细胞结构体的冷冻方法

1.本发明涉及一种细胞结构体的冷冻方法。


背景技术：

2.作为人工地制作模仿生物体组织的结构体的方法，例如已知有下述方法等：一种制造三维组织体的方法(专利文献1)，其包含三维地配置由含有胶原蛋白的被膜涂敷的细胞、形成三维组织体的步骤；一种立体性细胞组织的制造方法(专利文献2)，其包含将细胞与阳离子性物质和细胞外基质成分混合而得到混合物，从得到的混合物收集细胞，在基材上形成细胞集合体的步骤。另外，本发明者们提出了下述方法(专利文献3)：通过使细胞与经片段化的外源性胶原蛋白接触，以较少的细胞数制造厚度为1mm以上的尺寸大的三维组织体。这些三维组织体期待可用作实验动物的替代品、移植材料等。
3.现有技术文献
4.专利文献
5.专利文献1：国际公开第2015/072164号
6.专利文献2：国际公开第2017/146124号
7.专利文献3：国际公开第2018/143286号


技术实现要素：

8.发明所要解决的课题
9.根据上述三维组织体的制造方法，能够得到作为通过细胞培养而人工地制作的细胞的集合体的细胞结构体。另一方面，尚未知将细胞结构体冷冻而维持细胞结构体原本所具有的功能和/或结构的方法。
10.本发明的目的在于提供一种即使解冻后也能充分地维持功能和/或结构的细胞结构体的冷冻方法。
11.用于解决课题的手段
12.本发明是基于下述新见解的发明：当将含有片段化细胞外基质成分、细胞和纤维蛋白且具有三维组织结构的细胞结构体冷冻时，即使解冻后也维持了细胞结构体的结构和/或功能。
13.本发明涉及一种细胞结构体的冷冻方法，其包含将含有片段化细胞外基质成分、细胞和纤维蛋白且具有三维组织结构的细胞结构体冷冻的步骤。
14.本发明的细胞结构体的冷冻方法由于包含将含有片段化细胞外基质成分、细胞和纤维蛋白且具有三维组织结构的细胞结构体冷冻的步骤，因此即使解冻后也充分地维持了细胞结构体的功能和/或结构。
15.细胞结构体可以在细胞间具有血管网。在该情况下，可更进一步显著地发挥本发明的效果。
16.细胞可以至少包含脂肪细胞。
17.本发明的细胞结构体的冷冻方法还可以进一步包含在-160℃的条件下保持细胞结构体的步骤。本发明的细胞结构体的冷冻方法还可以进一步包含将经冷冻的细胞结构体以冷冻状态保持7天以上的步骤。
18.经冷冻的细胞结构体可以在解冻后维持三维组织结构和/或功能。另外，经冷冻的细胞结构体解冻后的细胞存活数与冷冻前的细胞结构体中的细胞存活数之比可以为80％以上。
19.发明效果
20.根据本发明，能够提供即使解冻后也充分地维持功能和/或结构的细胞结构体的冷冻方法。
附图说明
21.图1是表示冷冻前(第0天)的细胞结构体的live/dead分析结果的照片，图1(a)是表示在细胞间未形成血管网的细胞结构体的结果的照片，图1(b)是表示在细胞间形成有血管网的细胞结构体的结果的照片。
22.图2是表示冷冻保存了7天或30天的细胞结构体的live/dead分析结果的照片。
23.图3是表示冷冻保存了7天或30天的细胞结构体的live/dead分析结果的照片。
24.图4是表示冷冻保存了0天、7天或30天的细胞结构体中的细胞存活数的评价结果的图表，图4(a)表示使用labobanker作为冷冻保存液时的结果，图4(b)表示使用海藻糖混合物作为冷冻保存液时的结果。
25.图5是表示对具有血管网的细胞结构体的血管连接功能进行评价的结果的照片。
26.图6是表示对含有脂肪细胞的细胞结构体的脂肪酸的摄入能力进行评价的结果的照片。
27.图7是表示含有脂肪细胞的细胞结构体(脂肪球)的dna量的测定结果的图表。
具体实施方式
28.以下，对用于实施本发明的方式详细地进行说明。但是，本发明并不限定于以下的实施方式。
29.本实施方式的细胞结构体的冷冻方法包含将含有片段化细胞外基质成分、细胞和纤维蛋白且具有三维组织结构的细胞结构体冷冻的步骤(冷冻步骤)。
30.在本说明书中，“细胞结构体”是指通过细胞培养而人工地制作的细胞的集合体(块状的细胞集团)。在本说明书中，“三维组织结构”是细胞介由细胞外基质成分三维地配置的结构。具有三维组织结构的细胞结构体的形状没有特别限制，例如可举出片状、球体状、大致球体状、椭圆体状、大致椭圆体状、半球状、大致半球状、半圆状、大致半圆状、长方体状、大致长方体状等。在此，生物体组织包含汗腺、淋巴管、脂腺等，构成比细胞结构体复杂。因此，能够容易地区分细胞结构体和生物体组织。
31.(细胞)
32.在本说明书中，“细胞”没有特别限定，例如可以是人、猴、狗、猫、兔、猪、牛、小鼠、大鼠等哺乳类动物来源的细胞。细胞的来源部位也没有特别限定，可以是骨、肌肉、内脏、神经、脑、骨、皮肤、血液等来源的体细胞，也可以是生殖细胞。此外，细胞可以是干细胞，另外，
可以是原代培养细胞、传代培养细胞及细胞株细胞等培养细胞。
33.在本说明书中，“干细胞”是指具有自我复制能力及多分化能力的细胞。干细胞中包括具有分化为任意的细胞种类的能力的多能性干细胞、和具有分化为特定的细胞种类的能力的组织干细胞(也称为体干细胞)。作为多能性干细胞，例如可举出胚胎干细胞(es细胞)、体细胞来源es细胞(ntes细胞)及人工多能性干细胞(ips细胞)。作为组织干细胞，例如可举出间充质干细胞(例如脂肪干细胞、骨髓来源干细胞)、造血干细胞及神经干细胞。作为脂肪干细胞，例如可举出人脂肪干细胞(adsc)。
34.细胞可以至少包含脂肪细胞。在本说明书中，“脂肪细胞”是指除脂肪干细胞以外的所有脂肪细胞。脂肪细胞中包括成熟脂肪细胞、和脂肪干细胞中不包括的脂肪细胞，脂肪细胞优选包含成熟脂肪细胞，更优选脂肪细胞的总细胞数中的90％以上为成熟脂肪细胞，进一步优选全部为成熟脂肪细胞。脂肪细胞例如可以使用从皮下脂肪组织和心外膜来源的脂肪组织等采集的细胞，也可以将采集的细胞(例如脂肪干细胞)分化诱导后使用。脂肪细胞没有特别限定，在将由脂肪细胞构建的脂肪组织最终选择用于生物体的特定部位的组织的情况下，优选使用与该部位的组织对应的组织来源的脂肪细胞。
35.作为表示脂肪细胞的成熟度的指标，可以使用脂肪滴的大小。脂肪滴是指储存甘油三酯(中性脂肪)、胆固醇等脂质的细胞内小器官，上述脂质类被磷脂单层膜覆盖而具有液滴样的形状。另外，在上述磷脂的表面可见脂肪组织特有的蛋白(围脂滴蛋白等)的出现。成熟的脂肪细胞的脂肪滴的大小之间存在偏差，例如，在脂肪滴的大小的平均值为20μm以上的情况下，可以认为脂肪细胞某种程度成熟即为成熟脂肪细胞。
36.脂肪细胞的含有率相对于细胞结构体中的总细胞数，例如可以为5％以上、10％以上、15％以上、20％以上、25％以上、或30％以上，且可以为95％以下、90％以下、80％以下或75％以下。
37.细胞可以进一步包含血管内皮细胞。在本说明书中，在本说明书中“血管内皮细胞”是指构成血管内腔的表面的扁平状的细胞。作为血管内皮细胞，例如可举出人脐静脉来源的血管内皮细胞(huvec)。
38.血管内皮细胞的含有率相对于细胞结构体中的总细胞数，例如可以为5％以上、10％以上、15％以上、20％以上、25％以上或30％以上，且可以为95％以下、90％以下、80％以下、或75％以下。
39.细胞可以包含脂肪细胞和血管内皮细胞。除了脂肪细胞和血管内皮细胞以外，细胞还可以进一步包含除脂肪细胞和血管内皮细胞以外的细胞。作为除脂肪细胞和血管内皮细胞以外的细胞，例如可举出成纤维细胞、软骨细胞、成骨细胞等间充质细胞、大肠癌细胞(例如人大肠癌细胞(ht29))、肝癌细胞等癌细胞、心肌细胞、上皮细胞(例如人牙龈上皮细胞)、淋巴管内皮细胞、神经细胞、树突状细胞、肝细胞、粘附性细胞(例如免疫细胞)、平滑肌细胞(例如主动脉平滑肌细胞(aorta-smc))、胰岛细胞、角化细胞(例如人表皮角化细胞)等。
40.细胞结构体中的脂肪细胞与血管内皮细胞的细胞数之比(脂肪细胞/血管内皮细胞)没有特别限制，例如可以为100/1～1/100、可以为50/1～1/50、可以为20/1～1/1、可以为10/1～1/1、可以为8/1～1/1、可以为7/1～1.2/1、可以为6/1～1.5/1、可以为5/1～2/1、也可以为3/1～2/1。
41.细胞结构体可以在细胞间具有血管网。在细胞间具有血管网的情况下，存在解冻后的细胞结构体中的细胞的存活率更进一步接近冷冻前的存活率的倾向。此外，当细胞间形成有血管网时，可期待能够长期维持细胞结构体、以及在将细胞结构体移植到哺乳类等时变得容易植入。
[0042]“在细胞间具有血管网”是指与生物体组织同样地具有按照分支的血管包围细胞的方式在细胞与细胞之间延伸的结构。关于是否形成有与生物体组织同样的血管网，例如可以基于生物体组织中的血管的分支数和/或血管的分支间的长度和/或血管的直径的多样性来判断。例如，在细胞结构体中的血管的分支数的平均值相对于生物体组织中的血管的分支数的平均值为80％以上且150％以下、85％以上且130％以下、或90％以上且120％以下的情况下，可以判断为与生物体组织中的血管的分支数类似。另外，例如，在细胞结构体中的血管的分支数的平均值为2.5以上且4.5以下、或3.0以上且4.2以下的情况下，可以判断为与生物体组织中的血管的分支数类似。例如，在细胞结构体中的血管的分支间的长度的平均值相对于生物体组织中的血管的分支间的长度的平均值为80％以上且150％以下、85％以上且130％以下、以及90％以上且120％以下的情况下，可以判断为与生物体组织中的血管的分支间的长度类似。在生物体组织中，可观察到较粗的血管及较细的血管这两者。因此，例如，在与生物体组织同样地观察到直径较粗的血管(例如10μm以上且小于25μm)和较细的血管(例如超过0μm且小于10μm)这两者的情况下，可以判断为具有与生物体组织中的血管的直径同样的多样性。另外，例如，以超过0μm且小于25μm分布有血管直径整体的60％以上、70％以上或80％以上的情况下，可以判断为具有与生物体组织中的血管的直径同样的多样性。在细胞包含脂肪细胞的情况下，细胞结构体优选在脂肪细胞间具有血管网。在该情况下，不仅具有血管网，被血管包围的脂肪细胞也优选与生物体组织接近。例如，在本实施方式的细胞结构体中的脂肪细胞的脂肪滴的大小的平均值为20μm～180μm或100μm～180μm的情况下，可以判断为细胞结构体具有与生物体组织中的脂肪细胞同样的脂肪细胞。在对上述生物体组织和细胞结构体进行比较时，以相同的条件(例如，单位规定体积，当进行图像解析时则为单位规定面积，单位规定样品等)对生物体组织和细胞结构体进行比较。
[0043]
(片段化细胞外基质成分)
[0044]
片段化细胞外基质成分可以通过将细胞外基质成分片段化而得到。在本说明书中，“细胞外基质成分”是指由多个细胞外基质分子形成的细胞外基质分子的集合体。细胞外基质是指在生物中存在于细胞外的物质。作为细胞外基质，只要不对细胞的生长及细胞集合体的形成产生不良影响，就可以使用任意的物质。作为具体例，可举出胶原蛋白、弹性蛋白、蛋白多糖、纤连蛋白、透明质酸、层粘连蛋白、波连蛋白、细胞粘合素、巢蛋白和纤维蛋白等，但并不限定于这些。细胞外基质成分可以单独使用它们中的1种，也可以组合使用。细胞外基质成分例如可以含有胶原蛋白成分，也可以是胶原蛋白成分。本实施方式中的细胞外基质成分优选为存在于动物细胞外的物质、即动物的细胞外基质成分。
[0045]
胞外基质分子只要不对细胞的生长及细胞集合体的形成产生不良影响，就可以是上述的细胞外基质分子的修饰体及突变体，也可以是化学合成肽等多肽。细胞外基质分子可以具有胶原蛋白特征性的由gly-x-y表示的序列的重复。在此，gly表示甘氨酸残基，x和y分别独立地表示任意的氨基酸残基。多个gly-x-y分别可以相同也可以不同。通过具有由
gly-x-y表示的序列的重复，对分子链的配置的束缚变少，因此，例如作为细胞培养时的支架材料的功能更为优异。在具有由gly-x-y表示的序列的重复的细胞外基质分子中，由gly-x-y表示的序列的比例在全部氨基酸序列中可以为80％以上，优选为95％以上。另外，细胞外基质分子也可以是具有rgd序列的多肽。rgd序列是指由arg-gly-asp(精氨酸残基-甘氨酸残基-天冬氨酸残基)表示的序列。通过具有rgd序列，细胞粘附得到更进一步促进，因此例如作为细胞培养时的支架材料更为合适。作为包含由gly-x-y表示的序列和rgd序列的细胞外基质分子，可举出胶原蛋白、纤连蛋白、波连蛋白、层粘连蛋白、钙黏着蛋白等。
[0046]
作为胶原蛋白，例如可举出纤维性胶原蛋白及非纤维性胶原蛋白。纤维性胶原蛋白是指成为胶原蛋白纤维的主要成分的胶原蛋白，具体而言可举出i型胶原蛋白、ii型胶原蛋白、iii型胶原蛋白等。作为非纤维性胶原蛋白，例如可举出iv型胶原蛋白。
[0047]
作为蛋白多糖，可举出硫酸软骨素蛋白多糖、硫酸肝素蛋白多糖、硫酸角质素蛋白多糖、硫酸皮肤素蛋白多糖，但并不限定于这些。
[0048]
从本发明的效果变得更为显著的角度出发，细胞外基质成分可以含有选自由胶原蛋白、层粘连蛋白及纤连蛋白组成的组中的至少1种，优选含有胶原蛋白。胶原蛋白优选为纤维性胶原蛋白，更优选为i型胶原蛋白。作为纤维性胶原蛋白，可以使用市售的胶原蛋白，作为其具体例，可举出日本ham株式会社制的猪皮来源的i型胶原蛋白。
[0049]
细胞外基质成分可以是动物来源的细胞外基质成分。作为成为细胞外基质成分的来源的动物种，例如可举出人、猪、牛等，但并不限定于这些。细胞外基质成分可以使用一种动物来源的成分，也可以并用多种动物来源的成分。
[0050]“片段化”是指使细胞外基质成分的集合体成为更小的尺寸。片段化可以在切断细胞外基质分子内的键的条件下进行，也可以在不切断细胞外基质分子内的键的条件下进行。片段化细胞外基质成分可以包含通过物理性的力的施加而对上述的细胞外基质成分进行解纤而得到的成分、即经解纤的细胞外基质成分(解纤细胞外基质成分)。解纤是片段化的一个方式，例如是在不切断细胞外基质分子内的键的条件下进行的。
[0051]
作为将细胞外基质成分片段化的方法，没有特别限制。作为对细胞外基质成分进行解纤的方法，例如可以通过超声波式均化器、搅拌式均化器、及高压式均化器等施加物理性的力而对细胞外基质成分进行解纤。在使用搅拌式均化器的情况下，可以将细胞外基质成分直接均化，也可以在生理盐水等水性介质中进行均化。另外，通过调整进行均化的时间、次数等，还可以得到毫米尺寸、纳米尺寸的解纤细胞外基质成分。解纤细胞外基质成分也可以通过反复冷冻融解进行解纤而得到。
[0052]
片段化细胞外基质成分可以至少部分包含经解纤的细胞外基质成分。另外，片段化细胞外基质成分也可以仅由经解纤的细胞外基质成分构成。即，片段化细胞外基质成分可以是经解纤的细胞外基质成分。经解纤的细胞外基质成分优选包含经解纤的胶原蛋白成分(解纤胶原蛋白成分)。解纤胶原蛋白成分优选维持来自胶原蛋白的三重螺旋结构。解纤胶原蛋白成分可以是部分地维持来自胶原蛋白的三重螺旋结构的成分。
[0053]
作为片段化细胞外基质成分的形状，例如可举出纤维状。纤维状是指由丝状的胶原蛋白成分构成的形状，或者丝状的细胞外基质成分在分子间交联而构成的形状。片段化细胞外基质成分的至少一部分可以是纤维状。纤维状的细胞外基质成分中包括多个丝状的细胞外基质分子集合而形成的细丝状物(细纤维)、细纤维进一步集合而形成的丝状物、将
这些丝状物解纤而得到的物质等。在纤维状的细胞外基质成分中，rgd序列不被破坏地得以保存。
[0054]
片段化细胞外基质成分的平均长度可以为100nm以上且400μm以下，也可以为100nm以上且200μm以下。在一个实施方式中，片段化细胞外基质成分的平均长度可以为5μm以上且400μm以下，可以为10μm以上且400μm以下，可以为22μm以上且400μm以下，也可以为100μm以上且400μm以下。在另一实施方式中，从再分散性更进一步优异的观点出发，片段化细胞外基质成分的平均长度可以为100μm以下，可以为50μm以下，可以为30μm以下，可以为15μm以下，可以为10μm以下，也可以为1μm以下，且可以为100nm以上。片段化细胞外基质成分整体中，大部分的片段化细胞外基质成分的平均长度优选在上述数值范围内。具体而言，优选片段化细胞外基质成分整体中的95％的片段化细胞外基质成分的平均长度在上述数值范围内。片段化细胞外基质成分优选为平均长度在上述范围内的片段化胶原蛋白成分，更优选为平均长度在上述范围内的解纤胶原蛋白成分。
[0055]
片段化细胞外基质成分的平均直径可以为10nm以上且30μm以下，可以为30nm以上且30μm以下，可以为50nm以上且30μm以下，可以为100nm以上且30μm以下，可以为1μm以上且30μm以下，可以为2μm以上且30μm以下，可以为3μm以上且30μm以下，可以为4μm以上且30μm以下，也可以为5μm以上且30μm以下。片段化细胞外基质成分优选为平均直径在上述范围内的片段化胶原蛋白成分，更优选为平均直径在上述范围内的解纤胶原蛋白成分。
[0056]
片段化细胞外基质成分的平均长度及平均直径可以通过利用光学显微镜测定各个片段化细胞外基质成分并进行图像解析而求出。在本说明书中，“平均长度”是指所测定的试样的长度方向的长度的平均值，“平均直径”是指与所测定的试样的长度方向正交的方向的长度的平均值。
[0057]
片段化细胞外基质成分例如可以含有片段化胶原蛋白成分，也可以由片段化胶原蛋白成分构成。“片段化胶原蛋白成分”是指将纤维性胶原蛋白成分等胶原蛋白成分片段化而得到的成分，其维持有三重螺旋结构。片段化胶原蛋白成分的平均长度优选为100nm～200μm，更优选为22μm～200μm，更进一步优选为100μm～200μm。片段化胶原蛋白成分的平均直径优选为50nm～30μm，更优选为4μm～30μm，更进一步优选为20μm～30μm。
[0058]
片段化细胞外基质成分中的至少一部分可以在分子间或分子内交联。细胞外基质成分可以在构成细胞外基质成分的细胞外基质分子的分子内或分子间交联。
[0059]
作为进行交联的方法，例如可举出通过施加热、紫外线、放射线等进行的物理交联、利用交联剂、酶反应等进行的化学交联等方法，其方法没有特别限定。从不妨碍细胞生长的观点出发，优选物理交联。交联(物理交联及化学交联)可以是介由共价键的交联。
[0060]
在细胞外基质成分包含胶原蛋白成分的情况下，交联可以在胶原蛋白分子(三重螺旋结构)之间形成，也可以在由胶原蛋白分子形成的胶原蛋白细纤维之间形成。交联可以是利用热进行的交联(热交联)。热交联例如可以通过使用真空泵在减压下进行加热处理来实施。在进行胶原蛋白成分的热交联的情况下，细胞外基质成分可以通过胶原蛋白分子的氨基与同一或其他胶原蛋白分子的羧基形成肽键(-nh-co)而交联。
[0061]
通过使用交联剂，也可以使细胞外基质成分交联。交联剂例如可以为能够使羧基与氨基交联的交联剂、或者能够使氨基彼此交联的交联剂。作为交联剂，例如从经济性、安全性及操作性的观点出发，优选醛类、碳二亚胺类、环氧化物类和咪唑系交联剂，具体而言，
可举出戊二醛、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、1-环己基-3-(2-吗啉基-4-乙基)碳二亚胺磺酸盐等水溶性碳二亚胺。
[0062]
交联度的定量可以根据细胞外基质成分的种类、进行交联的手段等适当选择。交联度可以为1％以上、2％以上、4％以上、8％以上、或12％以上，且可以为30％以下、20％以下、或15％以下。通过使交联度在上述范围内，细胞外基质分子能够适度地分散，并且干燥保存后的再分散性良好。
[0063]
在细胞外基质成分中的氨基用于交联的情况下，交联度可以基于tnbs(三硝基苯磺酸)法进行定量。基于tnbs法的交联度可以在上述的范围内。基于tnbs法的交联度是细胞外基质所具有的氨基中用于交联的氨基的比例。在细胞外基质成分包含胶原蛋白成分的情况下，优选通过tnbs法测定的交联度在上述范围内。
[0064]
交联度也可以通过对羧基进行定量来计算。例如，在水不溶性的细胞外基质成分的情况下，也可以通过tbo(甲苯胺蓝o)法进行定量。通过tbo法得到的交联度也可以在上述的范围内。
[0065]
以细胞结构体(干燥重量)为基准，上述细胞结构体中的细胞外基质成分含有率可以为0.01～90质量％、优选为10～90质量％、优选为10～80质量％、优选为10～70质量％、优选为10～60质量％、优选为1～50质量％、优选为10～50质量％、更优选为10～30质量％、更优选为20～30质量％。
[0066]
在此，“细胞结构体中的细胞外基质成分”是指构成细胞结构体的细胞外基质成分，可以来源于内源性细胞外基质成分，也可以来源于外源性细胞外基质成分。
[0067]“内源性的细胞外基质成分”是指由细胞外基质产生细胞产生的细胞外基质成分。作为细胞外基质产生细胞，例如可举出上述的成纤维细胞、软骨细胞、成骨细胞等间充质细胞。内源性细胞外基质成分可以为纤维性，也可以为非纤维性。
[0068]“外源性的细胞外基质成分”是指从外部供给的细胞外基质成分。本实施方式的细胞结构体包含作为外源性的细胞外基质成分的片段化细胞外基质成分。外源性的细胞外基质成分与作为来源的动物种的内源性的细胞外基质成分可以相同也可以不同。作为成为来源的动物种，例如可举出人、猪、牛等。另外，外源性的细胞外基质成分也可以是人工的细胞外基质成分。
[0069]
在细胞外基质成分为胶原蛋白成分的情况下，外源性的细胞外基质成分也被称为“外源性胶原蛋白成分”，是指从外部供给的胶原蛋白成分。“外源性胶原蛋白成分”是由多个胶原蛋白分子形成的胶原蛋白分子的集合体，具体地可举出纤维性胶原蛋白、非纤维性胶原蛋白等。外源性胶原蛋白成分优选为纤维性胶原蛋白。上述纤维性胶原蛋白是指成为胶原蛋白纤维主成分的胶原蛋白成分，例如可举出i型胶原蛋白、ii型胶原蛋白、iii型胶原蛋白。上述纤维性胶原蛋白可以使用市售的胶原蛋白，作为其具体例，可举出日本ham株式会社制的猪皮来源的i型胶原蛋白。作为外源性的非纤维性胶原蛋白，例如可举出iv型胶原蛋白。
[0070]
在外源性的细胞外基质成分中，所来源的动物种可以与细胞不同。另外，在细胞包含细胞外基质产生细胞的情况下，就外源性的细胞外基质成分而言，所来源的动物种可以与细胞外基质产生细胞不同。即，外源性的细胞外基质成分可以是异种细胞外基质成分。
[0071]
即，在细胞结构体包含内源性细胞外基质成分及片段化细胞外基质成分的情况
下，构成上述细胞结构体的细胞外基质成分含有率是指内源性细胞外基质成分和片段化细胞外基质成分的合计量。上述细胞外基质含有率可以根据所得到的细胞结构体的体积和经脱细胞化的细胞结构体的质量来计算。
[0072]
例如，在细胞结构体所含有的细胞外基质成分为胶原蛋白成分的情况下，作为对细胞结构体中的胶原蛋白成分量进行定量的方法，例如可举出以下那样的对羟基脯氨酸进行定量的方法。在溶解有细胞结构体的溶解液中混合盐酸(hcl)，在高温下孵育规定的时间后恢复至室温，将离心分离后的上清液稀释至规定的浓度，由此制备样品。将羟基脯氨酸标准溶液与样品同样地进行处理后，阶段性地进行稀释而制备标准溶液。对样品和标准溶液分别用羟基脯氨酸分析缓冲液和检测试剂进行规定的处理，测定570nm的吸光度。通过将样品的吸光度与标准溶液进行比较来计算胶原蛋白成分量。需要说明的是，也可以将细胞结构体直接悬浮在高浓度的盐酸中，将溶解后的溶解液离心分离而回收上清液，用于胶原蛋白成分定量。另外，所要溶解的细胞结构体可以为直接从培养液中回收的状态，也可以在回收后进行干燥处理、在除去了液体成分的状态下使其溶解。但是，在将直接从培养液中回收的状态的细胞结构体溶解而进行胶原蛋白成分定量的情况下，由于因细胞结构体所吸收的培养基成分和实验手法的问题所引起的培养基残留的影响，预测细胞结构体重量的测量值会发生偏差，因此从稳定地测量结构体的重量和每单位重量中所占的胶原蛋白成分量的观点出发，优选以干燥后的重量为基准。
[0073]
作为对胶原蛋白成分量进行定量的方法，更具体而言，例如可举出以下方法。
[0074]
(样品的制备)
[0075]
将进行了冷冻干燥处理的细胞结构体的总量与6mol/l hcl混合，用加热块在95℃下孵育20小时以上后，恢复至室温。以13000g离心分离10分钟后，回收样品溶液的上清液。在后述的测定中，用6mol/l hcl进行适当稀释以使结果收束在标准曲线的范围内后，用100μl的超纯水稀释200μl，由此制备样品。样品使用35μl。
[0076]
(标准溶液的制备)
[0077]
在螺口试管中加入125μl的标准溶液(1200μg/ml醋酸溶液)和125μl的12mol/l hcl进行混合，用加热块在95℃下孵育20小时后，恢复至室温。以13000g离心分离10分钟后，用超纯水稀释上清液，制作300μg/ml的s1，将s1阶段性地稀释，制作s2(200μg/ml)、s3(100μg/ml)、s4(50μg/ml)、s5(25μg/ml)、s6(12.5μg/ml)、s7(6.25μg/ml)。也准备仅有4mol/hcl 90μl的s8(0μg/ml)。
[0078]
(分析)
[0079]
将35μl的标准溶液和样品分别加入到平板(quickzyme total collagen assay试剂盒附带、quickzyme biosciences公司)中。将75μl的分析缓冲液(上述试剂盒附带)加入到各孔中。用密封件封闭平板，摇动20分钟，同时在室温下进行孵育。剥离密封件，将75μl的检测试剂(detection reagent：reagent a：b＝30μl：45μl，上述试剂盒附带)加入到各孔中。用密封件封闭平板，通过摇动混合溶液，在60℃下孵育60分钟。在冰上充分冷却，剥离密封件，测定570nm的吸光度。通过将样品的吸光度与标准溶液进行比较来计算胶原蛋白成分量。
[0080]
细胞结构体中所占的胶原蛋白成分也可以通过其面积比或体积比来规定。“通过面积比或体积比来规定”是指，例如在使细胞结构体中的胶原蛋白成分为能够通过已知的
染色方法(例如使用了抗胶原蛋白抗体的免疫染色、或马松三色染色)等与其他组织结构物区别的状态的基础上，使用肉眼观察、各种显微镜和图像分析软件等，计算胶原蛋白成分在整个细胞结构体中所占的存在区域的比率。在通过面积比规定的情况下，并不限定是通过细胞结构体中的怎样的截面或表面来规定面积比，例如在细胞结构体为球状体等的情况下，可以通过从其大致中心部通过的剖视图来规定。
[0081]
例如，在通过面积比规定细胞结构体中的胶原蛋白成分的情况下，其面积的比例以上述细胞结构体整体的面积为基准为0.01～99％，优选为1～99％，优选为5～90％，优选为7～90％，优选为20～90％，更优选为50～90％。“细胞结构体中的胶原蛋白成分”如上所述。构成细胞结构体的胶原蛋白成分的面积的比例是指将内源性胶原蛋白成分和外源性胶原蛋白成分合起来的面积的比例。胶原蛋白成分的面积的比例例如可以将所得到的细胞结构体用马松三色染色，作为蓝色染色的胶原蛋白成分的面积相对于从细胞结构体的大致中心部通过的截面的整体面积的比例来计算。
[0082]
细胞结构体在胰蛋白酶的浓度为0.25％、温度为37℃、ph为7.4、反应时间为15分钟的条件下进行胰蛋白酶处理后的残留率优选为70％以上，更优选为80％以上，更进一步优选为90％以上。这样的细胞结构体在培养中或培养后不易发生由酶引起的分解，是稳定的。上述残留率例如可以根据胰蛋白酶处理前后的细胞结构体的质量来计算。
[0083]
上述细胞结构体在胶原蛋白酶的浓度为0.25％、温度为37℃、ph为7.4、反应时间为15分钟的条件下进行胶原蛋白酶处理后的残留率可以为70％以上，更优选为80％以上，更进一步优选为90％以上。这样的细胞结构体不易在培养中或培养后发生由酶引起的分解，是稳定的。
[0084]
本实施方式的细胞结构体例如可以通过包含培养工序的方法来制造，所述培养工序中，在纤维蛋白存在下培养片段化细胞外基质成分所接触的细胞。
[0085]
在培养工序前可以进一步包含使片段化细胞外基质成分与细胞接触的接触工序。
[0086]
在接触工序中，可以在水性介质中使细胞外基质成分与细胞接触。片段化细胞外基质成分通过分散在水性介质中，在水性介质中变得容易与细胞接触，能够促进细胞结构体的形成。作为接触工序，可举出将含有片段化细胞外基质成分的水性介质与含有细胞的水性介质混合的方法、在含有片段化细胞外基质成分的水性介质中添加细胞的方法、在含有细胞的培养液中加入含有细胞外基质成分的水性介质的方法、在含有细胞外基质细胞外基质成分的水性介质中加入细胞的方法、在预先准备的水性介质中分别加入细胞外基质成分及细胞的方法等方法，但不限于这些。
[0087]
接触工序中的片段化细胞外基质成分的浓度可以根据目标细胞结构体的形状、厚度、培养器的尺寸等适当决定。例如，接触工序中的水性介质中的片段化细胞外基质成分的浓度可以为0.1～90质量％，也可以为1～30质量％。
[0088]
接触工序中的片段化细胞外基质成分的量例如相对于1.0
×
106cells的细胞可以为0.1～100mg、0.5～50mg、0.8～25mg、1.0～10mg、1.0～5.0mg、1.0～2.0mg、或1.0～1.8mg，可以为0.7mg以上、1.1mg以上、1.2mg以上、1.3mg以上或1.4mg以上，且可以为7.0mg以下、3.0mg以下、2.3mg以下、1.8mg以下、1.7mg以下、1.6mg以下或1.5mg以下。
[0089]
在接触工序中，片段化细胞外基质成分与细胞的质量比(片段化细胞外基质成分/细胞)优选为1/1～1000/1，更优选为9/1～900/1，进一步优选为10/1～500/1。
[0090]
细胞结构体的制造方法的一个实施方式在接触工序、或接触工序后且培养工序前可以包含将纤维蛋白原和凝血酶同时或分别混合的步骤。通过将纤维蛋白原和凝血酶混合，它们将反应而形成纤维蛋白。
[0091]
在接触工序后且培养工序前还可以包含使水性介质中的片段化细胞外基质成分与细胞一起沉降的工序。通过进行这样的工序，细胞结构体中的片段化细胞外基质成分及细胞的分布变得更为均匀。作为具体的方法，没有特别限制，例如可举出对含有片段化细胞外基质成分和细胞的培养液进行离心操作的方法。
[0092]
对片段化细胞外基质所接触的细胞进行培养的方法没有特别限制，可以根据所培养的细胞的种类通过适当的培养方法进行。例如，培养温度可以为20℃～40℃，也可以为30℃～37℃。培养基的ph可以为6～8，也可以为7.2～7.4。培养时间可以为1天～2周，也可以为1周～2周。
[0093]
片段化细胞外基质所接触的细胞的培养中使用的培养器(支撑体)没有特别限制，例如可以是孔插件、低吸附平板、具有u字或v字等底面形状的平板。可以将上述细胞在粘附于支撑体的状态下进行培养，也可以将上述细胞在不粘附于支撑体的状态下进行培养，也可以在培养中途从支撑体分离而进行培养。在将上述细胞在不粘附于支撑体的状态下进行培养的情况下、或在培养中途从支撑体分离而进行培养的情况下，优选使用抑制细胞对支撑体的粘附的具有u字或v字等底面形状的平板、低吸附平板。
[0094]
培养基没有特别限制，可以根据所培养的细胞的种类选择适当的培养基。作为培养基，例如可举出eagle’s mem培养基、dmem、modified eagle培养基(mem)、minimum essential培养基、rpmi、及glutamax培养基等。培养基可以是添加有血清的培养基，也可以是无血清培养基。培养基可以是混合两种培养基而成的混合培养基。
[0095]
培养工序中的培养基中的细胞密度可以根据目标细胞结构体的形状、厚度、培养器的尺寸等适当确定。例如，培养工序中的培养基中的细胞密度可以为1～108cells/ml，也可以为103～107cells/ml。另外，培养工序中的培养基中的细胞密度也可以与接触工序中的水性介质中的细胞密度相同。
[0096]
(纤维蛋白)
[0097]
本实施方式的细胞结构体含有纤维蛋白。纤维蛋白是凝血酶作用于纤维蛋白原而从aα链、bβ链的n末端释放a链、b链而产生的成分。纤维蛋白是聚合物，通常不溶于水。纤维蛋白是通过使纤维蛋白原与凝血酶接触而形成的。
[0098]
相对于片段化细胞外基质成分100质量份，纤维蛋白的含量可以为3质量份以上或10质量份以上，且可以为50质量份以下或30质量份以下。
[0099]
上述细胞结构体的厚度优选为10μm以上，更优选为100μm以上，进一步优选为1000μm以上。这样的细胞结构体是更接近生物体组织的结构，适合作为实验动物的替代品和移植材料。对细胞结构体的厚度的上限没有特别限制，例如可以为10mm以下，可以为3mm以下，可以为2mm以下，可以为1.5mm以下，也可以为1mm以下。
[0100]
在此，“细胞结构体的厚度”在细胞结构体为片状或长方体状的情况下，是指与主面垂直的方向上的两端的距离。在上述主面存在凹凸的情况下，厚度是指上述主面的最薄部分的距离。
[0101]
另外，在细胞结构体为球体状或大致球体状的情况下，细胞结构体的厚度是指其
直径。另外，在细胞结构体为椭圆体状或大致椭圆体状的情况下，细胞结构体的厚度是指其短径。在细胞结构体为大致球体状或大致椭圆体状且表面存在凹凸的情况下，细胞结构体的厚度是指从细胞结构体的重心通过的直线与上述表面交叉的2点间的距离中的最短的距离。
[0102]
在冷冻步骤中，使细胞结构体冷冻。细胞结构体例如可以在收容于保存容器的状态下冷冻。作为保存容器，可以使用市售的各种保存容器。保存容器例如可以使用低温管。
[0103]
细胞结构体可以与冷冻保护剂一起冷冻。作为冷冻保护剂，例如可举出二甲基亚砜(dmso)、甘油、聚乙二醇、丙二醇、甘油、聚乙烯吡咯烷酮、山梨糖醇、葡聚糖、海藻糖等。细胞结构体可以与含有冷冻保护剂的冷冻保存液一起冷冻。冷冻保存液例如可以使用市售的冷冻保护剂。作为市售的冷冻保存液，可举出例如labobanker(商品名，tosc株式会社制)等。例如，也可以使用海藻糖、二甲基亚砜和胎牛血清(fbs)的混合物作为冷冻保存液。
[0104]
使细胞结构体冷冻的方法没有特别限制，例如可以通过慢速冷冻(slow freezing)来实施。细胞结构体可以通过保管于冷冻机内来冷冻。
[0105]
本实施方式的细胞结构体的冷冻方法可以包含在规定的冷冻温度下保持细胞结构体的步骤。冷冻温度也可以逐渐或阶段性地降低。冷冻温度例如为能够冷冻细胞的温度，可以为-80℃以下或-160℃以下，可以为-160℃。冷冻温度的下限值没有特别限定，例如可以为-210℃以上。从更显著地发挥本发明的效果的观点出发，本实施方式的细胞结构体的冷冻方法可以包含在-160℃的条件下保持细胞结构体的步骤。冷冻温度例如是冷冻机的设定温度。
[0106]
在冷冻步骤中，也可以依次包含在第一冷冻温度下保持细胞结构体的步骤、和在比第一冷冻温度低的温度即第二冷冻温度下保持细胞结构体的步骤。第一冷冻温度例如可以为-60～-100℃，也可以为-80℃。第二冷冻温度例如可以为-140℃～-180℃，也可以为-160℃。
[0107]
本实施方式的细胞结构体的冷冻方法可以包含以冷冻状态保持经冷冻的细胞结构体的步骤。将经冷冻的细胞结构体以冷冻状态保持的期间(冷冻期间)例如可以为7天以上、30天以上、或180天以上。冷冻期间的上限没有特别限制，例如可以为360天以下。
[0108]
根据一个实施方式的细胞结构体的冷冻方法，经冷冻的细胞结构体解冻后维持了三维组织结构和/或功能。三维组织结构可以是细胞结构体的形状、血管网。细胞结构体的功能可以是血管连接功能、在为包含脂肪细胞的细胞结构体的情况下可以是脂肪酸的摄入能力、代谢功能、规定的生物因子的分泌功能等。例如解冻后，在具有与冷冻前相同或大致相同的形状的情况下，判断为维持了三维组织结构。
[0109]
将经冷冻的细胞结构体解冻的方法例如可举出浸渍于加温后的水性介质(例如培养基)的方法、从保存容器的外侧进行加温的方法、或将它们组合而成的方法。也可以在将经冷冻的细胞结构体解冻之前，根据需要对所要解冻的细胞结构体进行清洗。清洗例如可以使用生理缓冲液(例如pbs)等进行。
[0110]
进行浸渍的水性介质的温度例如可以为4℃～50℃、30℃～40℃、或36℃～38℃。解冻时间例如可以为3分钟以内或1分钟以内。
[0111]
在本实施方式的细胞结构体的冷冻方法中，经冷冻的细胞结构体解冻后的细胞存活数(x1)与进行冷冻前的细胞结构体中的细胞存活数(x0)之比(x1/x0)可以为80％以上。x1/
x0可以通过实施例中记载的方法进行测定。
[0112]
在一个实施方式中，除了上述的冷冻步骤以外还包含将经冷冻的细胞结构体以冷冻状态保持的步骤的方法也可以称为细胞结构体的冷冻保存方法。
[0113]
实施例
[0114]
以下，基于实施例对本发明更具体地进行说明。但是，本发明并不限定于以下的实施例。
[0115]
通过在200℃下对猪皮来源的胶原蛋白i型海绵片段(日本ham株式会社制)100mg进行24小时加热，得到至少一部分交联的胶原蛋白成分(交联胶原蛋白成分)。需要说明的是，在200℃的加热前后，胶原蛋白在外观上没有确认到大的变化。将50mg的交联胶原蛋白成分放入15ml试管中，加入5ml的超纯水，使用均化器(as one公司vh-10)进行6分钟的均化，由此对交联胶原蛋白成分进行解纤。
[0116]
在21℃的条件下，以10000rpm离心10分钟。抽吸上清液，将胶原料粒与5ml的新的超纯水混合，制作胶原蛋白溶液。在将装有胶原蛋白溶液的试管维持在冰上的状态下，使用超声发生器(sonics and materials公司vc50)以100v进行20秒的超声波处理，从超声发生器取出后将装有胶原蛋白溶液的试管在冰上冷却10秒，反复进行100次。进行100次超声波处理后，用孔径为40μm的过滤器过滤胶原蛋白溶液，得到含有经解纤的胶原蛋白成分(cmf)的分散液。通过利用常规方法使分散液冷冻干燥，得到干燥体形式的解纤胶原蛋白成分(cmf)。cmf的平均长度(长度)为14.8
±
8.2μm(n＝20)。
[0117]
在细胞结构体的制作中使用的细胞、试剂及制作方法等如下所述。
[0118]
(细胞和胶原蛋白)
[0119]
·
用于得到原代人成熟脂肪细胞和人脂肪干细胞(adsc)的人脂肪组织(大腿来源)(由京都府立医科大学附属医院提供)
[0120]
·
人脐静脉来源的血管内皮细胞(huvec)(lonza公司制#c-2517a)
[0121]
(试剂)
[0122]
·
牛胰腺来源的胰岛素(sigma公司#i1882)
[0123]
·
牛血浆来源的凝血酶冷冻干燥粉末(sigma公司#t4648)
[0124]
·
溶组织棱状芽胞杆菌(clostridium histolyticum)来源的胶原蛋白酶i型(sigma公司#c0130)
[0125]
·
牛血浆来源的纤维蛋白原i-s型(sigma公司#f8630)
[0126]
·
dmem(高葡萄糖、nacalai tesque公司)
[0127]
·
egm-2mv bulletkit with growth factors(lonza公司制#c-2517a)
[0128]
(培养基和各种溶液)
[0129]
·
egm-2培养基：在500ml的ebm-2中混合egm-2supplement growth factors，在4℃下保存而得到的物质。
[0130]
·
10mg/ml胰岛素储备溶液：将上述牛胰腺来源的胰岛素100mg溶解于用水稀释了的1％冰醋酸溶液(ph≤2)10ml中，等量分注到eppendorf管中，在-20℃下保存而得到的物质。
[0131]
·
2mg/ml胶原蛋白酶溶液：预先将bsa 2.5g与dmem(0％fbs，1％抗生素)50ml混合。为了消化6孔平板全部的脂肪组织，使用将胶原蛋白酶i型26mg与dmem(0％fbs、5％bsa、
1％抗生素)13ml混合并用孔径为0.2μm的过滤器过滤而得到的物质。
[0132]
·
50mg/ml纤维蛋白原储备溶液：将50mg的纤维蛋白原称取到eppendorf管中，立即加入dmem(0％fbs，1％抗生素)1ml。手动摇管混合后，在37℃的水浴中放置3～5分钟，用孔径为0.2μm的过滤器过滤，等量分注到eppendorf管中后使用。
[0133]
·
202u/ml凝血酶储备溶液：将凝血酶202u称取到eppendorf管中，立即加入dmem(0％fbs，1％抗生素)1ml，在37℃的水浴中放置3～5分钟使其溶解。然后，用孔径为0.2μm的过滤器过滤，等量分注到eppendorf管中后使用。
[0134]
(制作方法)
[0135]
将人脂肪组织片段用含有5％抗生素的pbs清洗。将4～6g组织分到6孔平板的6个孔中。在2mg/ml胶原蛋白酶溶液2ml中使用剪刀和镊子细切成约1～3mm的尺寸。在37℃和230rpm下孵育1小时后，用10ml移液管混合30分钟。用孔径为500μm的铁网过滤器过滤溶解物，每1孔添加2ml的dmem，回收全部经消化的细胞后，在室温(15～25℃)下以200g离心3分钟。成熟脂肪细胞包含在上层黄色的油性层中，脂肪干细胞和血细胞包含在料粒中。使用长针及10ml注射器，对上层与下层之间的介质进行抽吸及废弃，用25ml的pbs(5％bsa、1％抗生素)对上层中所含的成熟脂肪细胞和下层中所含的脂肪干细胞和血细胞进行两次清洗。在进行清洗时，与上述同样地进行离心，由此分离为上层、下层、以及上层与下层之间的介质这3层，对上层与下层之间的介质进行抽吸及废弃。进行两次清洗后，用25ml的dmem清洗。
[0136]
仅采集包含成熟脂肪细胞的上层，分注到eppendorf管中。通过hoechst染色对核进行染色(稀释1000倍后的hoechst、染色15分钟)，使用荧光显微镜，在turker burk血细胞计数器上对细胞数进行计数。
[0137]
将包含adsc的料粒悬浮于dmem 10ml中，接种于10cm培养皿内，进行传代培养。使用胰蛋白酶/edta将adsc从培养皿中分离，悬浮于dmem 1ml中，对细胞数进行计数。
[0138]
将由lonza公司购入的huvec悬浮于dmem 10ml，接种于10cm培养皿内，进行传代培养。使用胰蛋白酶/edta将huvec从培养皿中分离，悬浮于dmem 1ml中，对细胞数进行计数。
[0139]
《细胞结构体的制作》
[0140]
制造例1
[0141]
称取1mg的cmf，添加dmem 100μl，温和地进行混合直至仅观察到cmf的小的粒子。在室温下以10000rpm离心1分钟，抽吸上清液，得到cmf粒料。将250000cells的adsc和125000cells的huvec(adsc：huvec＝2：1)温和地添加到cmf粒料上，不混合，在室温下以3500rpm离心1分钟，抽吸上清液。添加0.3mg的纤维蛋白原(50mg/ml纤维蛋白原储备溶液6μl)，与细胞及cmf温和地混合。进一步添加300000cells的成熟脂肪细胞温和地进行混合。根据需要添加少量的dmem，将总量调整为70μl。立即添加0.15u的凝血酶(202u/ml凝血酶储备溶液0.71μl)，混合后，将混合物缓慢接种到放置在6孔平板上的6孔转接头上的transwell中。
[0142]
在37℃的孵育器中孵育1小时使其凝胶化，添加含有最终浓度为10μg/ml的胰岛素的egm-2培养基12ml。每2～3天更换12ml的培养基至培养第7天。由此，得到含有cmf、脂肪细胞、血管内皮细胞和纤维蛋白的细胞结构体。该细胞结构体为大致球状、且在细胞间具有血管网。
[0143]
制造例2
[0144]
总细胞数保持原样，使用使细胞全部为成熟脂肪细胞的混合物，除此以外，与制造例1同样地操作，得到含有cmf、脂肪细胞和纤维蛋白的细胞结构体。该细胞结构体为大致球状。
[0145]
＜评价方法＞
[0146]
对于通过上述方法制造的细胞结构体，使用live/dead(注册商标)存活率分析试剂盒(molecular probes(注册商标)、thermofisher scientific、whaltam、马萨诸塞州、美国)对冷冻前后的细胞结构体中的细胞存活率进行定量。用pbs对作为评价细胞存活率的对象的细胞结构体进行1次清洗后，在暗处于37℃下，用钙黄绿素和乙锭均二聚物-1染色45分钟。使用落射荧光共焦定量图像细胞仪cq1对染色后的细胞结构体进行图像化。在使样品间的测定条件及顺序一致后，一边对各样品和时间维持相同的曝光时间和激发输出，一边执行使用了最大强度投影法(maximum intensity projection)的zstack，得到评价结果。计算各染色的百分比，将imagej软件用于投影的分析。
[0147]
将细胞结构体加入到以下所示的冷冻保存液中。
[0148]
labobanker(tosc株式会社)
[0149]
6％海藻糖、4％dmso和90％fbs的混合物(以下也称为“海藻糖混合物”)。
[0150]
将包含细胞结构体和冷冻保存液的试管移至可进行控制的慢速冷冻(1-2℃/分钟)的冷冻容器内，在-80℃放置48小时。然后，将试管放入深冷管(日本freezer、大阪、日本)中，在-160℃下保存。保存起7天后和30天后，将经冷冻的细胞结构体在温pbs中洗涤后，添加到37℃的dmem中并保持60分钟进行解冻。接着，在含有live/dead分析试剂的温pbs中孵育45分钟，评价细胞存活率。
[0151]
使用落射荧光共焦定量图像细胞仪cq1，得到live/dead图像。在使样品间的测定条件及顺序一致后，一边对各样品和时间维持相同的曝光时间和激发输出，一边执行使用了最大强度投影法(maximum intensity projection)的zstack，得到评价结果。将imagej软件用于投影图像的分析，计算各染色的百分比。
[0152]
对于功能评价，使用了在深冷器中冷冻保存30天后解冻的细胞结构体。将解冻后的细胞结构体中的4个与含有10μg/ml胰岛素的egm-2培养基一起放入24孔板(ez-bind shut(商标)ii平底)中的相同孔中，每隔2-3天进行培养基更换。将解冻后的细胞结构体培养7天后，确认细胞结构体是否在细胞结构体之间融合。对于血管系统的结合，通过基于nilered脂质染色以及基于hoechst的对比染色、和cd31免疫染色进行评价。
[0153]
为了进行脂肪细胞对脂肪酸摄入的监测，首先，将大致球状的细胞结构体在仅含有1％bsa而不含葡萄糖和fbs的dmem培养基中培养6小时，使其成为饥饿状态。
[0154]
接着，用10μg/ml的胰岛素向培养基中用60分钟添加4μm的荧光标记脂肪酸类似物、bodipy(商标)500/510c1、c12，诱导脂肪酸的摄入。脂肪酸的摄入通过基于hoechst和碘化丙啶(pi)的对比染色进行评价。
[0155]
在37℃的条件下，使用共焦定量图像细胞仪cq1对存活的细胞进行图像化。在使样品间的测定条件及顺序一致后，一边对各样品和时间维持相同的曝光时间和激发输出，一边执行使用了最大强度投影法(maximum intensity projection)的zstack，得到评价结果。
[0156]
＜评价结果＞
[0157]
图1～3是表示使用了制造例1和制造例2的细胞结构体的live/dead分析的结果的图。图1是表示使用了冷冻前(第0天)的细胞结构体的评价结果的显微镜照片。图1(a)表示含有cmf、脂肪细胞和纤维蛋白且不具有血管网的细胞结构体(制造例2)的结果，图1(b)表示含有cmf、脂肪细胞、血管内皮细胞和纤维蛋白且具有血管网的细胞结构体(制造例1)的结果。图2和3是表示使用labobanker或海藻糖混合物作为冷冻保存液，冷冻保存7天或30天后的细胞结构体的评价结果的显微镜照片，图2和图3分别表示制造例2和制造例1的细胞结构体的结果。
[0158]
如图1～3所示，在制造例1和制造例2的任一细胞结构体中均确认到即使在冷冻保存并解冻后，也维持了三维组织结构(大致球体状的形状)，细胞结构体中的细胞存活。
[0159]
图4(a)和图4(b)是表示0天、7天和30天各个冷冻保存期间的制造例1的细胞结构体中的细胞存活率的结果的图表。图4(a)表示使用了labobanker作为冷冻保存液时的结果，图4(b)表示使用海藻糖混合物作为冷冻保存液时的结果。图4(a)及图4(b)中的图表的结果表示平均值
±
标准差。测定针对每个样品实施n＝4～6的图像。
[0160]
如图4所示，即使在冷冻保存7天和30天的情况下，制造例1的细胞结构体也显示出高的细胞存活率。关于细胞结构体中的细胞存活率，在冷冻保存后与冷冻保存前(第0天)之间没有显著性差异。
[0161]
通过使用sdsc和huvec作为细胞结构体中的细胞，显示出获得了冷冻保存后的组织的存活率进一步改善的效果。
[0162]
图5和图6是表示确认是否维持了冷冻保存后的细胞结构体的功能性、特别是冷冻保存后的成熟脂肪细胞的功能的结果的图。
[0163]
图5是表示冷冻保存30天、然后解冻后，对将多个细胞结构体在相同的孔中培养7天而得到的试样进行基于nilered及cd31的免疫染色的结果的图像。如图5所示，即使在30天的冷冻保存后，在1周的期间，在相同的孔内培养多个细胞结构体的情况下也确认到细胞结构体的融合能力。另外，还确认到细胞结构体彼此的血管系统的结合。
[0164]
图6是表示利用hoechst和碘化丙啶(pi)进行了对比染色的细胞结构体，使用bodipy(商标)500/510c1、c12对胰岛素导入后的成熟脂肪细胞中的脂肪酸摄入进行功能评价的结果的照片。评价中，对n＝4个细胞结构体/孔和每个条件实施3个试样。
[0165]
图6是在胰岛素导入后，使用经荧光标记的脂肪酸十二烷酸(c
12h24
o2)类似物(bodipy
tm 500/510c1、c12)对作为成熟脂肪细胞的功能之一的脂肪酸的摄入进行监测的结果，在该非侵袭性分析中，评价60分钟后的单房性细胞内脂质小泡中的脂肪酸蓄积。
[0166]
上述的结果表示，为了提供能够用于根据容量损失的结果对通过之后的注射注入的移植片容量进行再调整的储备，有能够保存用于通过1次脂肪抽吸手术构建的患者的脂肪细胞组织结构体的可能性。
[0167]
如图7所示，启示了dna量不会随冷冻保存期间(0天、7天和30天)发生变化，即品质得以维持。关于dna量不发生变化，没有冷冻保存液引起的差异，使用海藻糖混合物和labobanker液均显示出同样的结果。

技术特征：
1.一种细胞结构体的冷冻方法，其包含将含有片段化细胞外基质成分、细胞和纤维蛋白且具有三维组织结构的细胞结构体冷冻的步骤。2.根据权利要求1所述的细胞结构体的冷冻方法，其中，所述细胞结构体在细胞间具有血管网。3.根据权利要求1或2所述的细胞结构体的冷冻方法，其中，所述细胞至少包含脂肪细胞。4.根据权利要求1～3中任一项所述的细胞结构体的冷冻方法，其包含在-160℃的条件下保持所述细胞结构体的步骤。5.根据权利要求1～4中任一项所述的细胞结构体的冷冻方法，其包含将经冷冻的所述细胞结构体以冷冻状态保持7天以上的步骤。6.根据权利要求1～5中任一项所述的细胞结构体的冷冻方法，其中，经冷冻的所述细胞结构体解冻后维持了所述三维组织结构和/或功能。7.根据权利要求1～6中任一项所述的细胞结构体的冷冻方法，其中，经冷冻的所述细胞结构体解冻后的细胞存活数与进行冷冻前的所述细胞结构体中的细胞存活数之比为80％以上。

技术总结
本发明涉及一种细胞结构体的冷冻方法，其包含将含有片段化细胞外基质成分、细胞和纤维蛋白且具有三维组织结构的细胞结构体冷冻的步骤。步骤。


技术研发人员：松崎典弥 F
受保护的技术使用者：凸版印刷株式会社 京都府公立大学法人
技术研发日：2021.10.15
技术公布日：2023/7/25