一种用于病毒检测的荧光传感器的制作方法

cov-2和h1n1的快速灵敏分析。
8.作为一种可能的设计，每一个所述目标识别单元均包括可特异性识别所述病毒目标分析序列的探针，所述探针为双链dna复合物。探针的游离立足点和目标分析序列结合后，置换出op1链、op2链，并暴露出新的立足点，新暴露的立足点与燃料链特异性结合后置换出sb链和目标链，目标链又可引发新的and gate反应，从而产生大量的sb链，用于引发后续dlcha反应。
9.作为一种可能的设计，每一个所述检测单元均包括lh1复合物和lh2复合物以及目标识别单元中产生的sb链，其中sb链可循环催化并打开lh1复合物的发夹结构，从而引发dlcha反应，形成大量dna梯子，导致荧光信号的产生。
10.作为一种可能的设计，所述lh1复合物、lh2复合物均由连接链l和发夹链(h1或h2)反应得到，所述l链至少包括一个重复序列；优选2-6个重复序列；更优选5个重复序列。随着l链长度的增加(即重复序列数量的增加)，荧光传感器产生的荧光强度也增加，但背景信号基本稳定。当重复序列的个数为5时，所述l链的信号与背景比值(信背比，s/b)最高。
11.作为一种可能的设计，所述病毒包括sars-cov-2和/或h1n1。
12.作为一种可能的设计，用于识别所述h1n1的探针主要由如seq id no.3-7所示的核苷酸序列反应得到。
13.作为一种可能的设计，用于识别所述sars-cov-2的探针主要由如seq id no.15-19所示的核苷酸序列反应得到。
14.作为一种可能的设计，用于检测所述h1n1的m-lh1复合物、m-lh2复合物主要由如seq id no.10、seq id no.11所示的核苷酸序列对应的发夹链以及具有至少一个重复单元的l链反应得到，所述重复单元的核苷酸序列如seq id no.24所示；优选地，seq id no.10、seq id no.11对应的发夹链的浓度与seq id no.12对应的l链的浓度比为4-6:1；更优选，5:1；优选地，如seq id no.10、seq id no.11所示的核苷酸序列对应的发夹链在使用前置于90～100℃下8～10min后退火至室温。
15.作为一种可能的设计，用于检测所述sars-cov-2的e-lh1复合物、e-lh2复合物主要由如seq id no.22以及seq id no.23所示的核苷酸序列对应的发夹链和以及具有至少一个重复单元的l链的反应得到，所述重复单元的核苷酸序列如seq id no.24所示；优选地，seq id no.22、seq id no.23对应的发夹链的浓度与seq id no.12对应的l链的浓度比为4-6:1；更优选，5:1；优选地，如seq id no.22、seq id no.23所示的核苷酸序列对应的发夹链在使用前置于90～100℃下加热8～10min，然后自然退火至室温。
16.作为一种可能的设计，所述荧光传感器中含有检测h1n1的m-ps探针、m-lh1复合物、m-lh2复合物、燃料链m-f1以及燃料链m-f2，所述m-ps探针、m-lh1复合物、m-lh2复合物、燃料链m-f1以及燃料链m-f2的浓度均为90～120nmol/l。
17.作为一种可能的设计，所述荧光传感器中含有用于检测sars-cov-2的e-ps探针、e-lh1复合物、e-lh2复合物、燃料链e-f1以及燃料链e-f2，所述e-ps探针、e-lh1复合物、e-lh2复合物、燃料链e-f1以及燃料链e-f2的浓度均为90～120nmol/l。
18.本发明的有益效果为：
19.本发明公开的荧光传感器具有良好的灵敏度、特异性，检测时间短且选择性好，能够将多种病毒区分开，有利于疾病的早期诊断和对症治疗。特别是对于从症状上很难区分
开的sars-cov-2和h1n1引起的呼吸道疾病，该荧光传感器能够快速、简便和准确地检测出引起疾病的病毒。
附图说明
20.为了更清楚地说明本发明示例性实施方式的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。在附图中：
21.图1为实施例中构建所得荧光传感器的检测原理图；
22.图2为实施例中dlcha反应条件的优化图，(a)连接链l和发夹链h1的孵育时间优化；(b)l链长度优化(n＝3)；
23.图3为实施例中and gate-dlcha、and gate cha、dlcha和探针h1体系灵敏度的比较图；
24.图4为实施例中sars-cov-2、h1n1的荧光光谱和校准曲线图；
25.图5为实施例中and gate-dlcha反应体系特异性考察；
26.图6为实施例中荧光传感器选择性的结果图。
具体实施方式
27.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
28.h1n1和sars-cov-2两种病毒感染的临床表现相似，仅凭症状很难区分，目前针对上述病毒的检测方法主要有实时荧光聚合酶链式反应(rt-pcr)、快速抗原检测(pocat)和环介导等温扩增(lamp)，但是这些检测方法要么耗时长，要么灵敏度低，均无法实现病毒的快速和准确检测。
29.针对上述方法存在的问题，本发明发明人在探索的过程中了解到催化发夹自组装反应(cha)，其具有稳定的信号输出和易于操作的特点。
30.作为一种无酶、恒温的信号放大方法，催化发夹自组装反应(cha)以其稳定的信号输出和易于操作的特点在生物检测中引起了广泛的关注。在cha体系中，目标分析物可以通过循环触发dna发夹链以实现级联杂交，从而在等温条件下实现指数扩增。随着cha的广泛应用，近年来出现了性能优越的新型cha策略，主要包括局域催化发夹组装(lcha)和从分散到局域转化的催化发夹自组装(dlcha)等。由于cha的反应速度依赖于反应体系中游离发夹和引发链的浓度，因此增加dna发夹的局部浓度可以进一步提高常规cha的反应速率。由于游离发夹和引发链的局部高浓度，lcha的灵敏度显著提高，而检测时间比传统cha缩短了约5倍；但lcha也存在非特异性泄漏的局限。与传统的催化发夹自组装(cha)相比，dlcha由于其l链上固定了一定数量的h1、h2发夹链，提高了发夹的局部浓度，其反应速率更快，同时荧光信号更聚集，荧光响应更高。
31.由于sars-cov-2和h1n1的临床症状相似，采用传感器进行检测时对方法的特异性有较高的要求。目前，已有许多基于布尔逻辑运算(如“与门”、“或门”、“非门”等)的逻辑门
用于识别各种目标，通过特定靶标的加入来激活逻辑门，可以很好地提高生物传感器的选择性和特异性。
32.本发明人基于从分散到局域转化的催化发夹自组装(dlcha)存在的上述优点，如果对其优化能够用于病毒的检测，那么就能够解决现有检测方法存在的上述问题。
33.本发明发明人巧妙地发现：基于高特异性的and gate逻辑门耦联高灵敏的dlcha信号增强策略，构建的病毒检测的荧光传感器不仅具有快速、简便的优势，还具有良好的选择性和特异性。
34.以下以检测h1n1和sars-cov-2病毒为例进行说明。
35.实施例1
36.构建用于能够同时检测h1n1和sars-cov-2的荧光传感器
37.1.试剂与材料
38.甲型流感病毒假病毒(h1n1-m1，含h1n1部分m1基因序列，浓度＞1
×
108copies/ml)；新型冠状病毒假病毒(sars-cov-2，含sars-cov-2部分orf1a/b基因、e基因和n基因序列的假病毒，浓度＞1
×
108copies/ml)；中东呼吸道综合征冠状病毒(mers，含mers部分e基因和n基因序列的假病毒，浓度＞1
×
108copies/ml)；呼吸道合胞病毒(rsv，含rsv-a和rsv-b部分f基因序列的假病毒，浓度＞1
×
108copies/ml)和人偏肺病毒(hmpv，含hmpv部分f基因序列的假病毒，浓度＞1
×
108copies/ml)均购于上海生工。
39.于2023年1-2月采集了50例就诊于发热门诊患者的上呼吸道标本。检测前，所有采集的标本均可在4℃下储存不超过24h，可以理解为：采完样以后可以直接检测，也可以在4℃保存，保存时间不超过24h。
40.2.核酸序列的预处理
41.本实施例中所使用的核酸序列(single-strand dna，ssdna)均采用nupack软件(http://www.nupack.org)进行设计，所有核酸序列均由上海生工合成并纯化，具体序列见表1。m-c1和m-c2代表h1n1-m1基因序列中的两段保守序列，e-c1和e-c2代表sars-cov-2e基因的两段保守序列。m-h1、m-h2、e-h1和e-h2四条链在使用前分别经95℃变性10min后缓慢退火至室温以形成稳定的发夹结构。其中，m-h1链(用于h1n1的检测)发夹链茎上分别修饰了荧光基团fam和荧光猝灭基团bhq1；e-h1链(用于sars-cov-2e基因的检测)发夹链茎上分别修饰了荧光基团hex和荧光猝灭基团bhq1。
42.表1and gate-dlcha荧光传感器涉及的核酸序列
[0043][0044][0045]
3.荧光传感器的构建
[0046]
h1n1识别探针(m-ps)的预组装：各准确吸取10.0μl浓度均为100μmol/l的m-op1、m-op2、m-sb、m-s1和m-s2链，用1
×
te溶液定容至100μl，37℃反应1h，形成能特异性识别h1n1的探针双链dna复合物(m-ps，浓度为10.0μmol/l)。
[0047]
sars-cov-2识别探针(e-ps)的预组装：各准确吸取10.0μl浓度均为100μmol/l的e-op1、e-op2、e-sb、e-s1和e-s2链，用1
×
te溶液定容至100μl，37℃反应1h，形成能特异性识别h1n1的探针双链dna复合物(e-ps，浓度为10.0μmol/l)。
[0048]
dlcha反应体系lh1、lh2复合物的预组装：分别取发夹链m-h1、m-h2、e-h1、e-h2和l链混合(发夹链与l链的浓度比为5：1)，在1
×
te缓冲液中，37℃反应40min，以构建dlcha反应体系所需的分散的m-lh1、m-lh2、e-lh1和e-lh2复合物(浓度均为10.0μmol/l)。
[0049]
and gate-dlcha荧光传感器反应体系的构建：分别吸取一定量的c1链、c2链、燃料链f1链、燃料链f2链、探针ps复合物、lh1复合物、lh2复合物于1
×
te溶液中(该反应体系中探针ps复合物、lh1复合物、lh2复合物、燃料链f1、燃料链f2的终浓度均为100nmol/l；c1链、c2链为待检目标基因上的两段保守序列，其浓度可进行系列稀释)，37℃反应45min，用荧光光谱仪检测反应体系荧光强度。
[0050]
荧光光谱仪检测模式为multiwavelength，fam激发波长494nm，发射波长510-700nm，根据荧光基团fam最大发射波长518nm处的荧光强度对h1n1-m1基因核酸片段进行定量；hex激发波长535nm，发射波长548-700nm，根据荧光基团hex最大发射波长556nm处的荧光强度对sars-cov-2e基因核酸进行定量。
[0051]
实施例2
[0052]
采用实施例1构建的and gate-dlcha荧光传感器对含有h1n1假病毒和sars-cov-2假病毒的待测样品进行检测，其中：待测样品中的h1n1假病毒和sars-cov-2假病毒各自对应的目标分析序列如表1所示。c1链、c2链为待检目标基因上的两段保守序列，其浓度可进行系列稀释。
[0053]
用1
×
te溶液对h1n1假病毒和sars-cov-2假病毒进行适当稀释，然后95℃加热10min，使假病毒核酸释放出来。吸取100μl假病毒核酸，加入到and gate-dlcha荧光传感器反应体系中(含f1链、f2链、探针ps复合物、lh1复合物和lh2复合物，浓度均为100nmol/l)，37℃反应45min，用荧光光谱仪检测反应体系荧光强度。根据荧光基团fam最大发射波长518nm处的荧光强度对h1n1假病毒进行定量，根据荧光基团hex最大发射波长556nm处的荧光强度对sars-cov-2假病毒进行定量。
[0054]
实施例3
[0055]
采用实施例1构建的and gate-dlcha荧光传感器对临床样本中sars-cov-2和h1n1进行检测。
[0056]
将采集的鼻咽拭子标本保存于2.0ml 1
×
te溶液中(含200g/l异硫氰酸胍)。检测前，振摇混匀1min，吸取500μl样品于95℃加热10min以释放病毒核酸，然后将100μl释放后的核酸溶液加入and gate-dlcha荧光传感器反应体系中(含f1链、f2链、探针ps复合物、lh1复合物和lh2复合物，浓度均为100nmol/l)，37℃孵育45min。根据荧光基团hex和fam的荧光强度分别对sars-cov-2和h1n1进行定性定量检测。
[0057]
and gate-dlcha荧光传感器的检测原理如下：
[0058]
如图1所示，当待测样品中同时存在目标病毒的两段分析序列c1和c2时，c1和c2同时与识别探针的游离立足点特异性识别并结合，然后将op1、op2链转换出来，暴露出新的结合位点。燃料链f1和f2可以与新暴露的立足点特异性结合从而置换出sb链和目标分析序列c1、c2链，游离的目标分析序列又可以参与下一轮and gate反应，最终积累大量游离的sb链。游离的sb链可与lh1中发夹链h1的立足点特异性结合，从而引发分散催化发夹组装反应，定位lh1和lh2，引发局域催化发夹组装反应产生dna梯子。h1的发夹结构被打开以后，其标记的荧光基团和荧光猝灭基团被分开，荧光信号倍数增强。当荧光传感器的反应体系中
仅有一条或者无目标链存在时，无法有效触发完整的and gate反应，继而sb链不能被有效置换出来，第二步的dlcha反应亦无法进行，反应体系无明显荧光信号的改变。
[0059]
实施例3
[0060]
本实施例探究l链的长度对荧光响应的影响并且对l链长度进行了优化，比较了2～6个重复序列长度的l链(l2～l6，序列见表2)组成的dlcha反应体系的荧光信号，结果显示(图2中b图)，反应体系荧光强度随着l链长度增加而增加，但背景信号基本稳定，其中l5的信背比最高。因此本研究选择l5的核酸序列作为l链进行后续试验。
[0061]
表2dlcha反应体系核酸序列
[0062][0063]
实施例4
[0064]
为了考察dlcha反应体系中l链与发夹链的预组装效果，本实施例在l链的不同位置标记荧光猝灭基团bhq1，并在发夹链h1上标记fam荧光基团(序列见表2)，通过观察lh1反应体系中荧光强度的变化来考察lh1预组装反应体系的反应速率。结果如图2中a图所示，随着l链与h1链的混合，反应体系荧光强度在10min内迅速降低，并在35min后趋于稳定，表明lh1的制备时间约为35min，比常规的lcha制备时间(150min)更短，因此dlcha具有更好的应用前景。
[0065]
实施例5
[0066]
本实施例用于探究and gate-dlcha的灵敏度。本实施例比较了基于and gate-dlcha(图3a/b)、and gate cha(图3c/d)、dlcha(图3e/f)和探针h1(图3g/h)4种反应体系测定一系列不同浓度目标分析链时的荧光信号。
[0067]
结果显示，随着目标链浓度增加，各反应体系荧光强度逐渐增加。其中，探针h1(图3g/h)体系的荧光响应最弱；当采用dlcha时(图3e/f)，反应体系荧光强度显著增强(反应体系荧光信号增强1～5倍)，显示出dlcha比cha具有更好的信号放大效果。且与and gate-cha(图3d)(检出限0.33nmol/l)、dlcha(图3f)(检出限0.33nmol/l)和探针h1(图3h)体系(检出限16.7nmol/l)相比，and gate-dlcha(图3b)的灵敏度更高，可检测低至33pmol/l的目标物，显示出and gate-dlcha具有更强的信号增强效果。
[0068]
需要说明的是：图3中的b图、d图、f图以及h图的各图中从下往上的曲线所对应目标分析序列的浓度依次增大。
[0069]
实验进一步考察了所建立的and gate-dlcha荧光传感器体系的灵敏度和线性范围。检测前将sars-cov-2假病毒和h1n1假病毒在95℃下加热10min以释放病毒核酸。随后，用1
×
te溶液进行系列稀释(通过qpcr测定sars-cov-2e基因和h1n1-m1基因的浓度)，然后用本研究建立的荧光传感体系进行检测。根据反应体系中荧光基团hex和fam的荧光强度分别对sars-cov-2和h1n1进行定性和定量分析分。如图4所示，sars-cov-2的线性范围为2.00e+02copies/ml～2.50e+04copies/ml，校正方程为y＝0.0231x+128.1(x为sars-cov-2的浓度，y为反应体系在556nm波长处的荧光强度)。h1n1的线性范围为1.00e+02copies/ml～2.50e+04copies/ml，校正方程为y＝0.0299x+125.1(x为h1n1的浓度，y为518nm波长处的荧光强度)。sars-cov-2的检测限为66copies/ml(s/n＝3)，与rt-pcr方法相当，但检测时间只需45min，比pcr更短。h1n1的检出限为33copies/ml(s/n＝3)，与rt-pcr相当，与大多数等温扩增传感器相比有显著提高(见表3)。上述结果表明，and gate-dlcha荧光传感器在初步应用中具有良好的检测性能。
[0070]
表3荧光传感器与其他方法检测对sars-cov-2和h1n1的灵敏度比较
[0071][0072][0073]
实施例6
[0074]
本实施例用于探究and gate-dlcha的特异性。本实施例比较了同时在目标链c1和c2链上各有0、1、2、5nt碱基错配情况下and gate-dlcha反应体系荧光信号变化情况以及在sb链有0、1、2、5nt碱基错配情况下dlcha反应体系荧光信号变化情况。
[0075]
结果如图5所示，在dlcha反应体系中，当sb链中存在一个或两个碱基错配时，dlcha反应仍能被有效触发，导致荧光响应，即dlcha体系的特异性有待提高。而在and gate-dlcha反应中，即使c1和c2链上只有一个碱基错配，也无法触发目标识别单元的and gate逻辑电路，致使sb链无法被有效置换出来，无法有效触发后续的dlcha反应产生特异性荧光线号，显示出and gate-dlcha反应体系具有较强的特异性。因此，通过在dlcha反应前
端串联一个and gate反应可有效增强检测的特异性，进一步保证检测结果的准确性。
[0076]
图5中(a，b)为and gate-dlcha和dlcha反应原理图。(c)为不同碱基错配下and gate-dlcha和dlcha的荧光强度。其中目标链c1、目标链c2和sb链的浓度均为10.0nmol/l，其他链的浓度均为100nmol/l。图5中c图为不同碱基错配下and gate-dlcha和dlcha的荧光强度，其中目标链c1、目标链c2和sb链的浓度均为10.0nmol/l，其他链的浓度均为100nmol/l。
[0077]
实施例7
[0078]
首先，为了考察该荧光传感器在用于实际呼吸道病毒检测时的选择性，将该研究建立的sars-cov-2和h1n1的荧光传感器，分别用于新型冠状病毒(sars-cov-2)、流感病毒(h1n1/h3n2)、中东呼吸综合征冠状病毒(mers)、人偏肺病毒(hmpv)、呼吸道合胞病(rsv-a，rsv-b)等假病毒的检测。结果如图6所示，构建的sars-cov-2荧光传感器只对sars-cov-2有显著的信号响应，h1n1的荧光传感器只有在检测h1n1时有显著的荧光信号响应，提示本研究构建的荧光传感器具有良好的特异性。
[0079]
图6中每个反应体系所检测的病毒从左至右依次为sars-cov-2、h1n1、h3n2、mers、hmpv、rsv-a以及rsv-b。
[0080]
接着，采用鼻咽拭子和样品加标(加入三个浓度水平的sars-cov-2假病毒和h1n1假病毒)的方式来考察所建立的荧光传感器的准确性和重现性。结果(见表4)显示，sars-cov-2的回收率在82.0％～107％之间，相对标准偏差在5.93％～7.62％之间。h1n1的回收率在84.0％～105％之间，相对标准偏差在4.96％～8.52％之间。表明所构建的荧光传感器具有较好的精密度和准确性。
[0081]
最后，实验批量制备多个荧光传感器，并在4℃下储存，每3天检测一次sars-cov-2假病毒和h1n1假病毒，共检测15天，以考察所构建的荧光传感器的长期稳定性。结果(见表5)显示，sars-cov-2(1.00e+04copies/ml)和h1n1(1.00e+04copies/ml)的相对标准偏差rsd分别为9.39％和9.10％，表明该荧光传感器具有良好的长期稳定性。
[0082]
表4方法的准确度和精密度(n＝6)
[0083][0084]
表5荧光传感器的稳定性(n＝6)
[0085][0086]
实施例8
[0087]
基于实施例1构建的荧光传感器检测呼吸道病毒。
[0088]
取500μl鼻咽拭子标本，于95℃加热10min以释放核酸，然后准确吸取100μl释放后的核酸溶液(如检测结果超出线性范围，可用1
×
te溶液进行稀释)至and gate-dlcha反应体系中，进行sars-cov-2和h1n1的定性和定量分析。结果(见表6)显示，在11份拭子标本中检出sars-cov-2，浓度范围为1.82e+03copies/ml至2.04e+07copies/ml。在5份拭子标本中检出h1n1，浓度范围为6.50e+02copies/ml至1.26e+06copies/ml。实验同时采用rt-pcr法进行了sars-cov-2和h1n1的检测。如表6所示，荧光传感器结果与rt-pcr结果一致(ct值≤38.0，阳性)，且与ct值呈负相关，说明所建立的and gate-dlcha荧光传感系统在临床应用中具有较好的检测性能，可应用于sars-cov-2和h1n1的现场检测。
[0089]
表6荧光传感器与rt-pcr对咽拭子标本中sars-cov-2和h1n1检测结果比较(n＝3)
[0090][0091][0092]
采用and gate逻辑门的方式进目标识别，并采用dlcha的方式进行信号放大，建立了一种快速、无酶的生物传感器用于准确检测上呼吸道标本中sars-cov-2和h1n1。当样本中存在sars-cov-2和h1n1特异性核酸片段时，基于and gate模式识别的熵驱动反应被触发并进一步启动了随后的dlcha反应过程，产生了一系dna梯子复合物，使分子信标h1链的发夹结构被打开，荧光基团和猝灭基团分开，发出荧光信号，通过对反应体系荧光型号的检测可以实现对待测物的准确定性定量检测。
[0093]
与常规cha相比，所构建的and gate-dlcha荧光传感器灵敏度高、特异性强，仅需简单的孵育就可在45min内实现sars-cov-2和h1n1的超灵敏检测，检测限分别为66copies/ml(sars-cov-2)和33copies/ml(h1n1)。此外，构建的and gate-dlcha荧光传感系统还成功应用于50份鼻咽拭子标本的检测，其结果与rt-pcr高度一致(见表6)，阳性标本中sars-cov-2和h1n1含量在6.50e+02copies/ml～2.04e+07copies/ml之间，与rt-pcr检测ct值呈负相关。
[0094]
总之，本发明所建立的and gate-dlcha的荧光传感器具有操作简单、灵敏度高、选择性好，仅需简单的样品孵育，即可实现对sars-cov-2和h1n1的快速检测。同时，仅需通过改变探针的碱基序列，所构建的荧光传感平台即可应用于其他病毒的检测。后续将继续开发多通道荧光传感器，用于临床样本和环境样本中多种不同呼吸道病毒的同时识别和检测。
[0095]
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种用于病毒检测的荧光传感器，其特征在于，所述荧光传感器中含有包括目标识别单元和检测单元；其中，目标识别单元基于“与门”逻辑电路方式进行识别，检测单元基于分散局域催化发夹组装反应实现信号增强，进行体系荧光信号检测。2.根据权利要求1所述的荧光传感器，其特征在于，每一个所述目标识别单元均包括可特异性识别所述病毒目标分析序列的探针，所述探针为双链dna复合物。3.根据权利要求2所述的荧光传感器，其特征在于，每一个所述检测单元均包括lh1复合物和lh2复合物以及目标识别单元中产生的sb链，其中sb链可循环催化并打开lh1复合物的发夹结构。4.根据权利要求3所述的荧光传感器，其特征在于，所述lh1复合物、lh2复合物均由连接链l和发夹链h1或发夹链h2反应得到，所述l链至少包括一个重复序列；优选2-6个重复序列；更优选5个重复序列。5.一种权利要求1-4任一项所述的荧光传感器，其特征在于，所述病毒包括sars-cov-2和/或h1n1。6.根据权利要求5所述的荧光传感器，其特征在于，用于识别所述h1n1的探针m-ps复合物主要由如seq id no.3-7所示的核苷酸序列反应得到。7.根据权利要求5所述的荧光传感器，其特征在于，用于识别所述sars-cov-2的探针e-ps复合物主要由如seq id no.15-19所示的核苷酸序列反应得到。8.根据权利要求5所述的荧光传感器，其特征在于，用于检测所述h1n1的m-lh1复合物、m-lh2复合物主要由如seq id no.10、seq id no.11所示的核苷酸序列对应的发夹链以及具有至少一个重复单元的l链反应得到，所述重复单元的核苷酸序列如seq id no.24所示；优选地，seq id no.10、seq id no.11对应的发夹链的浓度与seq id no.12对应的l链的浓度比为4-6:1；更优选，5:1；优选地，如seq id no.10、seq id no.11所示的核苷酸序列对应的发夹链在使用前置于90～100℃下8～10min后退火至室温。9.根据权利要求5或8所述的荧光传感器，其特征在于，用于检测所述sars-cov-2的e-lh1复合物、e-lh2复合物主要由如seq id no.22以及seq id no.23所示的核苷酸序列对应的发夹链和以及具有至少一个重复单元的l链的反应得到，所述重复单元的核苷酸序列如seq id no.24所示；优选地，seq id no.22、seq id no.23对应的发夹链的浓度与seq id no.12对应的l链的浓度比为4-6:1；更优选，5:1；优选地，如seq id no.22、seq id no.23所示的核苷酸序列对应的发夹链在使用前置于90～100℃下8～10min，后退火至室温。10.根据权利要求5所述的荧光传感器，其特征在于，所述荧光传感器中含有用于检测h1n1的m-ps探针、m-lh1复合物、m-lh2复合物、燃料链m-f1以及燃料链m-f2，所述m-ps探针、m-lh1复合物、m-lh2复合物、燃料链m-f1以及燃料链m-f2的浓度均为90～120nmol/l；优选地，所述荧光传感器中含有用于检测sars-cov-2的e-ps探针、e-lh1复合物、e-lh2复合物、燃料链e-f1以及燃料链e-f2，所述e-ps探针、e-lh1复合物、e-lh2复合物、燃料链e-f1以及燃料链e-f2的浓度均为90～120nmol/l。

技术总结
本发明公开了一种用于病毒检测的荧光传感器，所述荧光传感器中含有包括目标识别单元和检测单元；其中，目标识别单元基于“与门”逻辑电路进行识别，检测单元基于分散局域催化发夹组装反应实现信号增强，进行体系荧光信号检测。本发明所建立的荧光传感器具有良好的灵敏度、特异性，检测时间短且选择性好，能够将多种病毒区分开，有利于疾病的早期诊断和对症治疗。特别是对于从症状上很难区分开的SARS-CoV-2和H1N1引起的呼吸道疾病，该荧光传感器能够快速、简便和准确地检测出引起疾病的病毒。毒。毒。


技术研发人员：邹海民 周琛 王东生 王秋菊 贺巧 彭棋 张桂冀 谢尧琪 罗皓
受保护的技术使用者：四川省肿瘤医院
技术研发日：2023.04.06
技术公布日：2023/7/25