
通过pcr扩增所得到的dna片段使用aidlab公司的琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒进行回收，回收的片段与线性化质粒连接，采用同源重组的方法将线性化的载体和两端具有16bp～25bp重叠区域的pcr片段定向重组连接，该过程可以实现多个片段的高效无缝克隆。连接体系共10μl体系以化转的方法全部转入e.coli trans1-t1商业化感受态中，转化完成后涂布于含有相应抗性的lb平板上，37℃恒温培养箱中过夜培养。在平板上挑取单菌落于含有相应抗性的lb液体培养基中，37℃，180r/min复苏3h后进行菌液pcr鉴定阳性克隆转化子。
[0077]
pcr体系如下：
[0078][0079]
菌液pcr反应条件：
[0080][0081]
通过0.8％琼脂糖凝胶电泳来检测pcr条带大小，将条带大小正确的克隆子转接到含有相应抗性的5ml lb液体培养基中，37℃，180r/min过夜培养。通过质粒提取进行进一步的测序验证。
[0082]
将验证正确的两个重组载体pbbr1-plac-xylab和pbbr1-plac-xylabe分别转入p.putida ktu(p.putida kt2440δupp)中，得到ktu-plac-xylab和ktu-plac-xylabe，采用以下方法验证基因功能。具体方法如下：
[0083]
以p.putida ktu为对照，分别将ktu-plac-xylab和ktu-plac-xylabe经过菌种活化接种于发酵培养基中发酵的方法，同时还设置一组进行适应性实验室进化方法处理后再进行发酵培养基中发酵的方法。其中适应性实验室进化方法具体如下：
[0084]
将p.putida ktu、ktu-plac-xylab和ktu-plac-xylabe三种菌株分别划线lb固体平板，挑单菌至5ml lb试管，30℃，180r/min过夜培养，5ml菌液5000r/min，4℃离心10min，弃上清，用pbs缓冲液重悬并5000r/min，4℃离心10min，弃上清，最终用1mlpbs缓冲液重悬菌体，并转入木糖的100ml驯化培养基中；第二代转接时，取20ml第一代驯化培养基中的菌液5000r/min，4℃离心10min，弃上清，用1mlpbs缓冲液重悬菌体，并将其继续转入木糖的100ml驯化培养基中继续驯化；驯化培养基(1l)：17.11g na2hpo412h2o，3.0g kh2po4，1.0g nh4cl，0.5g nacl，调节ph值至7.0～7.2，121℃高压蒸汽灭菌20min。微量元素液、木糖与mgso4配成母液灭菌后加入。微量元素液(1l)：0.1mol/l hcl，9.7g fecl3，7.8g cacl2，0.218g cocl2·
6h2o，0.156g cuso4·
5h2o，0.118g nicl2，0.105g crcl3·
6h2o，0.22μm滤膜过滤除菌，在驯化培养基中终浓度为1μl/ml；木糖母液：母液浓度为500g/l，取50g木糖，加入蒸馏水定容至100ml，115℃高压蒸汽灭菌30min，在驯化培养基中，木糖工作浓度为10g/l；mgso4母液：取5.22g mgso4，加入蒸馏水定容至50ml，121℃高压蒸汽灭菌20min，在驯化培养基中终浓度为104.4μg/ml；pbs缓冲液(1l)：8.0g nacl和3.58gna2hpo4·
12h2o、0.272g kh2po4、0.2g kcl，调节ph值约为7.4，121℃高压蒸汽灭菌20min。按照上述方法连续在驯化培养基中转接，直至每一代在驯化培养基中的生长延滞期几乎保持一致，即完成适应性实验室驯化。p.putida ktu、ktu-plac-xylab和ktu-plac-xylabe在木糖中的生长曲线和木糖消耗曲线如图2。
[0085]
实施例2
[0086]
一种以木糖为碳源的ktu-p13-xylabe-ptac-talb-tkta工程菌的构建方法
[0087]
1.木糖代谢基因整合至p.putida ktu基因组：将xylabe基因连接至自杀质粒pku(pk18mobsacb携带upp基因)(见图3)，用引物xylabe-uf、xylabe-ur及xylabe-df、xylabe-dr扩增出基因组插入位点上下游同源臂up和dn，接着通过同源重组的方法将待插入片段xylabe及上下游同源臂同时整合到线性化自杀质粒pku的ecor i位点，构建得到基因片段插入载体pku-plac-xylabe。基于在p.putida ktu中建立的自杀质粒pku结合upp反向筛选标记的无痕基因编辑方法，将pku-plac-xylabe转入p.putida ktu中，从而将plac-xylabe整合至p.putida ktu基因组中，即ktu-plac-xylabe；
[0088]
表2各基因的pcr扩增引物
[0089][0090]
2.更换强启动子p13：利用p.putida ktu内源强启动子p13，将强启动子p13替换
xylabe基因前的plac启动子即ktu-p13-xylabe，从而增强xylabe基因的表达水平；
[0091]
3.磷酸戊糖途径整合至基因组中：由金斯瑞生物公司合成转醛醇酶(talb)基因和转酮醇酶(tkta)基因，将磷酸戊糖途径ptac-talb-tkta以基于在p.putida ktu中建立的自杀质粒pku结合upp反向筛选标记的无痕基因编辑方法整合至p.putida ktu-p13-xylabe基因组中，即ktu-p13-xylabe-ptac-talb-tkta。
[0092]
实施例3
[0093]
一种以木糖为碳源的27-p13-xylabe-ptac-talb-tkta工程菌的构建方法
[0094]
1.ktu-u27菌株的构建方法
[0095]
精简菌株p.putida ktu-u13作为出发菌株进行基因组的进一步精简，将待敲除的基因组岛(gis)序列的上下同源臂连接至自杀质粒pku从而构建敲除基因组岛质粒pku-ux(见图4)；随后将pku-ux敲除质粒以电转的方法转入p.putida ktu-u13菌株中；最后分别以卡那霉素(kan)和5-氟尿嘧啶(5-fu)作为筛选标记，进行单双交换的筛选和鉴定，得到的突变株通过pcr检测和dna测序验证；具体如下：首先用引物x-uf、x-ur及x-df、x-dr扩增出基因组中gis序列的上下游同源臂up和dn，再通过同源重组的方法将上下游同源臂同时整合到线性化的自杀质粒pku的ecor i位点，构建得到基因敲除载体pku-δx。其中，敲除的基因x为基因组岛(gis)序列。其中自杀质粒pku的线性化采用ecor i酶切处理，酶切体系如下。
[0096][0097]
上述酶切体系吹打混匀后37℃金属浴孵育45min。
[0098]
将上述构建的pku-δx敲除质粒以电转的方法转入ktu-u13菌株中；将成功构建的敲除载体以电转的形式转入ktu-u13菌株中，ktu-u13菌株的电转感受态制备以及具体电转条件如下：
[0099]
①
将保存在-80℃甘油管中的ktu-u13及其衍生菌株在固体lb平板上划线活化，30℃过夜培养；
[0100]
②
在平板上挑取单菌落于含有5-fu抗性的5ml lb液体试管中，30℃，180r/min振荡过夜培养；
[0101]
③
将上步菌液以1％的接种量转接到含有5-fu抗性的100ml的lb液体培养基中，30℃，180r/min振荡培养3h至od
600
为0.6左右；
[0102]
④
将上步菌液立即放置冰上预20min，同时将已灭菌的电转缓冲液(3mmol/l hepes)、50ml离心管与电转杯也放置冰上预冷；
[0103]
⑤
在无菌条件下，将预冷后的菌液转移到50ml离心管中，4℃，5000r/min离心10min，弃去培养基，保留菌体；
[0104]
⑥
向离心管中加入适量已预冷的hepes重悬菌体，混匀后4℃，5000r/min离心10min，弃去上清，保留菌体；
[0105]
⑦
重复步骤
⑥
的操作；
[0106]
⑧
取1ml hepes对菌体进行重悬，混匀后吸取100μl菌液到已灭菌的1.5ml离心管
中完成p.putida感受态的制备，放置冰上备用；
[0107]
⑨
加入5μl～10μl需转化的质粒到刚制备好的感受态细胞中，用移液器吹打混匀后全部吸出转移到已预冷的电转杯中；
[0108]
⑩
将电转杯外壁擦干放置到电转仪中进行电转化，条件为：电压1200v，电阻200ω，电击时间5ms；
[0109]
电转化完成后，立即向电转杯中加入1ml的lb培养基重悬，混匀后全部吸出转移到一个新的1.5ml离心管中，30℃，180r/min复苏2h；
[0110]
复苏培养后5000r/min离心5min，弃去上清，留约100μl培养基重悬后涂布于相应抗性的lb固体平板上，30℃过夜培养。电转化完成后，阳性转化子通过pcr验证。
[0111]
最后分别以卡那霉素(kan)和5-氟尿嘧啶(5-fu)作为筛选标记，进行单双交换的筛选和鉴定，得到的突变株通过实施例1中所述的菌液pcr反应体系及条件进行pcr检测，并dna测序验证正确。
[0112]
表3各基因的pcr扩增引物
[0113][0116]
[0117]
结果见图5。得到了预期精简基因组的ktu-u27菌株。
[0118]
2.工程菌的构建方法
[0119]
按照实施例2的方法将木糖代谢基因整合至ktu-u27菌株基因组中，更换强启动子p13，将磷酸戊糖途径整合至基因组中，得到27-p13-xylabe-ptac-tt工程菌。
[0120]
实施例4
[0121]
一种以木糖为碳源的27a-p13-xylabe-ptac-tt工程菌的构建方法
[0122]
1.高产pha菌株ktu-u27δgcd-p46ca的构建方法
[0123]
以实施例3构建的ktu-u27菌株为出发菌株，敲除葡萄糖脱氢酶(gcd)基因，利用p.putida kt2440的内源强启动子p46强化pha合酶(phac)操纵子和丙酮酸脱氢酶(acoa)基因的表达，具体方法与实施例1中所述的无痕基因编辑方法一致。
[0124]
表4各基因的pcr扩增引物
[0125][0126][0127]
2.工程菌的构建方法
[0128]
按照实施例2的方法将木糖代谢基因整合至ktu-u27δgcd-p46ca菌株基因组中，更换强启动子p13，将磷酸戊糖途径整合至基因组中，得到27a-p13-xylabe-ptac-tt工程菌。
[0129]
实施例5
[0130]
pha含量测定与单体鉴定
[0131]
将实施例2～3构建的工程菌进行摇瓶发酵，所述摇瓶发酵的方法同实施例1记载。
[0132]
木糖代谢工程菌株ktu-p13-xylabe-ptac-tt，27-p13-xylabe-ptac-tt和27a-p13-xylabe-ptac-tt摇瓶发酵结果见图6。木糖代谢工程菌株在20g/l木糖发酵培养基中30℃，180rpm发酵培养84h发酵生产pha；其中ktu-p13-xylabe-ptac-tt的细胞干重(cdw)和pha产率(pha产量与细胞干重之比)分别为1.63g/l和4.23wt％；27-p13-xylabe-ptac-tt的细胞干重和pha产率分别达到了1.84g/l和8.73wt％，和ktu-p13-xylabe-ptac-tt分别提高了12.88％和106.38wt％，这也进一步证明了ktu-u27作为底盘的优越性；27a-p13-xylabe-ptac-tt的细胞干重和pha产率分别达到了3.87g/l和41.67wt％，和27-p13-xylabe-ptac-tt相比分别提高了110.33％和377.32％，这证明了敲除葡萄糖脱氢酶并增强pha合成酶和丙酮酸脱氢酶可以大大提高木糖代谢工程菌株在其发酵培养基中生产pha的能力，为降低pha生产成本提供了坚实基础。
[0133]
实施例6
[0134]
实施例2～4构建的工程菌经适应性实验室驯化和摇瓶发酵制备的中长链pha单体
组成及含量测定
[0135]
通过气相色谱质谱联用(gc-ms)测定mcl-pha的单体组成及含量。样品制备具体步骤：称取100mg细胞干重溶于4ml氯仿中，充分溶解后加入4ml酯化液(酯化液中甲醇与浓硫酸的比例为1.7:0.3，并加入1g/l的苯甲酸标准品作为内参)混匀。将上步混合液放入密闭的酯化管中，100℃水浴锅中酯化4h。酯化管冷却后加入4ml超纯水充分萃取浓硫酸，静置分层后，取底层氯仿相进行gc-ms检测进行定性和定量。gc-ms检测条件：使用hp-5毛细管柱，载气为氦气(流速1.0555ml/min)，进样口温度250℃，传输管温度280℃，进样量0.8μl，采用分流模式(分流比50:1)。柱温80℃开始，停留1min，然后以10℃/min的速率升温至250℃后，停留3min。柱压10psi开始，停留1.5min，然后以2.5psi/min升至20psi，停留1.5min。
[0136]
标准品测定：用不同的3-羟基脂肪酸甲酯标准品配制一定浓度的标准溶液(加入与样品中苯甲酸相同物质的量浓度的苯甲酸甲酯标准品作为内参)，通过相同的gc-ms条件进行检测。
[0137]
内标法(苯甲酸甲酯)对所测pha进行定量分析，根据峰面积进行定量计算。pha含量的定义为样品中pha的质量对取样样品细胞重量的比值，pha产量为细胞干重与pha含量的乘积。pha含量(wt％)＝(s样品峰/s苯甲酸峰/s标准品峰/s苯甲酸峰)
×
4ml/g样品。
[0138]
表5为木糖工程菌株发酵生产pha的产量和单体组成含量；
[0139][0140]
结果见图7和表5。由可知，木糖代谢工程菌株生产pha的单体组成为3-羟基己酸、3-羟基辛酸、3-羟基癸酸、3-羟基月桂酸和3-羟基十四烷酸。ktu-p13-xylabe-ptac-tt，27-p13-xylabe-ptac-tt和27a-p13-xylabe-ptac-tt在20g/l木糖发酵培养基中30℃，180rpm发酵培养84h，最终得到的pha与内标苯甲酸甲酯通过相同的gc-ms条件检测定量各个单体含量，全部的木糖代谢工程菌株生产得到的pha的主要单体都是3-羟基辛酸、3-羟基癸酸和3-羟基月桂酸，单体含量分别为9-21mol％，54-66mol％和14-25mol％。
[0141]
参考文献：
[0142]
[1]liu hong,cheny,zhangy,et al.enhancedproduction ofpolyhydrox-yalkan-oates in pseudomonas putida kt2440 by a combination of genome streamling and promoter engineering[j].international journal of biological macromolecules,2022,209(pta):117-124.
[0143]
[2]liang pei,zhang y,xu b,et al.deletion of genomic islands in the pseudomonasputida kt2440 genome can create an optimal chassis for synthetic biology applications[j].microbial cell factories,2020,19(1):70.
[0144]
[3]gong ting,liu rui,zuo zhen,et al.metabolic engineering of pseudomonas putida kt2440 for complete mineralization of methyl parathion and
γ-hexachlor ocyclohexane[j],acs synthetic biology,2016,5(5):434-42.
[0145]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种以木糖为原料合成中长链pha的菌株，其特征在于，以恶臭假单胞菌(pseudomonasputida)菌株为基础菌株，含有木糖代谢途径基因和磷酸戊糖途径基因组成的木糖代谢模块；所述木糖代谢途径基因由木糖异构酶基因和木酮糖激酶基因组成或由木糖异构酶基因、木酮糖激酶基因和木糖转运蛋白基因组成；所述磷酸戊糖途径基因包括转醛醇酶基因和转酮醇酶基因。2.根据权利要求1所述以木糖为原料合成中长链pha的菌株，其特征在于，所述木糖异构酶基因的核苷酸序列如seq id no:1所示；所述木酮糖激酶基因的核苷酸序列如seq id no:2所示；所述木糖转运蛋白基因的核苷酸序列如seq id no:3所示；所述转醛醇酶基因的核苷酸序列如seq id no:4所示；所述转酮醇酶基因的核苷酸序列如seq id no:5所示。3.根据权利要求1所述以木糖为原料合成中长链pha的菌株，其特征在于，所述木糖代谢模块包含p13启动子。4.根据权利要求1～3任意一项所述以木糖为原料合成中长链pha的菌株，其特征在于，所述恶臭假单胞菌菌株包括以下一种或几种：恶臭假单胞菌kt2440菌株和恶臭假单胞菌ktu-u27精简菌株和恶臭假单胞菌ktu-u27δgcd-p46ca菌株；所述恶臭假单胞菌ktu-u27精简菌株是在恶臭假单胞菌ktu-u13菌株的基础上敲除基因组岛序列；所述恶臭假单胞菌ktu-u27δgcd-p46ca菌株是在所述恶臭假单胞菌ktu-u27精简菌株的基础上敲除葡萄糖脱氢酶基因，同时用p46启动子强化pha合酶操纵子和丙酮酸脱氢酶基因的表达。5.一种权利要求1～4任意一项所述以木糖为原料合成中长链pha的菌株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：1)构建含由木糖异构酶基因和木酮糖激酶基因组成的木糖代谢基因或由木糖异构酶基因、木酮糖激酶基因和木糖转运蛋白基因组成的木糖代谢基因的重组质粒；2)将步骤1)中重组质粒转入恶臭假单胞菌菌株中，形成重组菌株；3)将磷酸戊糖途径基因整合至所述重组菌株的基因组中，得到以木糖为原料合成中长链pha的菌株。6.根据权利要求5所述构建方法，其特征在于，步骤1)中，所述构建的方法为用引物y-uf、y-ur及y-df、y-dr扩增出基因组插入位点上下游同源臂up和dn，利用同源重组的方法将插入片段y及上下游同源臂同时整合到自杀质粒pku的ecor i位点，构建得到基因片段插入载体pku-y；所述插入片段y为由木糖异构酶基因和木酮糖激酶基因组成木糖代谢基因或由木糖异构酶基因、木酮糖激酶基因和木糖转运蛋白基因组成的木糖代谢基因。7.根据权利要求6所述构建方法，其特征在于，当所述插入片段y为由木糖异构酶基因和木酮糖激酶基因组成的木糖代谢基因时，所述插入片段y由seq id no:1和seq id no:2组成；所述插入片段y为由木糖异构酶基因、木酮糖激酶基因和木糖转运蛋白基因组成的木
糖代谢基因时，所述插入片段y由seq id no:1，seq id no:2和seq id no:3组成。8.权利要求1～4任意一项所述菌株在以木糖为碳源发酵生产中长链pha中的应用。9.一种以木糖为碳源发酵生产中长链pha的方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求1～4任意一项所述菌株经过驯化培养，接种至以木糖为碳源的发酵培养基中，经好氧发酵，得到中长链pha。10.根据权利要求9所述方法，其特征在于，所述驯化培养，先将所述菌株接种入驯化培养基中培养，所得菌液再次接入发酵培养基中培养；所述驯化培养培养基为17.11g/lna2hpo4·
12h2o、3.0g/lkh2po4、1.0g/lnh4cl、0.5g/lnacl、1μl/l微量元素液、碳源和104.4g/lmgso4，ph值为7.0～7.2；所述微量元素液包括以下含量成分：0.1mol/l hcl、9.7g fecl3、7.8g cacl2、0.218g cocl2·
6h2o、0.156g cuso4·
5h2o、0.118g nicl2、0.105g crcl3·
6h2o；木糖的浓度为10g/l；所述发酵培养基为17.11g/lna2hpo4·
12h2o、3.0g/l kh2po4、1.0g/lnh4cl、0.5g/lnacl、1μl/l微量元素液、碳源和104.4g/lmgso4，ph值为7.0～7.2；所述微量元素液包括以下含量成分：0.1mol/l hcl、9.7g fecl3、7.8g cacl2、0.218g cocl2·
6h2o、0.156g cuso4·
5h2o、0.118g nicl2、0.105g crcl3·
6h2o；木糖的浓度为20g/l。

技术总结
本发明提供了一种以木糖为原料合成中长链PHA的菌株及其构建方法和应用，属于功能微生物技术领域。本发明构建以木糖为原料合成中长链PHA(mcl-PHA)菌株，解决了目前恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)不能利用木糖生产mcl-PHA的技术问题，并结合基因组精简菌株KTU-U27和高产mcl-PHA菌株KTU-U27Δgcd-P46CA，进一步提高生产PHA的能力，从而为解决生产PHA过高的底物成本提供有效手段。生产PHA过高的底物成本提供有效手段。生产PHA过高的底物成本提供有效手段。


技术研发人员：王淑芳 杨超 刘红露
受保护的技术使用者：南开大学
技术研发日：2023.05.22
技术公布日：2023/7/22