近红外光控的DNA纳米平台复合材料、制备方法及在高纯度提取外泌体中的应用

近红外光控的dna纳米平台复合材料、制备方法及在高纯度提取外泌体中的应用
技术领域
1.本发明属于外泌体分离技术领域，尤其涉及到一种近红外光控的dna纳米平台复合材料、制备方法及在高纯度提取外泌体中的应用。


背景技术：

2.干细胞是一类可以分化为体内多种类型、并且可以无限分裂和繁殖的多潜能细胞。近几年，临床表明干细胞有很多医学用途。从理论上讲，可以使用干细胞或它们的衍生物来修复体内任何因疾病或受伤而损失或损伤的组织。
3.干细胞外泌体是干细胞分泌的细胞外囊泡，并且越来越多的研究表明，干细胞外泌体与干细胞具有相似的生物学性能，但干细胞外泌体更加安全稳定高效，具有更强的信号分子转运和调控能力，主要原因归因于外泌体体积小，约30～100nm，属于纳米等级，易被机体吸收利用；并且外泌体不是细胞，易保存，不怕“异体移植”，为无细胞移植治疗的情况下实现组织再生、组织修复提供新策略、新方法。
4.尽管干细胞外泌体有如此多的优势，如何实现高纯度的捕获和分离外泌体仍然是一个挑战。现阶段，最常用的外泌体分离技术是差速离心，但此方法所需离心力较大(100,000g或更大)，费用昂贵且耗时长，最重要的其不能分离大小和密度相似的囊泡亚群。其次，一些其他外泌体的提取方式，例如，差速离心、聚合物聚沉等，大都修要一些外源试剂的添加，后续分离纯化困难。最近，通过生物大分子捕获外泌体成为一种可能，例如通过免疫分离技术分离外泌体，但也伴随着不能实现外泌体的可逆的释放，材料利用率低的缺点。因此，如何在不添加任何外源性试剂的前提下，获得高纯度的外泌体，可使其活性得到最大程度上的保留，这对于本领域而言是关键所在。


技术实现要素：

5.本发明提供了一种近红外光控的dna纳米平台复合材料、制备方法及在高纯度提取外泌体中的应用，采用所得复合材料可在近红外光下在不添加任何外源性试剂的前提下，获得高纯度的外泌体，并使其活性得到最大程度上的保留。
6.为了达到上述目的，本发明提供了一种近红外光控的dna纳米平台复合材料，通过在光热响应纳米材料表面通过溶液相滚环扩增反应，生长含有多个外泌体表面特异性表达蛋白质cd63适配体的长滚环扩增产物制备得到。
7.dna凭借其高可编程性，易于预测的热力学和生物相容性，已经成为设计纳米机械设备和纳米机器的优秀模板，可以响应特定的提示，从而做出动态，远程甚至可逆的响应。受到海洋生物长长的触角包含多个粘合剂结构域，可有效捕获流动的食物颗粒的启发，发明人构建了一种dna纳米平台复合材料实现高效、高特异性捕获间充质干细胞外泌体。
8.近红外光具有组织穿透性高、几乎没有光损伤的特点，并且与其他方法相比，光子具有高度的空间和时间可控性，近几年也被广泛应用于肿瘤治疗、蛋白质功能和细胞行为
调控。贵金属纳米组装体，例如磁珠/胶体金，由于其独特的局部表面等离子体共振(lspr)性能是有效的光热剂。进一步，cd63是外泌体表面特异性、高表达的蛋白质。基于邻近依赖性表面杂交，外泌体表面的cd63被多个dna适配体捕获。dna适配体的二级结构对温度变化高度敏感。因此，可以使用dna适配体捕获外泌体，磁珠/胶体金作为光热培养基，利用磁珠/胶体金的lspr特性，通过近红外光辐照来释放被困在适体闭环结构中的外泌体，从而实现可逆的外泌体捕获和释放。
9.作为优选，所述光热响应纳米材料通过将胶体金固定在磁珠上制备得到，其中，所述胶体金通过柠檬酸钠还原法制备得到。
10.作为优选，所述胶体金的粒径为13nm
±
2nm，磁珠的粒径为300nm
±
2nm。
11.本发明提供了一种根据上述任一项技术方案所述的近红外光控的dna纳米平台复合材料的制备方法，包括以下步骤：
12.将胶体金固定在磁珠上，得到磁珠/胶体金复合材料，即光热响应纳米材料；
13.将巯基标记的滚环扩增引发链dna添加到含有磁珠/胶体金复合材料的溶液中，充分反应，得到引发链dna修饰的磁珠/胶体金；
14.随后，加入dna环形模板和phi 29dna聚合酶，通过在引发链dna修饰的磁珠/胶体金的表面进行溶液相滚环扩增反应，生成含有多个cd63适配体的长滚环扩增产物，得到近红外光控的dna纳米平台复合材料。
15.作为优选，所加入的引发链dna与磁珠/胶体金的质量浓度比为(500-600)：1，并将引发链dna与磁珠/胶体金在37℃下反应12小时。
16.作为优选，溶液相滚环扩增反应具体为：
17.将dna环形模板、3u t4连接酶、0.6μl 10mm dntp、3u phi 29dna聚合酶混合均匀，反应2～3小时，得到含有多个cd63适配体的长滚环扩增产物。
18.本发明提供了一种根据上述任一项技术方案所述的近红外光控的dna纳米平台复合材料在可逆捕获和释放高纯度干细胞外泌体中的应用，所述干细胞外泌体表面特异性表达cd63。
19.作为优选，所述干细胞外泌体为间充质干细胞外泌体；所述间充质干细胞外泌体的纯度≥90％。
20.作为优选，包括以下步骤：
21.向dna纳米平台复合材料中加入至间充质干细胞培养基上层清液中，孵育30-40分钟，使用磁性分离方式去除上层清液，得到dna纳米平台复合材料/外泌体，清洗后储存于1ml pbs中；
22.取0.5ml dna纳米平台复合材料/外泌体溶液暴露于808nm、能量密度为1.055w/cm2的近红外光下，将溶液迅速升温至45-50℃，并将溶液在所述温度下保持10-12分钟；
23.随后通过磁性分离的方式去除dna纳米平台复合材料，所得上层清液即为分离的间充质干细胞外泌体。
24.在上述方案中，dna纳米平台复合材料作为光热试剂，磁性分离后，当施加808nm的近红外光，磁珠/胶体金的光热转化效率可使cd63适配体二级结构解旋，从而实现高纯外泌体的释放。与单个适配体相比，实验证明，具有多个cd63适配体结构的dna纳米平台可以实现更高效的外泌体捕获。
25.作为优选，所加入的dna纳米平台复合材料与间充质干细胞培养基上层清液的体积比约为1：(50-60)。
26.与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：
27.1、本发明提供的dna纳米平台复合材料基于近红外光的照射引发磁珠/金纳米颗粒产热来破坏cd63适配体的二级结构，实现外泌体的释放，期间不添加任何的外源性试剂，与现阶段最常用的差速分离方法相比，可获得高纯度的外泌体；
28.2、本发明提供的dna纳米平台复合材料不仅可以实现外泌体的捕获也可以实现外泌体的分离，材料利用率高重复性好；并且，该复合材料在捕获外泌体时，外泌体捕获的dna序列表面只含有外泌体表面特异性表达的cd63适配体，具有高度特异性；
29.3、本发明提供的dna纳米平台复合材料在细胞培养基中稳定性好，可以在复杂环境中使用；并且，基于该复合材料在捕获和分离间充质干细胞外泌体时方法简单、耗时短，不需要昂贵的仪器设备，易微型化和便携化。
附图说明
30.图1为本发明实施例提供的仿生dna纳米平台的制作过程示意图；
31.图2为本发明实施例提供的仿生dna纳米平台捕获和光控分离超纯外泌体的示意图；
32.图3为本发明实施例提供的溶液相滚环扩增实验验证；
33.图4为本发明实施例提供的材料合成过程中粒径和电势表征图；
34.图5为本发明实施例提供的电镜表征分离的外泌体；
35.图6为本发明实施例提供的wb表征mb/aunps/rca对外泌体的捕获示意图
36.图7为本发明实施例提供的wb表征mb/aunps/rca高效捕获外泌体示意图。
具体实施方式
37.下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
38.实施例1光热响应纳米材料的制备
39.光热响应纳米材料主要是由300nm磁珠和13nm胶体金(aunps)组成，其中300nm磁珠购自thermo fisher，13nm胶体金是通过柠檬酸钠还原法制备得到。
40.光热响应纳米材料的制备方法如下：
41.实验前准备：将所有玻璃器皿于王水(hcl/hno3＝3：1)中浸泡30分钟，并用水冲洗干净，然后将其置于烘箱中干燥。
42.1.1 13nm胶体金的制备：将100ml的0.01％氯金酸加入圆底烧瓶中，利用冷凝管进行回流，期间加热并剧烈搅拌；在搅拌的过程中加入3.5ml 1％的柠檬酸钠，溶液的颜色从浅黄色变成无色，最后变成酒红色；继续煮沸10分钟后除去加热源，胶体搅拌直至溶液达到室温；然后将其通过0.45μm滤膜进行过滤，并用透射电子显微镜(tem)表征其粒径为13nm
±
2nm，随后置于4℃冰箱长期保存。
43.1.2光热响应纳米材料(磁珠/胶体金复合材料)的制备：将40μl，10mg/ml羧基修饰的磁珠分散在1.5ml的2-(n-吗啉)乙磺酸缓冲液(mes，10mm，ph 6.0，150mm nacl)中，并在该溶液中添加8mg的edc和1.2mg的nhs，于37℃的恒温震荡水槽中孵育15分钟；用磁性分离法分离表面羧基活化的磁珠，并分散在400μl的磷酸缓冲液(pbs，ph 7.4，150mm nacl)中；然后将400μl 1mm半胱氨酸加入上述pbs缓冲溶液中，并将混合溶液于37℃下孵育24小时；再次用磁性分离法分离半胱氨酸功能化的磁珠，然后用400μl pbs缓冲液洗涤3次；之后，将清洗干净的磁珠分散在1ml胶体金溶液中，并使混合物反应24小时。最后，将所得的磁珠/胶体金复合材料(记为磁珠/胶体金)再次磁性分离，并将所获复合材料分散在1ml的pbs缓冲液中。
44.实施例2dna纳米平台复合材料的制备
45.2.1dna修饰的磁珠/胶体金：将硫基标记的滚环扩增引发链dna(图1，primer，所述滚环扩增引发链dna的序列为5'-hs-ttt ttt ttt ttt ttt cacc tcg ctc ccg tga cac taa-3')添加到含有磁珠/胶体金的溶液中，并使dna：磁珠/胶体金的质量比浓度比为500：1，于37℃下反应12小时。接着分8次加入3m的氯化钠溶液，并实现最终溶液的氯化钠体积浓度为0.3m，使得引发链dna能够更多的连接到磁珠/胶体金表面。最后将所获得的dna修饰的磁珠/胶体金(记为磁珠/胶体金/primer)磁性分离、清洗并重悬于pbs缓冲液中保存。
46.2.2溶液相滚环扩增实验如图3所示，a为滚环扩增dna环形模板，b为滚环扩增引发链dna，c为a和b的混合产物，d为a和b的混合产物并添加t4连接酶，e为a和b的混合产物并添加t4连接酶、dntp和phi 29dna聚合酶。可以看到e条带有大量的dna滚环扩增产物生成。在磁珠/胶体金/primer表面进行溶液相滚环扩增实验(如图1所示)：磁珠/胶体金与dna环形模板(生工，所述dna环形模板的序列为5'-p'-gag cga ggt ggg gtg aaa aaa aaa aaa aaa aaa aaa ta gca tta gtg tca cgg-3')、t4连接酶(3u)、dntp(0.6μl，10mm)、phi 29dna聚合酶(3u)反应2小时，获得最终复合材料磁珠/胶体金/rca，即3d dna纳米平台复合材料。之后再次磁性分离、清洗并重悬于pbs缓冲液中保存。dna纳米平台复合材料制作过程中粒径和电势变化如图4所示。如图4所示，磁珠逐渐表面修饰金纳米颗粒、引发链dna和最终在其表面形成滚环扩增产物的水和粒径逐渐增加，并且电势也逐渐变负。
47.实施例3近红外光控的dna纳米平台复合材料在可逆捕获和释放超纯间充质干细胞外泌体中的应用
48.3.1间充质干细胞培养：将间充质干细胞在dmem(10％胎牛血清，1％青霉素和链霉素，1
×
非必须氨基酸，10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子和10
×
巯基乙醇)中培养，并在37℃、5％co2的孵化器(thermo fisher)中培养。
49.3.2将1mg磁珠/胶体金/rca复合材料加入到10ml间充质干细胞培养基上层清液中孵育30分钟。之后使用磁性分离进行分离，去除上层清液，得到磁珠/胶体金/rca/外泌体。将分离得到的磁珠/胶体金/rca/外泌体加入1ml pbs，小心清洗3次，之后储存于1ml pbs中。
50.3.3取0.5ml的磁珠/胶体金/rca/外泌体溶液暴露于808nm、能量密度为1.055w/cm2的近红外光(聚焦光电808nm红外光激光器)下，将溶液迅速升温至50℃，并将溶液保持在该温度下10分钟。接着通过磁性分离的方式去除磁珠/胶体金/rca，所获得的上层清液即为分离的超纯充质干细胞外泌体，具体过程如图2所示。
51.实施例4分离得到的外泌体的表征与验证
52.将dna纳米平台捕获分离的外泌体置于铜网中，并利用透射电子显微镜进行表征，如图5所示，分离的外泌体膜状结构完整，表明利用此方法提取的外泌体不会对外泌体有所损坏。同时利用蛋白印记(western blot，wb)验证cd63的存在表征外泌体的成功捕获及分离，外泌体裂解物通过8％sds-page电泳分离，然后通过半干电泳转移装置转移到硝化纤维膜上12分钟。用5％ bsa-pbst(1
×
pbs和0.1％吐温-20)溶液封闭1小时后，膜与cd63一级抗体(1:1000稀释)在4℃下反应过夜，与cd63二级抗体(1:5000稀释)在室温下反应1小时。成像前，膜与ecl底物溶液反应(ncm biotechco.ltd)。使用化学发光成像系统(chemidoctm)获得化学发光图像。结果如图6所示，单纯的磁珠、磁珠/金纳米颗粒和磁珠/金纳米颗粒/primer均不会捕获外泌体，只有当在磁珠/金纳米颗粒表面引发滚环扩增生成cd63适配体以后才会捕获外泌体。
53.实施例5与单个适配体和差速离心捕获外泌体方法的对比
54.为了体现在磁珠/金纳米颗粒表面滚环扩增生成多个适配体(multiple aptamers)的优势，我们利用只在磁珠/金纳米颗粒表面连接单一cd63 dna适配体(monovalent aptamers)序列对比。同时我们也与传统差速离心法(differential centrifugation)提取外泌体对比，验证纳米平台高效捕获外泌体的能力。取相同体积的干细胞培养上清液，分别利用磁珠/胶体金/rca、磁珠/胶体金单一适配体和差速离心法对比。如图7所示，三种方法均可以实现外泌体捕获，利用image j计算wb灰度值得到，磁珠/胶体金/rca多个适配体捕获外泌体体的量是单个适配体的5倍，差速离心法的1.4倍。并且利用磁珠/胶体金/rca分离外泌体的耗时短约2-3h，差速离心法分离外泌体耗时12h以上。

技术特征：
1.近红外光控的dna纳米平台复合材料，其特征在于，通过在光热响应纳米材料表面通过溶液相滚环扩增反应，生长含有多个外泌体表面特异性表达蛋白质cd63适配体的长滚环扩增产物制备得到。2.根据权利要求1所述的近红外光控的dna纳米平台复合材料，其特征在于，所述光热响应纳米材料通过将胶体金固定在磁珠上制备得到，其中，所述胶体金通过柠檬酸钠还原法制备得到。3.根据权利要求1或2所述的近红外光控的dna纳米平台复合材料，其特征在于，所述胶体金的粒径为13nm
±
2nm，磁珠的粒径为300nm
±
2nm。4.根据权利要求1-3任一项所述的近红外光控的dna纳米平台复合材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将胶体金固定在磁珠上，得到磁珠/胶体金复合材料，即光热响应纳米材料；将巯基标记的滚环扩增引发链dna添加到含有磁珠/胶体金复合材料的溶液中，充分反应，得到引发链dna修饰的磁珠/胶体金；随后，加入dna环形模板和phi 29dna聚合酶，通过在引发链dna修饰的磁珠/胶体金的表面进行溶液相滚环扩增反应，生成含有多个cd63适配体的长滚环扩增产物，得到近红外光控的dna纳米平台复合材料。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所加入的引发链dna与磁珠/胶体金的质量浓度比为(500-600)：1，并将引发链dna与磁珠/胶体金在37℃下反应10-12小时。6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，溶液相滚环扩增反应具体为：将dna环形模板、3u t4连接酶、0.6μl 10mm dntp、3u phi 29dna聚合酶混合均匀，反应2～3小时，得到含有多个cd63适配体的长滚环扩增产物。7.根据权利要求1-3任一项所述的近红外光控的dna纳米平台复合材料在可逆捕获和释放高纯度干细胞外泌体中的应用，其特征在于，所述干细胞外泌体表面特异性表达cd63。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述干细胞外泌体为间充质干细胞外泌体；所述间充质干细胞外泌体的纯度≥90％。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：向dna纳米平台复合材料中加入至间充质干细胞培养基上层清液中，孵育30-40分钟，使用磁性分离方式去除上层清液，得到dna纳米平台复合材料/外泌体，清洗后储存于1ml pbs中；取0.5ml dna纳米平台复合材料/外泌体溶液暴露于808nm、能量密度为1.055w/cm2的近红外光下，将溶液迅速升温至45-50℃，并将溶液在所述温度下保持10-12分钟；随后通过磁性分离的方式去除dna纳米平台复合材料，所得上层清液即为分离的间充质干细胞外泌体。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所加入的dna纳米平台复合材料与间充质干细胞培养基上层清液的体积比约为1：(50-60)。

技术总结
本发明提供了一种近红外光控的DNA纳米平台复合材料、制备方法及在高纯度提取外泌体中的应用，属于外泌体分离技术领域。本发明提供的近红外光控的DNA纳米平台复合材料，通过在光热响应纳米材料表面通过溶液相滚环扩增反应，生长含有多个外泌体表面特异性表达蛋白质CD63适配体的长滚环扩增产物制备得到。本发明提供的DNA纳米平台复合材料可在近红外光下在不添加任何外源性试剂的前提下，高效、高纯度可逆捕获和分离外泌体，与现阶段最常用的差速分离方法相比，可获得高纯度的外泌体；并且，该方法简单、耗时短，不需要昂贵的仪器设备，易微型化和便携化。型化和便携化。型化和便携化。


技术研发人员：张书圣 王文晓 李琼 赵婷婷 李雪梅 时鹏飞
受保护的技术使用者：临沂大学
技术研发日：2023.05.17
技术公布日：2023/7/22