外源褪黑素在提高白菜耐热性和缓解白菜高温致苦中的应用的制作方法

1.本发明涉及白菜生产技术领域，具体涉及外源褪黑素在提高白菜耐热性和缓解白菜高温致苦中的应用。


背景技术：

2.热胁迫是抑制植物生长发育的主要限制因素之一，导致全球作物产量严重下降(hu等，2020)。热胁迫会影响农作物形态、生化和生理等变化，这些变化可能单独或与其他非生物胁迫一起对植物生长和产量产生不利影响(janni等，2020；hassan等，2021)。生化变化包括细胞膜流动性的变化、细胞结构的组织变化、氨基酸的结构变化、代谢物浓度的升高或降低，以及有害活性氧和抗氧化剂的产生(islam等，2020)。活性氧的产生导致膜损伤，如脂质过氧化物酶丙二醛(mda)，在防御性抗氧化系统中触发应激反应，并通过抗坏血酸过氧化物酶(pod)和超氧化物歧化酶(sod)的产生诱导氧化损伤(zhao等，2019)。植物通过调节各种生理过程以应对热胁迫。
3.可以通过耐热种质创制、新品种培育和化肥施用等途径来提高植物热胁迫耐受性，但这些方法或成本高、耗时，或对环境有不利影响(wang等，2019；gebremedhin等，2019；lamaoui等，2018)。褪黑素(melatonin，mt)是一种具有多种生理活性的低分子量吲哚化合物(choi等，2017；nawaz等，2021)。它被认为是一种微量但具有多效活性的新型内源植物激素(ding等，2017)。mt通过清除多种生物和非生物胁迫产生的自由基发挥抗氧化活性，无需与受体介导的信号转导系统相互作用(ding等，2017)。例如，mt通过增强抗氧化防御功能以减轻氧化损伤从而提高小麦和番茄对镉(cd)胁迫的耐受性(kaya等，2019；hasan等，2019)。mt通过增加活性铁(fe)、钾(k)、内源性一氧化氮(no)和硫化氢(h2s)的浓度，增强抗氧化酶活性和降低过氧化氢(h2o2)及mda的水平来增强辣椒对缺fe和盐胁迫的耐受性(kaya等，2020)。mt通过改善铁稳态、抗氧化防御系统和次级代谢过程从而减轻黄瓜的fe胁迫(ahammed等，2020)。因此，mt在植物应对非生物胁迫方面起到至关重要的作用。
4.白菜(b.campestris l.syn.b.rapa)作为一种重要的叶用蔬菜，在世界范围内大量栽培。它是主要的芸苔属植物之一，富含一些重要的抗癌和抗氧化化合物(jan等，2018；lee等，2020)。白菜性喜冷凉，大多数品种对高温高度敏感，受到热胁迫后代谢产物和抗氧化性发生显著变化(byeon等，2019)。因此，白菜多在秋冬季节栽培(ahmed等，2020)。但近年随着夏季市场对白菜需求的增大，白菜在夏季的种植面积逐年扩大，且由于白菜生长周期短，是我国沿海地区夏季台风灾后补种的重要蔬菜之一。叶菜类植物比果菜类植物对高温敏感得多，白菜生产在高温环境下面临严峻挑战。探索新型绿色无污染处理方法以保持白菜产量和质量是一项重要任务。外源mt预处理对白菜热胁迫耐受性的影响尚不清楚。在此，将外源mt预处理应用于白菜热敏品种，发现外源mt通过影响白菜抗氧化防御系统，并调节初级和次级代谢产物的积累来提高耐热性，并有助于降低高温引起的苦味。本研究获得的结果有助于制定高温季节白菜绿色生产技术措施。
5.参考文献
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技术实现要素：

25.本发明的目的是提供外源褪黑素在提高白菜耐热性和缓解白菜高温致苦中的应用，以解决现有技术的不足。
26.本发明采用以下技术方案：
27.本发明提供了外源褪黑素在提高白菜耐热性和缓解白菜高温致苦中的应用。
28.进一步地，应用时包括如下步骤：在白菜生长至25日龄时，对白菜幼苗叶片正反面进行外源褪黑素喷施，每24h喷施1次100μm褪黑素溶液，每次喷施至叶片正反面出现液滴直至有液滴滴下为准，共计3次。
29.更进一步地，褪黑素溶液配制方法如下：褪黑素先用100v/v％乙醇溶解，再用水稀释，乙醇作为溶剂的终浓度为0.1v/v％。
30.更进一步地，褪黑素溶液避光喷施。
31.更进一步地，褪黑素溶液在日落后0.5-1h之内喷施。
32.本发明的有益效果：
33.本发明通过外源褪黑素预处理提高了白菜的耐热性，并降低了高温引起的苦味。本发明获得的结果有助于制定高温季节白菜绿色生产技术措施。
34.本发明在白菜生长至25日龄时，对白菜幼苗叶片正反面进行外源褪黑素喷施，每24h喷施1次100μm褪黑素溶液，共计3次。施用方便，可操作性强，用量少，见效快，成本低，安全可靠。
附图说明
35.图1为100μm mt预处理对热胁迫(40℃/30℃，24h)下白菜生长的影响。(a)白菜植株形态照片。(b)地上部鲜重。(c)六片完全展开时功能叶的形态照片。(d)第四片功能叶叶面积。(e)卷叶率和热害指数。(f)相对电导率。(g)叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素和总叶绿素含量。来自三个独立生物学重复的数据显示为平均值
±
标准差。采用方差分析进行统计学分析，然后采用tukey多元比较检验。不同样品以不同上标小写字母表示，差异有统计学意义(p《0.05)。缩写：ck，正常温度下喷施0μm mt的植株；ckh，热胁迫下喷施0μm mt的植株；mts，正常温度下喷施100μm mt的植株；mtsh，热胁迫下喷施100μm mt的植株。
36.图2为电镜下mt预处理后的白菜叶肉细胞在热胁迫(40℃/30℃，24h)下的表型。(a)叶绿体超微结构。比例尺：2μm/1μm(上/下)。缩写：cw，细胞壁；dms，双膜系统；gl，基粒片层；gt，基粒类囊体；og，嗜锇颗粒；sg，淀粉粒。(b)气孔形态。比例尺：3μm。图像中的样本从左到右分别是ck，ckh，mts和mtsh。缩写：ck，正常温度下喷施0μm mt的植株；ckh，热胁迫下喷施0μm mt的植株；mts，正常温度下喷施100μm mt的植株；mtsh，热胁迫下喷施100μm mt的植株。
37.图3为mt预处理对热胁迫(40℃/30℃，24h)下白菜细胞活力的影响。(a)可溶性糖含量。(b)mda含量。(c)sod活性。(d)pod活性。(e)过氧化氢酶(cat)活性。(f)抗坏血酸过氧化物酶(apx)活性。所有数据均显示为三个独立生物重复的平均值
±
标准差。采用方差分析进行统计学分析，然后采用tukey多元比较检验。不同样品以不同上标小写字母表示，差异有统计学意义(p《0.05)。缩写：ck，正常温度下喷施0μm mt的植株；ckh，热胁迫下喷施0μm mt的植株；mts，正常温度下喷施100μm mt的植株；mtsh，热胁迫下喷施100μm mt的植株。
38.图4为外源mt预处理对热胁迫(40℃/30℃，24h)的白菜光化学效率的影响。(a)可视化荧光图像fv/fm值。(b)叶绿素荧光瞬时曲线psii(ojip，反应的是psii反应中心(reaction center，rc)从开始到关闭时的荧光强度)。(c)由ojip瞬时曲线推导出的ojip参数蜘蛛图。对于每个参数，ctrl的值都设置为1，仅表示ckh或mtsh相对于ck和mtsh相对于ckh有显著差异的值。(d)蒸腾速率(tr)。(e)光合速率(pn)。(f)细胞间co2浓度(ci)。(g)气孔导度(gs)。柱形表示来自三个独立生物重复的数据，显示为平均值
±
标准差。采用方差分析进行统计学分析，然后采用tukey多元比较检验。不同样品间光合参数的上标小写字母差异显著(p《0.05)。缩写：abs，吸收基础；ck，正常温度下喷施0μm mt的植株；ckh：热胁迫下喷施0μm mt的植株；ckh/ck，ckh相对于ck；csm，psii横截面；df，驱动力；eto，电子传递通量；i阶，荧光强度在30ms；j阶，2ms时的荧光强度；mts，正常温度下喷施100μm mt的植株；mtsh，热胁迫下喷施100μm mt的植株；mtsh/ck，mtsh相对于ck；mtsh/ckh，mtsh相对于ckh；o阶，为所有光系统ii反应中心开放时在20μs的最小荧光强度；pi，光化学活性；p阶，所有光系统ii反应中心关闭时的最大荧光强度；pi inst.，光化学活性性能指标；rc，反应中心；reo，psi
受体侧的电子通量减少末端电子受体。
39.图5为热胁迫对白菜品质指标的影响。(a)维生素c含量。(b)可溶性蛋白浓度。(c)硝酸盐含量。(d)总黄酮含量。(e)总硫苷含量。(f)硫苷含量。(g)从ck、ckh、mts和mtsh中分离得到的硫苷hplc图谱。每张色谱图中所示gs编号1-8，从左到右依次为：(1)pro、(2)gas、(3)gna、(4)gbn、(5)gbc、(6)gnt、(7)4megbc、(8)neogbc。std是黑芥子硫苷酸钾，作为内标。所有数据均显示为三个独立生物重复的平均值
±
标准差。采用方差分析进行统计学分析，然后采用tukey多元比较检验。不同样品以不同上标小写字母表示，差异有统计学意义(p《0.05)。缩写：4megbc，4-甲氧基葡萄糖脑苷脂；ck，正常温度下喷施0μm mt的植株；ckh，热胁迫下喷施0μm mt的植株；gas，葡配庭荠精；gbc，芸薹葡糖硫苷；gbn，葡萄糖异硫氰酸戊-4-烯酯；gna，葡萄糖芫菁芥素；gnt，葡萄糖豆瓣菜素；mts，正常温度下喷施100μm mt的植株；mtsh，热胁迫下喷施100μm mt的植株；neogbc，新葡萄糖薹素；pro，2(r)-2-羟基-3-丁烯基硫代葡萄糖苷。
具体实施方式
40.下面结合实施例和附图对本发明做更进一步地解释。下列实施例仅用于说明本发明，但并不用来限定本发明的实施范围。
41.一、材料与方法
42.植物材料与处理
43.将白菜
‘
矮脚黄’种子播种在由蛭石和草炭土按质量比1:1混合而成的盆栽介质中，在相对湿度65％和300μmol
·
m-2
·
s-1
最大光强度的温室中培养25d，昼/夜的光周期和温度分别为16h/8h和25℃/18℃。
44.将mt(solarbio，shanghai，china)溶解在100％乙醇(v/v)中以获得母液，然后将其进一步稀释在纯净水中以获得工作液。对于所有处理，乙醇作为溶剂的终浓度为0.1％(v/v)，以避免溶剂引起的任何潜在影响。所有溶液均在实验当天新鲜配制。
45.对25日龄白菜幼苗叶片正反面进行外源mt处理，每24h喷施1次100μmmt，在日落后0.5-1h之内喷施，每次喷施至叶片正反面出现液滴直至有液滴滴下为准，共计3次，3d后对其进行热胁迫处理，条件为40℃/30℃昼/夜(16h/8h)，并设对照，共计4个处理，即白菜幼苗在正常温度下喷施0μm mt(ck)，在热胁迫处理下喷施0μm mt(ckh)，在正常温度下喷施100μm mt(mts)和在热胁迫处理下喷施100μm mt(mtsh)。白菜样品在热胁迫处理24h后取样。所有样品测量完成后立即在液氮中冷冻，然后在-80℃下储存备用。
46.表型指标测量
47.定量图像使用canon eos 600d相机拍摄。地上部鲜重(fw)通过称重来确定，并表示为g/苗。第四片功能叶叶面积使用imagej v1.8.0(national institutes of health，bethesda，md，usa)进行分析。相对电导率、卷叶率、热害指数和叶绿素含量按照前人方法进行测算(zhao等，2020；aug
é
等，2002；dai等，2019；wen等，2019)。
48.aug
é
rm,windham mt,moore jl,witte wt,kubikova e,klingeman we,evans rm,reiss jh,flanagan pc,saxton am.2002.leaf curl and water relations of kousa dogwoods showing resistance to summer stress.journal of environmental horticulture 20,143
–
147.
promoting plant growth by regulating carbon assimilation and atp accumulation.plant science 319,111276.
62.维生素c含量测定
63.将总共0.1g均质化的叶子样品与20ml2％(w/v)草酸混合。将混合物均质化并在0℃下以1500g离心25min。重复萃取2次，加入15ml草酸，用蒸馏水定容至50ml。将10ml提取物转移到50ml三角瓶中，然后用标准的2,6-二氯苯酚靛酚染料溶液滴定至浅粉色，持续15s。结果以每百克样品干重所含维生素c的毫克数(mg
·
100g
–1dw)表示。
64.可溶性蛋白浓度测定
65.将总共0.5g均质化的叶子样品与4ml磷酸盐缓冲液(0.1m，ph7.0)混合，然后孵育0.5h。通过紫外分光光度计在280nm和260nm处测量样品的吸光度。根据公式(1.55
×a280
)-(0.76
×a260
)计算蛋白浓度(mg
·
ml
–1dw)。
66.硝酸盐含量测定
67.用氨-氯化铵缓冲液(ph8.0)提取总共0.5g均质化样品中的硝酸盐含量。提取液中加入活性炭脱色，过滤除去活性炭和不溶物。通过紫外分光光度计在219nm处测量样品的吸光度。结果以每千克样品干重所含硝酸盐的毫克数(mg
·
kg
–1dw)表示。
68.次生代谢产物测量
69.根据氯化铝比色法测定白菜中的总黄酮含量。将0.5ml用罗勒甲醇溶液提取的样品与2ml蒸馏水混合，并向该混合物中加入0.3ml(5％w/v)nano2。反应6min后，加入0.3ml(10％w/v)alcl3，再过6min后，加入4ml(4％w/v)naoh，用蒸馏水定容至10ml。剧烈摇动混合物并测量510nm处的吸光度。总黄酮含量表示为μg
·
ml-1
dw。
70.gs提取和hplc(shimadzu，kyoto，japan)分析按文献(zang等，2015)所述。
71.zang y,zheng w,he y,hong sb,zhu z.2015.global analysis of transcriptional response of chinese cabbage to methyl jasmonate reveals ja signaling on enhancement of secondary metabolism pathways.science horticulture 189,159
–
167.
72.统计分析
73.这些实验通过三次生物学和技术重复得到证实。使用excel 2019(microsoft，redmond，wa，usa)绘制图表。使用microsoft power point 2019收集所得数据。数据表示为均值
±
sd，由spss20.0分析软件(ibm，chicago，il，usa)计算，并使用方差分析进一步评估以确定显著性。在95％的置信水平下，差异被认为是显著的(p《0.05)。
74.二、结果与分析
75.外源mt预处理降低了白菜的热害
76.白菜热胁迫后(ckh)表现为叶片卷曲和轻度枯萎(图1a)，而用mt预处理再热胁迫(mtsh)相应症状则明显缓解，这可以通过增加的地上部鲜重(图1b)和第四片功能叶叶面积(图1c和1d)证明。正常条件下mt预处理的白菜(mts)显示出与未处理组(ck)相似的卷叶率和热害指数。与ckh相比，mtsh的卷叶率和热害指数显著降低(图1e)，相对电导率显著升高(图1f)，叶绿素含量(包括chla和chlb)则保持在相对稳定的高水平(图1g)，而各组类胡萝卜素浓度没有显著差异。这些结果表明mt预处理保持了白菜中的叶绿素含量并削弱了热胁迫的损伤。
77.外源mt预处理保护了白菜的膜完整性
78.为了验证热胁迫引起的损伤，叶绿体超微结构和气孔形态被测量(图2)。ck中新鲜叶片具有组织良好的叶绿体结构，类囊体清晰可见，层状结构紧密排列，包括基粒片层(gl)和基粒类囊体(gt)、嗜锇颗粒(og)和淀粉粒(sg)(图2a)。此外，叶绿体的双膜系统(dms)接近光滑的细胞壁(cw)。但ckh植株叶片叶绿体结构变得不规则，类囊体明显肿胀，og致密，叶绿体严重卷曲。与ck相比，ckh植株的片层结构变短变宽，片层间隙变大，叶绿体双层膜与细胞壁略有脱离。此外，ckh中大部分叶绿体及其dms容易变形并严重分解，带有扭曲和塌陷的膜。而在mtsh中，叶绿体超微结构与ck相似。相对于ck、mts和mtsh，在ckh中观察到气孔状态差异显著(图2b)。在ckh中，气孔的大小、长度和开口发生了显著变化，失水最为严重。结果表明，mt处理维持了白菜完整的叶绿体膜和稳定的气孔状态。
79.外源mt预处理减轻了白菜的氧化损伤
80.为了量化热胁迫对白菜生化指标的影响，可溶性糖含量、mda含量和抗氧化酶(sod、pod、cat和apx)活性被进一步测定和分析(图3)。与ck相比，ckh可溶性糖含量显著降低0.89倍，但mts和mtsh分别显著增加1.66被和1.15倍。作为代表氧化损伤的指标，与ck相比，ckh和mtsh中的mda含量分别显著增加了4.8倍和3.5倍(图3b)。在mtsh/ckh中，mda含量显著降低了0.7倍，但在ck和mts之间没有显著差异。热胁迫后，白菜的sod、pod、cat和apx活性均显著增加，且mt预处理下的热胁迫显著增强了这些抗氧化酶的活性，但单独mt预处理对这些抗氧化酶的活性并没有显著影响(图3c-3f)。该结果表明白菜上调了可溶性糖和mda的含量，sod、pod、cat和apx的活性，从而增强其抗氧化性以应对热胁迫，mt预处理可有效减轻热胁迫造成的氧化损伤程度。
81.外源mt预处理稳定了热胁迫下白菜的叶绿素荧光参数和光合参数
82.为了测试外源mt预处理和热胁迫对叶绿体发育的影响，通过pam成像分析了白菜中光系统(ps)ii的最大量子产率(fv/fm)。ckh中fv/fm受到显著影响，而该指数在mts组和mtsh组中均未受到影响(图4a)，表明热胁迫确实影响叶绿体发育。ck、ckh、mts和mtsh中的荧光瞬变呈现为ojip曲线(图4b)。曲线中的每个步骤都表现出不同的响应，ck、mts和mtsh中的参数在每个步骤都相似，除了ckh中的步骤j。在ckh/ck中，光化学活性性能指标(pi inst.)、pi吸收基础(pi abs)、总pi、驱动力(df)abs和总df的值分别显著增加了1.5倍、1.5倍、1.6倍、1.5倍和2.0倍。在mtsh/ck中，各项指标参数无显著差异。在mtsh/ckh中，pi inst.的值、每个psii横截面的电子传递通量(eto/csm)和其psi受体侧的电子通量减少末端电子受体(reo/csm)、pi abs、总pi、df abs和总df显著增加了1.9倍、1.5倍、1.5倍、1.9倍、2.0倍、1.9倍和3.4倍。总的来说，mt预处理提高了白菜光系统中的电子循环传递速率，以保护细胞免受热胁迫。
83.为了研究mt如何帮助白菜承受热胁迫造成的负面生理影响，功能叶的光合参数被进一步测量(图4d
–
4g)。tr和gs在ckh/ck中显著增加了1.4倍和1.6倍，在mtsh/ck中显著降低了0.5倍和0.3倍。ci在mtsh/ck中没有显著差异。tr、pn和gs在mtsh/ckh中显著降低。这表明光合作用和气体交换速率在热胁迫下减弱，但通过外源mt预处理可以缓解。
84.mt预处理提高了热胁迫下白菜品质指标的含量
85.为检测mt对白菜品质包括口感和风味的影响，测定了维生素c、可溶性蛋白质和硝酸盐的含量。维生素c含量的变化如图5a所示。与ck相比，维生素c含量在ckh中显著降低
0.87倍，在mts和mtsh中分别显著升高1.35和1.19倍；可溶性蛋白浓度在ckh中显著降低0.68倍，在mts和mtsh中的分别显著增加2.09倍和1.66倍(图5b)。叶片硝酸盐含量在ckh中最高，为481.80mg
·
kg-1
，在mtsh中最低，为222.23mg
·
kg-1
(图5c)。次生代谢产物积累方面。与ck相比，mtsh中的总类黄酮含量显著增加了1.10倍(图5d)。与ckh相比，mts和mtsh的含量分别显著下降了0.79倍和0.88倍。热胁迫诱导了gs的生物合成(图5e
–
5g)。在mtsh/ckh中，ags和总gs含量显著降低了0.78倍和0.86倍，igs的含量增加了1.19倍(图5e)。检测到的八种gs，包括四种脂肪族gs(ags)(progoitrin(pro)；葡萄糖酵素(gas)；葡萄糖苷(gna)和葡糖甘蓝素(gbn))，一种芳香族gs(rgs)(葡糖腺苷(gnt))和三种吲哚gss(igss)((葡糖甘蓝素(gbc)；4-甲氧基葡糖甘蓝素(4megbc)和新葡糖甘蓝素(neogbc))(图5f和5g)。其中，苦味gbc和neogbc的含量在ckh/ck中分别增加了1.72倍和1.02倍，但在mtsh/ckh中分别减少了0.88倍和0.85倍。
86.这些结果表明，外源mt预处理诱导了热胁迫下白菜中维生素c、可溶性蛋白的积累，降低了硝酸盐、总黄酮和苦味硫苷的含量。
87.总结
88.在本发明研究中，外源mt预处理降低了热胁迫下白菜的卷叶率和热害指数，叶片的萎蔫程度，保持了植株地上鲜重和第四片功能叶叶面积，提高了相对电导率和叶绿素含量，并维持了叶绿体结构以减轻热胁迫的损伤。外源mt预处理能够有效提高热胁迫下白菜光系统中的电子循环传递速率、荧光量子产率以及光合速率，帮助co2积累。通过增加可溶性糖含量、mda含量和抗氧化酶(sod、pod、cat和apx)活性诱导白菜耐热性提高。
89.维生素c、可溶性蛋白和gss的积累以及硝酸盐和总黄酮的消耗有助于白菜保持品质。此外，在mtsh/ckh中苦味gss(gbc和neogbc)含量的增加显著下降。
90.研究结果表明，外源mt预处理增强了热胁迫下白菜的抗氧化能力并保持其品质包括口感和风味。

技术特征：
1.外源褪黑素在提高白菜耐热性和缓解白菜高温致苦中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，应用时包括如下步骤：在白菜生长至25日龄时，对白菜幼苗叶片正反面进行外源褪黑素喷施，每24h喷施1次100μm褪黑素溶液，每次喷施至叶片正反面出现液滴直至有液滴滴下为准，共计3次。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，褪黑素溶液配制方法如下：褪黑素先用100v/v％乙醇溶解，再用水稀释，乙醇作为溶剂的终浓度为0.1v/v％。4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，褪黑素溶液避光喷施。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，褪黑素溶液在日落后0.5-1h之内喷施。

技术总结
本发明公开了外源褪黑素在提高白菜耐热性和缓解白菜高温致苦中的应用。应用时包括如下步骤：在白菜生长至25日龄时，对白菜幼苗叶片正反面进行外源褪黑素(Melatonin，MT)喷施，每24h喷施1次100μM褪黑素溶液，每次喷施至叶片正反面出现液滴直至有液滴滴下为准，共计3次。本发明通过外源褪黑素预处理提高了白菜的耐热性，并降低了高温引起的苦味。本发明获得的结果有助于制定高温季节白菜绿色生产技术措施。措施。措施。


技术研发人员：黄鹂 滕芝妍 柳倩
受保护的技术使用者：江苏益禾农业科技有限公司
技术研发日：2023.03.31
技术公布日：2023/7/25