一种特异性识别β-乳球蛋白的优化适配体及其应用

一种特异性识别
β-乳球蛋白的优化适配体及其应用
技术领域
1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种特异性识别β-乳球蛋白的优化适配体及其应用。


背景技术：

2.牛乳富含机体生长发育所必需的各种氨基酸及微量元素，素有“白色血液”之称，因此深受人们喜爱。但其作为联合国粮食及农业组织(fao)和世界卫生组织(who)划定的八大类过敏食物之一，由牛乳引发的牛乳过敏(cma)已逐渐成为婴幼儿群体中最常见的食物过敏反应，严重影响着婴幼儿群体的身体健康，甚至危及生命。近年来由于生活方式的改变、微生物的暴露、饮食习惯的改变等多种因素，婴幼儿的肠道免疫功能越来越低，婴幼儿牛乳过敏发生率正呈逐年上升的趋势。据调查表明，约82％左右牛乳过敏群体的致敏原为β-乳球蛋白(β-lg)，因此β-乳球蛋白被认为是牛乳中最主要的过敏原蛋白，可以看作为牛乳过敏原监测的标志物。因此，对食物过敏原β-乳球蛋白准确检测既可以为生产者评估食物潜在致敏性风险提供重要依据，又可以为牛乳过敏群体的日常饮食提供有效指导。
3.目前食物过敏原β-乳球蛋白常用的检测方法包括色谱分析技术、基于识别特征基因的分子生物学技术和基于抗原-抗体特异性识别酶联免疫分析方法(elisa)等，虽然，色谱分析技术(尤其lc-ms技术)因具有准确度高、特异性强、线性范围宽等优点，但是样品前处理复杂，需要昂贵仪器设备和专门的技术人员，制约了该技术的普及与推广。分子生物学方法是一种间接检测方法，依赖检测特异性序列，需要筛选针对性的过敏原标志基因，而且并非每个过敏原都有合适的标志基因可被应用到实际样本的检测。另外食品加工的复杂处理过程可能会导致核酸降解，最终影响检测结果。elisa法虽有良好的特异性、准确性及较高的灵敏度的优点，但是制备特异性抗体过程仍然繁琐且耗时，且制备出的抗体稳定性差，不易进行化学修饰，大大限制了过敏原β-乳球蛋白检测方案的开发与应用。
4.适配体(aptamer)是通过指数富集配体进化技术(selex)从人工合成的随机核苷酸文库中筛选获得能特异性结合靶物质的单链寡核苷酸。适配体在特定微环境体系内可形成特定的三维构象(发卡、假结、凸环和g-四联体等)，通过空间结构的匹配、氢键、范德华力和静电相互作用等分子间相互作用力与靶物质进行高亲和性结合。与抗体相比具有很多优势：(1)人工合成，不依赖动物体内免疫，批次之间的差异小；(2)稳定性好，可长期保存，耐热性强；(3)亲和力高，特异性强，适配体kd可低至纳摩尔级别，能很好的区分结构类似物；(4)易于修饰，适配体两端标记化学基团(如fam、rox、fitc和生物素等)不影响其亲和性。因此，适配体作为一种新型的识别分子在医疗诊断、环境监测和食品安全分析等领域具有无可比拟的优势，且已被整合开发各类生物传感/分析平台。
5.一般情况下，通过selex技术直接筛选到的适配体含有70～130个核苷酸，包含两端引物区和中间随机序列区。但并不是所有的核苷酸都参与适配体与靶标的结合过程，非必需核苷酸序列区可能会形成各种二级结构从而干扰适配体与靶标的结合或者降低适配体-靶标复合物的构象稳定性，且较长的序列会带来较低的产率和较高的合成成本。因此，
实际使用中对适配体的序列进行剪裁优化，在保留适配体亲和性能的前提下，获得适配体最短序列大有裨益。此外，因其核酸的化学本性，适配体构象具有固有灵活性，本质上是动态的，并且具有包含相互转换子状态的巨大构象合集。这种过度灵活的构象通常会导致结合亲和力减弱、脱靶相互作用以及对应用场景的高度敏感性，从而严重影响适配体在实际应用中的性能。因此，亟需对适配体采取一定的结构强化策略，以努力提高适配体构象稳定性，降低其结合性能对环境的敏感度，促进适配体的应用与发展。


技术实现要素：

6.本发明旨在解决上述问题，提供了一种特异性识别β-乳球蛋白的优化适配体及其应用。该优化适配体相比于原始β-乳球蛋白适配体相比，具有理想的亲和力、良好的特异性。
7.按照本发明的技术方案，所述特异性识别β-乳球蛋白的优化适配体，由β-乳球蛋白原始适配体lg-18经优化后得到，所述β-乳球蛋白原始适配体lg-18的序列如seq id no：1所示，所述优化的方式包括剪裁、碱基突变和结构优化。具体的，所述β-乳球蛋白原始适配体lg-18通过selex筛选获得。
8.进一步的，所述优化适配体为#t4m8，其序列如seq id no：15所示。
9.进一步的，所述优化适配体为环状适配体，所述环状适配体由两条携带互补碱基序列的适配体单体经碱基配对后连接形成，所述适配体单体的核心序列如seq id no：15所示。
10.进一步的，所述两条携带互补碱基序列的适配体单体的序列如seq id no：17(cb-#t4m8-1)和seq id no：18(cb-#t4m8-2)，或seq id no：19和seq id no：20，或seq id no：21和seq id no：22所示。
11.进一步的，所述优化适配体还包括修饰物修饰。具体的，所述修饰物可以修饰于所述优化适配体的5’端；当优化适配体为环状适配体时，修饰物可以修饰于环状适配体任一碱基上。
12.进一步的，所述修饰物包括荧光基团、同位素、电化学标记物、酶标记物、亲和配基和巯基中一种或多种。
13.本发明的第二方面提供了一种特异性识别β-乳球蛋白的组合物，包括上述优化适配体。
14.本发明的第三方面提供了一种特异性识别β-乳球蛋白的试剂盒，包括上述优化适配体。
15.本发明的第四方面提供了一种特异性识别β-乳球蛋白的试纸，包括上述优化适配体。
16.本发明的第五方面提供了一种特异性识别β-乳球蛋白的芯片，包括上述优化适配体。
17.本发明的技术方案相比现有技术具有以下优点：
18.(1)本发明采用适配体特异性识别β-乳球蛋白，与抗体相比，具有可在体外筛选、筛选周期短、合成方便、易标记各种功能基团和报告分子、性质稳定可长期保存使用等优势；
19.(2)本发明优化适配体是基于原始序列的二级结构，通过剪裁、碱基突变及结构强化获得的亲和力和特异性均较强的适配体序列，能够特异性识别过敏原β-乳球蛋白；
20.(3)与筛选获得的原始β-乳球蛋白适配体相比，该优化适配体具有理想的亲和力、良好的特异性、更高的产率以及较低的合成成本；
21.(4)与筛选获得的原始β-乳球蛋白适配体相比，该优化适配体具有较强的结构稳定性，能有效降低适配体对应用环境体系的敏感性。
附图说明
22.图1为本发明中适配体序列剪裁优化流程图。
23.图2为本发明中适配体序列碱基突变位点示意图及结构强化序列二级结构示意图。
24.图3为本发明中环状适配体cb-#t4m8的两个组成单体二级结构示意图。
25.图4为本发明中环状适配体cb-#t4m8的饱和结合曲线。
26.图5为本发明中环状适配体cb-#t4m8的特异性分析。
27.图6为本发明中非变性聚丙烯酰胺电泳验证环状适配体cb-#t4m8和原始适配体lg-18被不同核酸外切酶处理后的结构稳定性。
28.图7为本发明中环状适配体cb-#t4m8在含有10％胎牛血清的deme培养基中孵育随时间变化的结构稳定性。
29.图8为本发明中原适配体lg-18在含有10％胎牛血清的deme培养基中孵育随时间变化的结构稳定性。
具体实施方式
30.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
31.下述实施例中适配体由上海生工生物工程技术服务有限公司合成5’端标记生物素标记的序列。
32.合成的适配体其5’端进行生物素化标记，用te缓冲液(10mm tris-hcl，1mm edta，ph 7.4)稀释配制成10μm溶液，贮存在-20℃下备用。亲和性和特异性测定步骤如下：
33.首先向微孔板中加入200μlβ-乳球蛋白溶液(10μg/ml)，4℃包被过夜；清洗板子，加入300μl的无蛋白封闭液在37℃，150rpm条件下封闭2h；清洗板子，加入200μl适宜浓度的生物素化适配体序列在37℃，150rpm条件下结合90min(结合缓冲液：50mm tris-hcl，5mm kcl，100mm nacl，1mm mgcl2，ph 7.4)；清洗板子，链霉亲和素-hrp在37℃，150rpm条件下结合1h。清洗板子，每孔加入100μltmb-h2o2溶液，显色15min，然后加入50μl 2m的硫酸终止显色，测450nm处吸收光。
34.亲和力测定中选取适配体终浓度分别为5、10、25、50、75、100、150和200nmol/l。梯度浓度的适配体先在95℃变性10min，随即在0℃冷却10min。同时每一梯度下做三次平行实验。利用graphpad prism 5软件计算各适配体的解离常数kd值，并绘制其饱和结合曲线。
35.特异性测定中分别选取非特异性物质溶菌酶(lys)、卵清蛋白(ova)、牛血清白蛋白(bsa)和花生过敏原arah1蛋白，按照上述实验条件分别将其固定在微孔板中，固定适配
体浓度200nm，其余流程均按照亲和性测定中方案执行。
36.实施例1适配体序列的剪裁优化
37.适配体剪裁优化流程及二级结构如图1所示。lg-18是通过selex技术筛选得到的β-乳球蛋白原始适配体序列，包含80个碱基。
38.考虑到适配体中引物区域主要是用于selex过程中pcr扩增的引物结合区域，因此首先在原始适配体序列的基础上分别或者同时剪裁掉引物区域，获得序列#t1(seq id no：2)、#t2(seq id no：3)和#t3(seq id no：4)。然而，通过检测发现序列#t1和#t3亲和性几乎消失，只有序列#t2保持了不到原始适配体序列一半的亲和性，其中序列#t2的kd值为136.8
±
42.7nm。说明原始适配体中引物区域可能参与结合过程，部分或者全部剪裁掉引物区域会大大降低适配体的亲和性。
39.因此以原始适配体lg-18中的二级结构为最小剪裁单元，获得了序列#t4(seq id no：5)、#t5(seq id no：6)和#t6(seq id no：7)。检测发现序列#t5和#t6的亲和性有轻微的下降，而序列#t4的亲和性发生一定程度提升。因此，说明原始配体序列lg-18中两个茎环结构均在结合过程中起作用，而两端的游离末端会造成一定的空间位阻。通过剪裁发现了原始适配体序列lg-18中的核心区域，确定了最优的截短序列为#t4，其亲和性kd为56.1
±
8.9nm。较原始序列的亲和性有所提高。
40.原始序列lg-18和剪裁所得适配序列的亲和力数据如表1所示。
41.表1剪裁所得适配序列亲和力数据
[0042][0043][0044]
实施例2适配体序列的结构强化
[0045]
适配体构象具有固有灵活性，因此适配体构象本质上是动态的，并且具有包含相互转换子状态的巨大构象合集。这种过度灵活的构象通常会导致结合亲和力减弱、脱靶相互作用以及对应用场景的高度敏感性，从而严重影响适配体在实际应用中的性能。因此考
虑对截短优化的适配体序列#t4进行结构强化改造，以提高适配体的应用性能。如图2所示，适配体#t4主要有两个茎环结构组成，因此其构象稳定性主要包括两部分茎和环，首先考虑通过碱基定向突变以提高茎区域的稳定性，经分析发现茎中(1)、(2)、(3)、(4)和(5)号位是茎构象不稳定的主要可能来源，因此分别对(1)、(2)、(3)、(4)和(5)进行定点突变，获得了一系列序列#t4m1(seq id no：8)、#t4m2(seq id no：9)、#t4m3(seq id no：10)、#t4m4(seq id no：11)和#t4m5(seq id no：12)。与适配体#t4相比，适配体#t4m2、#t4m4和#t4m5亲和性展示了一定程度的提高，而适配体#t4m1和#t4m3却低于#t4。说明(1)和(3)号位可能是适配体与β-乳球蛋白的主要结合位点，碱基突变后而导致亲和性下降，而(2)、(4)和(5)号位碱基突变后亲和性提升，可能是由于碱基突变导致适配体构象稳定性改善而引起的。因此同时对(2)、(4)和(5)号位碱基进行突变获得了适配体序列#t4m6(seq id no：13)，与适配体#t4、#t4m2、#t4m4和#t4m5相比，#t4m6亲和性显著提高。在适配体#t4m6序列的基础上，继续尝试稳定环状区域。通常情况下较大的发夹环内部会存在环内分子间作用力，导致构象的多样性，从而使得适配体对微环境高度敏感，因此，尝试用小而紧密的发夹gaa替代适配体#t4m6中的环，分别获得了适配体序列#t4m7(seq id no：14)、#t4m8(seq id no：15)和#t4m9(seq id no：16)，结果表明适配体#t4m8亲和性显著提升，而适配体#t4m7和#t4m9结合能力几乎丧失，说明环2参与适配体的结合，被发夹gaa替换后而出现结合能力几乎消失的情况，环1被替换后适配体亲和性显著提升，表明发夹gaa稳定构象提升了适配体的结合性能。
[0046]
结构优化所得适配序列的亲和力数据如表2所示。
[0047]
表2结构强化适配序列亲和力数据
[0048][0049]
实施例3环状适配体的设计与制备
[0050]
环状适配体因没有游离的核酸末端而使其可以免受核酸酶的降解，从而具有较高的稳定性，另一方面环状共价适配体因具有两个重复的结合单元而使得其与靶标的结合能力发生大幅度的提升。因此依据结构强化的适配体#t4m8继续设计并制备了能特异性结合β-乳球蛋白的环状适配体cb-#t4m8。如图3所示，首先通过在适配体#t4m8尾端分别添加了两个“锁链”型脚趾结构设计了环状适配体的两个单体cb-#t4m8-1(seq id no：17)和cb-#t4m8-2(seq id no：18)，然后分别在上海生工生物工程技术服务有限公司合成了5’磷酸化的cb-#t4m8-1和cb-#t4m8-2。为了制备环状适配体cb-#t4m8，先将cb-#t4m8-1和cb-#t4m8-2溶解在t4 dna ligase buffer中，浓度分别为3μm，然后95℃加热5min，然后快速冷却至16℃，形成带有两个缺口的环状适配体。然后将带有缺口的适配体与t4 dna连接酶在16℃下孵育12h以形成环状适配体cb-#t4m8。最后，将溶液在75℃下孵育10min以使连接酶变性，并通过苯酚-氯仿提取和乙醇沉淀提取的dna样品则为环状适配体cb-#t4m8。其饱和结合曲线如图4所示，kd值为5.1
±
1.2nm，亲和性较通过selex筛选获得的原始序列lg-18提高了13倍。且环状适配体cb-#t4m8仍然保持着优异的特异性(图5)。
[0051]
在cb-#t4m8的基础上经环化设计还可以得到其他适配体单体，如seq id no：19和seq id no：20，或seq id no：21和seq id no：22所示的两组适配体单体，每组适配体单体
经酶促反应可以得到环状适配体，其序列如表3所示。
[0052]
表3环状适配体/单体序列
[0053][0054][0055]
实施例4环状适配体cb-#t4m8稳定性表征
[0056]
首先，200nm环状适配体cb-#t4m8和原始适配体lg-18在10μl反应体系中分别与0.1、0.2和0.3u/μl的核酸外切酶iii(exonuclease iii，exo iii)孵育20分钟，然后75℃孵育10min以使核酸外切酶iii失活。利用15％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳验证各反应体系，如图6所示，较原始适配体lg-18，环状适配体cb-#t4m8在核酸酶存在的情形下能很好的保持其构象稳定性，也证明了本发明优化方法既提高了适配体的亲和性，也提高了适配体的结构稳定性。
[0057]
其次，200nm的环状适配体cb-#t4m8和原始适配体lg-18在含有10％胎牛血清的deme培养基中持续孵育，分别在0、1、2、4、6、12、24、36和48小时节点取样并在75℃孵育10min中处理，利用15％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳验证各时间节点的样品体系，如图7和8所示，较原始适配体lg-18，环状适配体cb-#t4m8在含有10％胎牛血清的deme培养基中能够较完整的保持其构象稳定性。
[0058]
然后，为了证明适配体经过结构强化及环化后稳定提高，且对微环境体系敏感度减低，因此，分别测定了原始适配体序列lg-18和环状适配体序列cb-#t4m8在三种不同缓冲
体系内(缓冲液1：50mm tris-hcl,5mm kcl,100mm nacl,1mm mgcl2,ph 7.4；缓冲液2：50mm tris-hcl,2.5mm kcl,50mm nacl,0.5mm mgcl2,ph 7.4；缓冲液3：50mm tris-hcl,10mm kcl,200mm nacl,2mm mgcl2,ph 7.4)与β-乳球蛋白的结合能力，如表4所示，结果表明，与原始适配体lg-18相比，环状适配体cb-#t4m8在不同缓冲液体系内保持了较为稳定的结合能力，证明其构象及性能的稳定性。
[0059]
表4环状适配体cb-#t4m8和原始适配体序列lg-18在不同缓冲体系中结合性能
[0060][0061]
实施例5
[0062]
更换实施例3中适配体#t4m8尾端结构序列，得到seq id no：19和seq id no：20，以及seq id no：21和seq id no：22所示的环状适配体单体，经酶促反应制备得到两种环状适配体，检测其稳定性，结果与实施例4相当。
[0063]
综上本发明以β-乳球蛋白为靶标，在selex筛选获得的原始序列基础上，结合剪裁、碱基突变以及结构强化等手段，获得了能以高亲和力及特异性识别结合β-乳球蛋白的优化适配体序列，该优化的适配体序列具有较高的结构稳定性，能有效降低适配体对应用环境体系的敏感性。
[0064]
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

技术特征：
1.一种特异性识别β-乳球蛋白的优化适配体，其特征在于，由β-乳球蛋白原始适配体lg-18经优化后得到，所述β-乳球蛋白原始适配体lg-18的序列如seq id no：1所示，所述优化的方式包括剪裁、碱基突变和结构优化。2.如权利要求1所述的特异性识别β-乳球蛋白的优化适配体，其特征在于，所述优化适配体的序列如seq id no：15所示。3.如权利要求1所述的特异性识别β-乳球蛋白的优化适配体，其特征在于，所述优化适配体为环状适配体，所述环状适配体由两条携带互补碱基序列的适配体单体经碱基配对后连接形成，所述适配体单体的核心序列如seq id no：15所示。4.如权利要求3所述的特异性识别β-乳球蛋白的优化适配体，其特征在于，所述两条携带互补碱基序列的适配体单体的序列如seq id no：17和seq id no：18，或seq id no：19和seq id no：20，或seq id no：21和seq id no：22所示。5.如权利要求1-4中任一项所述的特异性识别β-乳球蛋白的优化适配体，其特征在于，所述优化适配体还包括修饰物修饰。6.如权利要求5所述的特异性识别β-乳球蛋白的优化适配体，其特征在于，所述修饰物包括荧光基团、同位素、电化学标记物、酶标记物、亲和配基和巯基中一种或多种。7.一种特异性识别β-乳球蛋白的组合物，其特征在于，包括权利要求1-6中任一项所述的优化适配体。8.一种特异性识别β-乳球蛋白的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-6中任一项所述的优化适配体。9.一种特异性识别β-乳球蛋白的试纸，其特征在于，包括权利要求1-6中任一项所述的优化适配体。10.一种特异性识别β-乳球蛋白的芯片，其特征在于，包括权利要求1-6中任一项所述的优化适配体。

技术总结
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种特异性识别β-乳球蛋白的优化适配体及其应用。该优化适配体由β-乳球蛋白原始适配体Lg-18经优化后得到，所述β-乳球蛋白原始适配体Lg-18的序列如SEQ ID NO：1所示，所述优化的方式包括剪裁、碱基突变和结构优化。本发明以β-乳球蛋白为靶标，在SELEX筛选获得的原始序列基础上，结合剪裁、碱基突变以及结构强化等手段，获得了能以高亲和力及特异性识别结合β-乳球蛋白的优化适配体序列，该优化的适配体序列具有较高的结构稳定性，能有效降低适配体对应用环境体系的敏感性。应用环境体系的敏感性。应用环境体系的敏感性。


技术研发人员：段诺 齐硕 吴世嘉 王周平
受保护的技术使用者：江南大学
技术研发日：2023.03.29
技术公布日：2023/7/25