一种猪轮状病毒的抗原组合及其应用

1.本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种猪轮状病毒的抗原组合及其应用。


背景技术：

2.猪轮状病毒(porcine rotavirus，porv)是引起幼龄仔猪发生急性腹泻脱水的主要病原之一，近些年，猪轮状病毒感染呈世界流行，各国猪场中porv的阳性率呈明显走高趋势，报道最高感染率可达70％以上，仅次于猪流行性腹泻病毒(pedv)，给养猪业健康发展造成更大威胁。疫苗接种是最有效、最经济的防控措施，国内市售的商品化疫苗仅有中国农科院哈尔滨兽医研究所研制的猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻与猪轮状病毒(g5型)三联活疫苗。
3.轮状病毒由内衣壳蛋白(vp1、vp2、vp3和vp6)、外衣壳蛋白(vp7和vp4)和非结构蛋白(nsp1、nsp2、nsp3、nsp4和nsp5)11种蛋白组装而成。根据vp6可将轮状病毒可以分为12群，其中以a群轮状病毒感染最为普遍。根据vp7和vp4可将a群再分为众多血清型，即42种g型和58种p型。已有流行病学数据显示，g9已经替代g5成为优势流行血清型且p7和p23血清型占优势流行血清型65％以上。由于porv血清型种类多，不同血清型之间交叉保护效果差，因此迫切需要开发一种针对流行毒株的多价疫苗。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种猪轮状病毒的抗原组合及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明发现利用该抗原组合制备得到的疫苗可以有效诱导动物产生良好的体液免疫及细胞免疫。
5.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
6.本发明提供一种猪轮状病毒的抗原组合，所述抗原组合包括p7型vp4蛋白和p23型vp4蛋白，所述p7型vp4蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示，所述p23型vp4蛋白的氨基酸序列如seq id no.4所示。
7.本发明还提供一种编码上述的抗原组合的基因组合，包括核苷酸序列分别如seq id no.1和seq id no.3所示的基因。
8.本发明还提供一种重组质粒组合，包括表达p7型vp4蛋白的重组质粒和表达p23型vp4蛋白的重组质粒；表达p7型vp4蛋白的重组质粒包括如seq id no.1所示的基因；表达p23型vp4蛋白的重组质粒包括如seq id no.3所示的基因。
9.本发明还提供一种重组微生物菌株组合，包括表达p7型vp4蛋白的重组微生物菌株和表达p23型vp4蛋白的重组微生物菌株；表达p7型vp4蛋白的重组微生物菌株包括如seq id no.1所示的基因；表达p23型vp4蛋白的重组微生物菌株包括如seq id no.3所示的基因。
10.本发明还提供上述的抗原组合、基因组合、重组质粒组合或重组微生物菌株组合
在制备猪轮状病毒疫苗中的应用。
11.进一步地，所述猪轮状病毒为g9型a群猪轮状病毒。
12.本发明还提供一种猪轮状病毒蛋白疫苗，其特征在于，上述的抗原组合。
13.进一步地，所述猪轮状病毒蛋白疫苗还包括药学上可接受的辅料。
14.进一步地，所述辅料包括疫苗佐剂。
15.本发明还提供一种猪轮状病毒dna疫苗，包括上述的基因组合、重组质粒组合或重组微生物菌株组合。
16.本发明公开了以下技术效果：
17.本发明成功构建了pcold-sumo-p7型vp4和pcold-sumo-p23型vp4重组表达质粒，获得了原核表达菌株，并成功诱导vp4蛋白的表达，经纯化后获得了大量的vp4蛋白，纯度≥90％，浓度不低于10mg/ml。
18.本发明以正在呈上升趋势流行的两种血清型猪轮状病毒的p7型vp4和p23型vp4为抗原免疫动物，结果显示，vp4蛋白具有良好的免疫原性，两种蛋白混合形成的二价亚单位疫苗效果优于p7型vp4或p23型vp4单独作为免疫原产生的免疫效果，二价亚单位疫苗可以有效诱导动物产生良好的体液免疫及细胞免疫。
附图说明
19.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
20.图1为pcold-sumo-p7型vp4质粒双酶切鉴定结果；m：dl10000 dna marker；1：pcold-sumo载体双酶切；2：pcold-sumo-p7型vp4重组质粒双酶切；
21.图2为pcold-sumo-p23型vp4质粒双酶切鉴定结果；m：dl10000 dna marker；1：pcold-sumo载体双酶切；2：pcold-sumo-p23型vp4重组质粒双酶切；
22.图3为重组蛋白诱导表达情况；其中，a：sumo蛋白诱导表达结果；b：p7型vp4蛋白诱导表达结果；c：p23型vp4蛋白诱导表达结果；1，5，9：未诱导全菌裂解产物；2，6，10：诱导后全菌裂解产物；3，7，11：诱导后全菌裂解离心后的沉淀；4，8，12：诱导后全菌裂解离心后的上清；
23.图4为sumo载体蛋白纯化结果；m：蛋白marker；1：蛋白原液；2：流穿蛋白；3-6：洗脱目的蛋白；
24.图5为p7型vp4蛋白纯化结果；m：蛋白marker；1：蛋白原液；2：流穿蛋白；3-6：洗脱目的蛋白；
25.图6为p23型vp4蛋白纯化结果；m：蛋白marker；1：蛋白原液；2：流穿蛋白；3-6：洗脱目的蛋白；
26.图7为重组蛋白超滤结果；其中，a：sumo载体蛋白；b：p7型vp4蛋白；c：p23型vp4蛋白；m：蛋白marker；1：纯化蛋白未超滤；2：纯化蛋白超滤后；
27.图8为重组蛋白western blot鉴定结果；其中，m：蛋白marker；1：sumo鉴定；2：p7型vp4鉴定；3：p23型vp4鉴定；
28.图9为以猪轮状病毒g9p7型(nj2012)为靶病毒检测中和抗体的结果(*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.01)；其中，a：实验组(p7-25、p7-100、p23-25、p23-100、p7-p23)和载体蛋白组(sumo)比较；b：蛋白单独免疫组(p7-25、p7-100、p23-25、p23-100)和混合免疫组(p7-p23)比较；
29.图10为猪轮状病毒g9p23型(ahfy2022)为靶病毒检测中和抗体的结果(*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.01)；其中，a：实验组(p7-25、p7-100、p23-25、p23-100、p7-p23)和载体蛋白组(sumo)比较；b：蛋白单独免疫组(p7-25、p7-100、p23-25、p23-100)和混合免疫组(p7-p23)比较；
30.图11为猪轮状病毒g9p7型(nj2012)和g9p23型(ahfy2022)为靶病毒分别检测仔猪中和抗体的结果；
31.图12为淋巴细胞增殖指数(*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.01)；其中，a：实验组(p7-25、p7-100、p23-25、p23-100、p7-p23)和载体蛋白组(sumo)比较；b：蛋白单独免疫组(p7-25、p7-100、p23-25、p23-100)和混合免疫组(p7-p23)比较；
32.图13为免疫小鼠脾细胞上清中ifn-λ(a-b)和il-4(c-d)含量(*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.01)；其中，a：实验组(p7-25、p7-100、p23-25、p23-100、p7-p23)和载体蛋白组(sumo)比较；b：蛋白单独免疫组(p7-25、p7-100、p23-25、p23-100)和混合免疫组(p7-p23)比较；c：实验组(p7-25、p7-100、p23-25、p23-100、p7-p23)和载体蛋白组(sumo)比较；d：蛋白单独免疫组(p7-25、p7-100、p23-25、p23-100)和混合免疫组(p7-p23)比较；
33.图14为免疫小鼠cd3
+
cd4
+
t淋巴细胞比例分析(*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.01)；其中，a：实验组(p7-25、p7-100、p23-25、p23-100、p7-p23)和载体蛋白组(sumo)比较；b：蛋白单独免疫组(p7-25、p7-100、p23-25、p23-100)和混合免疫组(p7-p23)比较；
34.图15为免疫小鼠cd3
+
cd8
+
t淋巴细胞流式分析结果；其中，a：pbs组；b：sumo组；c：p7-25组；d：p7-100组；e：p23-25组；f：p23-100组；g：p7-p23组；
35.图16为免疫小鼠cd3
+
cd8
+
t淋巴细胞比例分析(*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.01)；其中，a：实验组(p7-25、p7-100、p23-25、p23-100、p7-p23)和载体蛋白组(sumo)比较；b：蛋白单独免疫组(p7-25、p7-100、p23-25、p23-100)和混合免疫组(p7-p23)比较；
36.图17为免疫小鼠cd3
+
cd8
+
t淋巴细胞流式分析结果；其中，a：pbs组；b：sumo组；c：p7-25组；d：p7-100组；e：p23-25组；f：p23-100组；g：p7-p23组。
具体实施方式
37.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
38.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
39.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的
实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
40.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
41.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
42.实施例1重组蛋白p7型vp4和p23型vp4的原核表达及纯化1.实验材料
43.毒株：g9p7(nj2012，genbank:mt874986.1)和g9p23(ahfy2022，genbank:qq979283)两株猪轮状病毒由江苏省农业科学院兽医所腹泻团队分离和保存；质粒：pcold-sumo购买自武汉淼灵生物科技有限公司；pcold-sumo-p7型vp4和pcold-sumo-p23型vp4委托genscript公司将两个vp4经密码子优化后合成并克隆至pcold-sumo而获得；菌株：大肠杆菌感受态细胞bl21(de3)购自transgen公司。
44.p7型vp4的核苷酸序列(seq id no.1)：
45.ggaagtgctaaaccccaagatgtaacaataaatccgggtccgtttgcgcaaaccggctatgcgccggtgaactggggcgctggcgagacaaatgattccactaccgtcgagccgttgctggacggtccgtatcagccgaccacgtttaacccgccgaccggttactgggttctgttagctccgaccgtcgagggtgtcattatccaaggtacaaactctactgaccgctggctggcgaccattctgattgaaccgaacgtgcagaccacgaaccgcatctataacttgtttggtcagcaggtgacgctgtccgttgagaatacttctcagacccaatggaaattcatcgatgttagcaccacgaccccgacgggcagttatacccaacatggtccgttattttccaccccgaagctgtacgccgttatgaaattttctggtcgcatctacacgtacagcggcaccacaccgaacgcaactacgggttactacagcaccacgaactatgataccgtcaacatgacctctttctgcgacttctatatcatcccgcgtaaccaagaagaaaaatgtaccgaatacattaatcatggtctgccaccgattcaaaataccaggaacgttgtgccggttccgttgtctgcacgtgagatcgtgcacacccgcgcacaggtaaatgaagatatcgtggtgagcaaaaccagcctgtggaaagagatgcaatgtaatcgagacatcaccattcgtttcaagttcgatcgtaccatcatcaaggctggtggcctgggttacaagtggtcagaaatctccttcaaaccgattacctaccagtatacctacgcgcgtgacggcgagcagattaccgcacataccacgtgcagcgtgaacggggttaacaactttagctacaacggtggtagcctcccaaccgacctggcgatctctcgttatgaagtgattaaggagaatagcttcgtgtacatcgactattgggatgacagccaggcgtttcgcaacatggtttacgttcgtagcttggcggcgaacctgaataccgtgacgtgcaccggcggcgattattccttcgccctgccgctcggccattatccggttatgaccggcggaaccgttagcctgcatccggctggcgtgaccctgagcacccaatttaccgactttgttagcctgaatagcctgcgtttccgtttccgtcttaccgttggtgaaccgagcttctcaattacccgtacccgcgtgagtcgcctgtacggccttccggcggcgaatccaaacaaccagcgtgaatattacgagatctcgggtcgtttctcgttgattagcttggttcctagc。
46.p7型vp4的氨基酸序列(seq id no.2)：
47.gsakpqdvtinpgpfaqtgyapvnwgagetndsttveplldgpyqpttfnpptgywvllaptvegviiqgtnstdrwlatiliepnvqttnriynlfgqqvtlsventsqtqwkfidvstttptgsytqhgplfstpklyavmkfsgriytysgttpnattgyysttnydtvnmtsfcdfyiiprnqeekcteyinhglppiqntrnvvpvplsareivhtraqvnedivvsktslwkemqcnrditirfkfdrtiikagglgykwseisfkpityqytyardgeqitahttcsvngvnnfsynggslptdlaisryevikensfvyidywddsqafrnmvyvrslaanlntvtctggdysfalplghypvm
tggtvslhpagvtlstqftdfvslnslrfrfrltvgepsfsitrtrvsrlyglpaanpnnqreyyeisgrfslislvps。
48.p23型vp4的核苷酸序列(seq id no.3)：
49.ggatcagaaaagacgcaaaacgttaccattaacccgggtccgttcgcccaaaccggctacgcgcctgtcaattggggtccgggtgaaaccaatgacagcacgaccgtagagccggtgctggatggtccgtatcagccgaccacgtttaacccgccggttagttattggattctgttgtccccgagcaatgctggtgtggtggtggagggcaccaataactccgaccgttggctggctaccatcctgattgaaccgaacgtgacgtcgcaaagcagaacatacaccatctttggccgtcaggagcagattaccgtggagaacgtctctaccacgaagtggaaatttgtggatctggcgaaaacggacataaacggcaccttcacccaacatggtcagctgttgtcagacaccaagctgtacggcgtgatgaaattctccggtcgcttgtacacgtacaatggtgaaaccccgaacgcgaccacaggttattacaccactaccaactacgataccgttaatatggtttcccattgtgatttttatatcatcccgcgttccgaggaaagcacctgcacgaattacatcaacaacggcctgccgccgattcagaatacccgtaacgtagttccggtcagcttgaccagccgcagcattgtgcatacccgtgcacaggcgaatgaagatatcgttgtgtcgaaaacttctctttggaaggagatgcagtataatcgtgacatcaccattcgttttaagttcgctaatgcgatcatcaagagcggcggtctgggctataaatggagcgagatcagctttaagccggcgaactaccaatataactacacgcgtgacggcgaggtcatcaccgcacataccacgtgcagcgtgaacggcattaatgacttcagctataacggcggtagcctgccgactgacttcgtcatttctcgctatgaggttatcaaagaaaactcttacgtgtatgtggactactgggatgattcccaagcgtttcgcaatatgatttatgttcgtagcctggctgctaacttgaatagcgttacctgcaccggtggaaactacaactttcggcttccggtgggtgcatggccagttatgaccggtggcgcggttagcctgcgtccggccggtgttactctgagcacccaatttaccgacttcgtgtccctaaattcgctgcgtttccgcttctctttgtccgttgaggaaccgccattcgccattgcgcgtactcgcgtgtcgagcctctacggcctgccggcggcaaaccccaacaacggcaaagattattacgaaatcctgggtcgtttcagcctgatcctgttggttccgagcgaa。
50.p23型vp4的氨基酸序列(seq id no.4)：
51.gsektqnvtinpgpfaqtgyapvnwgpgetndsttvepvldgpyqpttfnppvsywillspsnagvvvegtnnsdrwlatiliepnvtsqsrtytifgrqeqitvenvsttkwkfvdlaktdingtftqhgqllsdtklygvmkfsgrlytyngetpnattgyytttnydtvnmvshcdfyiiprseestctnyinnglppiqntrnvvpvsltsrsivhtraqanedivvsktslwkemqynrditirfkfanaiiksgglgykwseisfkpanyqynytrdgevitahttcsvngindfsynggslptdfvisryevikensyvyvdywddsqafrnmiyvrslaanlnsvtctggnynfrlpvgawpvmtggavslrpagvtlstqftdfvslnslrfrfslsveeppfaiartrvsslyglpaanpnngkdyyeilgrfslillvps。
52.2.实验方法
53.2.1重组质粒双酶切鉴定
54.将p7和p23型猪轮状病毒的截短vp4基因序列(seq id no.1和seq id no.3)送至genscript基因合成公司进行基因合成，并连接至pcold表达载体，经优化后构建pcold-sumo、pcold-sumo-p7型vp4和pcold-sumo-p23型vp4原核表达质粒。将构建的重组质粒进行双酶切鉴定，按表1酶切体系将公司合成的重组质粒37℃水浴酶切30min后，使用0.8％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。
55.表1重组质粒酶切体系
seplife ff(ida)柱，流速为5ml/min。
66.上样：将-80℃保存的菌体破碎后上清经0.22μm滤膜后过ni seplife ff(ida)柱，流速为1ml/min，收集流穿液。
67.洗杂：将10cv的binding buffer经0.22μm滤膜后过ni seplife ff(ida)柱，流速为3ml/min，收集流出液。
68.洗杂：将10cv的20mm elution buffer(tris-hcl缓冲液加20mm咪唑)经0.22μm滤膜后过ni seplife ff(ida)柱，流速为3ml/min，收集流出液。
69.洗脱：将5cv的500mm elution buffer(tris-hcl缓冲液加20mm咪唑)经0.22μm滤膜后过ni seplife ff(ida)柱，流速为1ml/min，收集流出液。
70.清洗：将10cv的binding buffer经0.22μm滤膜后过ni seplife ff(ida)柱，流速为5ml/min。
71.清洗：将10cv的ddh2o经0.22μm滤膜后过ni seplife ff(ida)柱，流速为5ml/min。
72.保存：10cv的20％乙醇经0.22μm滤膜后过ni seplife ff(ida)柱，流速5ml/min 4℃保存。
73.取20μl不同阶段的收集液与5μl 5
×
loading buffer混合煮沸，进行sds-page电泳和western blot分析。sds-page在电泳后，切下凝胶，使用r250染色液浸满凝胶，置于摇床上30rpm，室温孵育1h。换脱色液，摇床70rpm脱色，勤换脱色液至条带清晰、背景透明为止。
74.2.2.3重组蛋白超滤
75.(1)蛋白收集：将经过sds-page电泳和westernblot分析后确定含有目的蛋白洗脱液的各管混合在一起，作为超滤前样品(结果图中的纯化后未超滤条带)。
76.(2)清洗：将2cv的ddh2o经0.22μm滤膜后过超滤管，超滤管规格为50kd 50ml，离心条件为5000rpm 15min 15℃。
77.(3)柱平衡：2cv的binding buffer经0.22μm滤膜后过超滤管，5000rpm 15min 15℃。
78.(4)上样：将超滤前样品加入超滤管内，3000rpm 10min，收集流穿液。继续加样离心至所有超滤前样品全部加入超滤管内。
79.(5)换液：待所有样品都加至超滤管后3000rpm 10min，向管内补加缓冲液，基础液为0.01m pbs，换液离心3次后收集超滤管内液体进行sds-page电泳和westernblot分析。
80.(6)清洗：2cv的0.2mm naoh经0.22μm滤膜后过超滤管，5000rpm 15min。
81.(7)清洗：2cv的binding buffer经0.22μm滤膜后过ni seplife ff(ida)柱，流速为5ml/min。
82.(8)清洗：2cv的ddh2o经0.22μm滤膜后过ni seplife ff(ida)柱，流速为5ml/min。
83.(9)保存：2cv的20％乙醇经0.22μm滤膜后过ni seplife ff(ida)柱，流速5ml/min4℃保存。
84.(10)蛋白浓度测定：使用bradford蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白浓度，前面配置标准品时按照试剂盒说明书进行操作，孔内加入蛋白样品和反应液后在37℃温箱避光孵育1h，利用酶标仪检测波长570nm下的od值。根据标准品蛋白浓度与标准品od
570nm
拟合出标准曲线，蛋白浓度依据标准曲线及样品od
570nm
计算得出。
85.2.2.4重组蛋白鉴定
86.sds-page电泳检测重组蛋白表达：将2.2.1中预留的未诱导全菌产物，诱导后全菌产物和第三管诱导后未经处理的菌液取出，12000rpm离心10min后弃掉上清加160μlpbs重悬，重悬置于在冰上，用超声破碎仪进行破碎，超声时间2s，间隔时间2s，超声2s和间隔2s算一次，每管超声8次。得到未诱导全菌裂解产物和诱导后全菌裂解产物，第三管菌经超声破碎后12000rpm离心10min，取上清作为诱导后全菌裂解离心后上清，沉淀用160μlpbs重悬作为诱导后全菌裂解离心后沉淀。向4管菌液中各加入40μl 5
×
loading buffer混合均匀后100℃金属浴10min。根据蛋白大小，配置10％分离胶、5％浓缩胶，浓缩胶使用90v电压电泳，分离胶使用120v电压电泳。
87.当溴酚蓝到达底部后，停止电泳，将浓缩胶裁下留分离胶，放入盒中，向其中加入r250染色液，至浸没胶块，染色2h，换脱色液进行脱色，4h后，待胶块的背景色淡化，目的条带清晰显现时，拍照收取结果。
88.westernblot检测重组蛋白表达：前面制备样品，跑胶步骤与sds-page电泳一致，当溴酚蓝到达底部后，停止电泳。将滤纸和nc膜浸泡在转膜缓冲液中，将凝胶切开，使用三明治结构，依次按照滤纸、nc膜、凝胶、滤纸顺序放入半干法转印槽中进行转膜。转膜后将含有目的蛋白的nc膜浸入5％脱脂奶粉的封闭液中，置于摇床上60rpm，室温2h。加入pbst浸满nc膜，80rpm洗涤，洗涤三次，每次10min。使用pbst将6*his标签抗体按照1:10000稀释，置于摇床上60rpm孵2h。加入pbst浸nc膜，80rpm洗涤，洗涤三次，每次10min。使用pbst将hrp标记的羊抗鼠igg抗体按照1:10000稀释，置于摇床上60rpm孵育1h。加入pbst浸满nc膜，80rpm洗涤，洗涤三次，每次10min。使用天能化学发光试剂1:1混合后均与覆盖于膜上，利用化学发光成像仪立即显色观察。
89.3.结果
90.3.1重组质粒双酶切鉴定
91.为利用大肠杆菌表达系统表达p7型vp4和p23型vp4蛋白，将基因序列经优化后送至南京金斯瑞合成pcold-sumo-p7型vp4和pcold-sumo-p23型vp4质粒，质粒的构成主要分为以下部分：将6个组氨酸(his)标签与蛋白c端融合，有利于蛋白纯化。小分子泛素样修饰蛋白(small ubiquitin-like modifier)标签被添加到基因序列的n端以促进靶蛋白的可溶性表达，提高表达量同时能促进靶蛋白正确折叠。以及p7型vp4和p23型vp4基因克隆到pcold-sumo载体的xho i/sal i两个酶切位点之间。
92.为了结果更直观，选择更换酶切位点来进行，将得到的质粒利用限制性核酸内切酶xho i和mlu i、xho i和pst i分别对pcold-suom-p7型vp4和pcold-sumo-p23型vp4质粒进行双酶切鉴定。目的片段长度约为1350bp，结果如图1和图2所示。双酶切结果表明质粒pcold-sumo-p7型vp4和pcold-sumo-p23型vp4已成功构建，将验证正确的质粒用于后续实验。
93.3.2重组蛋白诱导表达
94.将pcold-sumo空载体、pcold-sumo-p7型vp4、pcold-sumo-p23型vp4重组质粒转入bl21(de3)感受态细胞按2.2.1中步骤进行表达，表达后通过sds-page电泳验证目的条带是否为预期大小。结果显示，如图3中a，pcold-sumo空载体诱导表达后在25kda下有条带，目的条带大小为16kda，图3中b和c显示在70kda上方有条带，而p7型vp4蛋白和p23型vp4蛋白的
目的条带大小为72kda，在图中可以看出，三种蛋白在未诱导全菌裂解产物中没有或有很少目的蛋白条带出现，而在诱导后在目的蛋白条带附近出现了较粗的蛋白条带，这表明重组蛋白诱导表达成功，三种重组蛋白的诱导后全菌裂解离心后沉淀有少量或没有蛋白条带的出现，而诱导后全菌裂解离心后上清蛋白条带很粗，表明蛋白表达形式为可溶性而非包涵体内。
95.3.3重组蛋白纯化
96.转化重组质粒的感受态细胞在诱导后，得到的菌体沉淀，经超声破碎后离心取上清，使用ngc蛋白纯化系统及亲和层析镍柱进行纯化。
97.sds-page结果如图4、图5、图6所示，目的蛋白分子量分别为16kda，72kda，72kda。使用无咪唑浓度binding buffer冲洗柱子内杂蛋白和非特异性结合蛋白，后使用高浓度咪唑(500mmol/l)洗脱，得到目的蛋白。从纯化结果图中可以看出，重组蛋白经过亲和层析镍柱时被富集和初步纯化，但p7和p23的vp4蛋白在纯化后仍有部分杂蛋白，同时因纯化蛋白量较大，所以最终得到的目的蛋白浓度略低。
98.3.4重组蛋白超滤
99.使用超滤管对目的蛋白进行二次纯化及浓缩，以提高蛋白纯度和浓度。sumo载体蛋白(图7中a)、p7型vp4蛋白(图7中b)、p23型vp4(图7中c)三种蛋白纯化超滤后，三种超滤后蛋白各取5μl，用pbs对其进行稀释，稀释倍数为10倍，20倍，20倍，加入适量5
×
蛋白上样缓冲液后，金属浴100℃10min。sds-page电泳分析结果如图2-7所示，与经过亲和层析镍柱纯化后的蛋白相比，蛋白经过超滤后杂蛋白条带变得更少，蛋白相对更纯净，同时由于超滤作用，蛋白浓度也大大增加，使用bradford蛋白浓度测定试剂盒进行测定，最终分别得到了72mg，87mg，112mg重组蛋白。
100.3.5重组蛋白验证
101.各取微量超滤后的纯化蛋白经稀释后，加入适量5
×
蛋白上样缓冲液，进行三种目的蛋白的western blot验证，结果如图8所示，1号泳道sumo蛋白在25kda下出现了特异性条带，已知sumo载体蛋白理论值大小为16kda，因此结合2.3.3中sds-page电泳结果来看确定是我们所需要的目的蛋白；2号泳道和3号泳道分别是p7型vp4和p23型vp4蛋白在70kda附近出现了特异性条带，已知p7型vp4和p23型vp4的理论值大小为72kda，综合sds-page电泳结果可以判定为目的条带。
102.综上，本实施例通过合成p7和p23血清型猪轮状病毒vp4基因主要抗原位点并在对序列进行优化后，将其送至生物公司合成，最后通过双酶切实验验证正确后用于后续实验，结果表明本实验成功构建了pcold-sumo、pcold-sumo-p7型vp4、pcold-sumo-p23型vp4重组表达质粒，获得了p7和p23两种血清型猪轮状病毒vp4基因的原核表达系统，以大肠杆菌bl21(de3)为宿主菌，成功诱导pcold-sumo、pcold-sumo-p7型vp4、pcold-sumo-p23型vp4表达目的蛋白vp4，并经镍柱纯化后得到大量的vp4蛋白。经sds-page和westernblot试验验证，结果显示，经诱导表达和纯化后获得的蛋白分子量大小与预期理论值相符合，并测得目的蛋白vp4经纯化超滤后的浓度为72mg(pcold-sumo)，87mg(p7型vp4)，112mg(p23型vp4)，为后续小鼠和猪实验的免疫原性探究等实验提供了重要材料。
103.实施例2p7型vp4和p23型vp4重组蛋白的免疫原性
104.1.实验材料
105.细胞：非洲绿猴肾细胞(vero细胞，atcc ccl-81；ma104细胞，购买自武汉普诺赛生命科技有限公司，货号cl-0479)；毒株：g9p7(nj2012，genbank:mt874986.1)，g9p23(ahfy2022，genbank:qq979283)两株轮状病毒由江苏省农业科学院兽医所腹泻团队分离。
106.实验动物：6周龄balb/c雌性小鼠，42只，购自扬州大学医学比较中心，饲养于江苏省农业科学院兽医所动物实验基地。3日龄新生仔猪，porv抗原和抗体均为阴性。动物实验的操作严格按照江苏省农业科学院动物研究伦理委员会的指导方案执行。
107.试剂：见表2。
108.表2
[0109][0110][0111]
2.实验方法
[0112]
2.1重组蛋白亚单位疫苗制备
[0113]
经预实验后，决定使用isa-201佐剂用于疫苗制备，按照抗原和佐剂1:1(v/v)乳化制备，疫苗抗原含量500μg/ml，完成后保存于4℃保存待用。
[0114]
2.2小鼠免疫实验
[0115]
随机将小鼠分为7组，每组6只，将小鼠放置在江苏省农业科学院兽医所动物实验基地饲养两天后对其进行免疫实验，本实验共设计了5组实验组，一组pbs与佐剂混合的空白对照组及一组sumo载体蛋白与佐剂混合的对照组。为方便描述将免疫原为pbs组记为pbs，sumo组记为sumo，p7型vp4-25μg组记为p7-25，p7型vp4-100μg组记为p7-100，p23型vp4-25μg组记为p23-25，p23型vp4-100μg组记为p23-100，p7型vp4+p23型vp4-50μg组记为p7-p23，各组分别设置6只小鼠的平行重复，全部采用背部皮下多点注射方式进行免疫。分别于免疫前、免疫后14天、28天和42天采血，用于中和抗体检测。具体免疫实验计划如表3。
[0116]
表3小鼠免疫实验计划
[0117][0118]
2.3仔猪免疫试验
[0119]
筛选porv抗原和抗体均为阴性的3日龄新生仔猪，随机分成2组，5头/组。免疫组肌肉注射vp4二价疫苗(p7型vp4+p23型vp4)，一免后14天再加强免疫1次，1ml/头，分别于免疫前、一免后和二免后10天采血，用于中和抗体测定。具体免疫计划见表4。
[0120]
表4
[0121][0122][0123]
2.4porv的p7、p23型毒株tcid
50
测定
[0124]
(1)长满的ma104细胞按照1:3传代密度铺于96孔板。
[0125]
(2)待细胞24h后长满单层，进行病毒tcid
50
测定。
[0126]
(3)用1μg/ml含胰酶的m199培养基稀释病毒，按照10倍比稀释，从10-1
稀释到10-10
。
[0127]
(4)弃掉96孔板中的培养基，每孔加100μlpbs，反复清洗3遍。
[0128]
(5)弃净pbs后，每孔加入100μl稀释好的病毒液，每个稀释度做8个重复孔，细胞对照孔加入100μl 1μg/ml含胰酶的m199培养基维持。
[0129]
(6)每日观察病变并记录，一般观察5天左右。按照reed-muench两氏法或者karber法计算结果。
[0130]
2.5血清中和实验
[0131]
将待检小鼠血清或猪血清首先56℃30min预处理后待用。具体步骤如下：
[0132]
(1)长满单层ma104细胞按照1：3传代密度铺于96孔板。
[0133]
(2)待细胞再长满单层，为后续实验做准备。
[0134]
(3)m199纯培养基按照2倍比稀释血清，从2-1
到2-12
。
[0135]
(4)m199培养基稀释病毒至200tcid
50
/50μl。
[0136]
(6)50μl稀释好的病毒液分别与50μl稀释好的血清混合均匀，每个血清稀释度重
复两孔，37℃中和1h。病毒对照孔加入50μl稀释好的病毒液和50μl培养基。
[0137]
(7)取长满单层的细胞，弃掉96孔板中的培养基，每孔加100μl的pbs，反复清洗3遍。
[0138]
(8)弃净pbs后，每孔加入100μl中和后的血清病毒混合液，每个稀释度重复2孔，细胞对照孔加入100μl培养基维持。37℃孵育2h。
[0139]
(9)弃孔内液体，每孔加100μl的pbs，清洗2遍，含1μg/ml胰酶的m199培养基每孔100μl，清洗1遍。
[0140]
(10)含1μg/ml胰酶的m199培养基每孔100μl维持。
[0141]
(11)每日观察病变并记录，一般观察5天左右。按照reed-muench两氏法或者karber法计算结果。
[0142]
2.6免疫小鼠脾脏淋巴细胞获取
[0143]
(1)首免42d后，所有小鼠脱颈处死，浸泡于中75％乙醇5min以消毒。
[0144]
(2)于超净台中，解剖小鼠。小鼠侧卧于无菌平皿中，打开小鼠左侧背腹部皮肤，取出脾脏。脾脏浸泡于不含血清的rpmi-1640(即不完全1640)培养基中。
[0145]
(3)取无菌50ml离心管，40μm细胞筛网置于离心管上。将脾脏置入细胞筛网上，加入少量不完全1640培养基，使用5ml无菌注射器活塞顶部研磨脾脏。
[0146]
(4)加入3ml不完全1640培养基冲洗筛网和注射器活塞顶部。
[0147]
(5)收集细胞悬液，1500rpm离心10min。
[0148]
(6)弃上清，加入5ml红细胞裂解液，重悬细胞。37℃裂解5min，1500rpm离心10min。
[0149]
(7)弃上清，加入5ml不完全1640培养基，重悬细胞，1500rpm离心10min。
[0150]
(8)弃上清，加入1ml含有10％fbs和1％三抗的完全1640培养基，重悬细胞，将细胞悬液转移到1.5ml离心管中，获得脾脏淋巴细胞。
[0151]
2.7 cck-8法测定淋巴细胞增殖率
[0152]
将(1)上述分离出来的脾细胞按照10
3-104cells/ml稀释，每孔200μl接种到96孔板中，每只小鼠脾细胞重复4孔。另设一孔为空白对照组，仅含有培养基，无细胞。
[0153]
(2)待细胞贴壁后，每只小鼠脾细胞4个孔，其中三个孔每个孔加入cona至终浓度为10μg/ml，剩余1孔不处理为对照。
[0154]
培养72h后，刺激组每孔轻柔吸出50μl，用于后续细胞因子检测。对照组每孔轻柔吸出50μl，弃掉。
[0155]
(3)每孔加入10μlcck-8试剂，于37℃孵育2h。使用酶标仪读取450nm的od值。
[0156]
(4)根据以下公式计算脾淋巴细胞刺激指数：
[0157]
stimulation index＝(a-c)/(b-c)
×
100％
[0158]
式中：a-刺激后的od
450nm
；b-对照未刺激的od
450nm
；c-空白对照仅含培养基的od
450nm
。
[0159]
2.8流式细胞仪检测各亚型淋巴细胞比率
[0160]
(1)调整上述制备好的脾细胞密度为1
×
106cells/ml，分别取1ml加入到1.5ml离心管中，取3份，1500rpm离心5min。
[0161]
(2)弃上清，加入1mlpbs重悬细胞，1500rpm离心5min。
[0162]
(3)根据流式荧光抗体浓度，用pbs稀释抗体。
[0163]
(4)弃离心管中的上清，1份细胞使用300μl含有pe anti-mouse cd4、apcanti-mouse cd8a和fitc anti-mouse cd3e荧光抗体的pbs重悬，一份细胞使用300μl含有percp-cy5.5anti-mouse b220和fitc antimouse cd19荧光抗体的pbs重悬，4℃避光孵育30min。
[0164]
(5)1500rpm离心5min，弃抗体，加入1ml pbs重悬细胞，洗涤两次，1500rpm离心5min。
[0165]
(6)弃上清，用500μl pbs重悬细胞。使用bdaccuri
tm
c6 plus流式细胞仪检测，利用flowjo进行分析。
[0166]
2.9免疫小鼠脾细胞上清中细胞因子含量检测
[0167]
2.9.1淋巴细胞ifn-γ检测
[0168]
检测步骤，按照酶免小鼠ifn-γ酶联免疫分析试剂盒说明书操作。
[0169]
2.9.2淋巴细胞il-4检测
[0170]
检测步骤，按照酶免小鼠il-4酶联免疫分析试剂盒说明书操作。
[0171]
3.结果
[0172]
3.1免疫小鼠血清中和抗体检测
[0173]
根据抗原量的不同将p7型vp4蛋白和p23型vp4蛋白各设置两组，一组抗原含量为25μg(p7-25、p23-25)另一组抗原含量为100μg(p7-100、p23-100)，一组p7型vp4蛋白和p23型vp4蛋白混合免疫组抗原含量为50μg两种蛋白等比混合(p7-p23)，一组sumo载体蛋白组，将以上各组与isa201佐剂等比混合，分别制成亚单位疫苗免疫小鼠，于首免后14d、28d、42d对小鼠进行眼球后静脉丛采血，分离血清。
[0174]
3.1.1p7型中和抗体测定
[0175]
使用猪轮状病毒g9p7型(nj2012)为检测靶标病毒来检测小鼠首免后42d血清的中和抗体，结果如图9中a所示，p7-25、p7-100、p23-25、p23-100及p7-p23蛋白混合免疫组产生的中和抗体水平均显著高于sumo载体蛋白免疫组，且高于pbs组。p7-25、p7-100蛋白免疫组血清中和抗体为28，而p23-25、p23-100蛋白免疫组产生的中和抗体滴度为25。其中p7-p23蛋白混合免疫组血清产生的中和抗体滴度最高可达到2
10
。其次，从图9中b的结果可以看出，p7-p23蛋白混合免疫组中和抗体滴度与p7-25、p7-100组有显著差异，与p23-25、p23-100组有极显著差异。从而得出结论，以猪轮状病毒g9p7型(nj2012)为检测靶标病毒检测小鼠血清中和抗体时，p7-p23蛋白混合免疫组血清中和抗体滴度最高。
[0176]
3.1.2p23型中和抗体测定
[0177]
使用p23型轮状病毒检测3.2.1中同一份血清，结果如图10中a所示，p7-25、p7-100、p23-25、p23-100及p7-p23蛋白混合免疫组产生的中和抗体水平均显著高于sumo载体蛋白免疫组，且高于pbs组。p7-25和p7-100组血清中和抗体滴度在25左右，p23-25和p23-100组血清中和抗体滴度最高达到29，而p7-p23组最高滴度为2
10
。同时，图10中b的结果显示，p7-p23组与p7-25、p7-100组有极显著差异，与p23-25、p23-100组有差异。因此在使用p23型轮状病毒检测中和抗体滴度时p7-p23组中和抗体滴度最高。
[0178]
3.2免疫仔猪中和抗体测定
[0179]
以nj2012和anfy2022毒株为靶病毒分别检测免疫前、一免后和二免后10天的猪血清，结果图11所示，一免后血清中和抗体滴度在25，二免后呈现指数升高，最高可达27，对照组抗体滴度始终维持在1:8-1:16之间。
[0180]
3.3免疫小鼠脾淋巴细胞增殖
[0181]
小鼠经免疫后42d，体内淋巴细胞均出现增殖现象。采用cck8法对其增值率进行检测，以空白组为100％计。结果如图12中a，p7-100组与对照sumo载体蛋白组有差异，而p7-25、p23-25、p23-100组与sumo载体蛋白组有显著差异。而在图13中b，p7-p23混合免疫组与p23-25组有差异，与p7-25、p7-100、p23-100组有显著差异。上述结果表明，在所有免疫组中，p7-p23混合免疫组引起小鼠淋巴细胞增殖效果最好。
[0182]
3.4免疫小鼠血清中细胞因子含量
[0183]
通过酶免公司的elisa试剂盒来检测免疫后42d的小鼠脾淋巴细胞上清中ifn-λ和il-4细胞因子的表达情况。按照试剂盒所给说明书做出标准曲线后，将所有样品测得od值代入标注曲线所得方程式，最终得到样品实际浓度。
[0184]
淋巴细胞表达ifn-λ的含量：如图13中a-b所示，除pbs组与sumo载体蛋白组无显著差异外，所有免疫组与sumo载体蛋白组相比有极显著差异(图13中a)，各单独免疫组与p7-p23混合免疫组相比均有显著差异(图13中b)。因此，p7-p23混合免疫组的ifn-λ含量上升水平最明显。
[0185]
淋巴细胞表达il-4的含量：如图13中c-d所示，相对于sumo载体蛋白对照组而言，其他实验组的表达水平均有显著或极显著的升高(图13中c)。而如图13中d所示，p7-p23混合免疫组相对于其他实验组来说也有显著或极显著差异。因此判断，p7-p23混合免疫组的il-4含量上升最明显。
[0186]
3.5流式细胞术检测t淋巴细胞亚型比例
[0187]
3.5.1cd3
+
cd4
+
t淋巴细胞亚型比例
[0188]
免疫小鼠cd3
+
cd8
+
t淋巴细胞流式分析结果见图15。
[0189]
如图14中a所示，首免后42d，相对于对照sumo载体蛋白组，所有实验组均有一定程度的上升，其中p7-25组对比对照sumo载体蛋白组有差异，其余实验组均有显著差异。如图14中b所示，p7-25、p7-100组与p7-p23混合蛋白组有显著差异，p23-25、p23-100组与p7-p23组无显著差异。
[0190]
3.5.2cd3
+
cd8
+
t淋巴细胞亚型比例
[0191]
免疫小鼠cd3
+
cd8
+
t淋巴细胞流式分析结果见图17。
[0192]
如图16中a所示，首免后42d，相对于sumo载体蛋白组，所有实验组均有一定程度的上升。其中p7-25，p23-25组对比对照sumo载体蛋白组有差异，其余实验组均有显著差异。在图16中b可以看出，p7-25、p7-100组与p7-p23混合蛋白组有显著差异，p23-25、p23-100组与p7-p23组无显著差异。
[0193]
综上所述，本发明以p7型vp4和p23型vp4为抗原与佐剂混合后制成二价亚单位疫苗，并以乳化剂的形式对小鼠进行背部皮下免疫，而后采集血清等样品并进行免疫原性分析。结果显示，免疫后的小鼠血清中检测到了较高浓度的中和抗体和上升水平明显的特异性抗体igg，并通过淋巴细胞增殖指数分析，细胞因子ifn-γ和il-4检测，淋巴细胞亚型比例分析等实验，验证了vp4蛋白的免疫原性，并证明了二价疫苗在小鼠体内产生的各项免疫应答均优于一种血清型vp4蛋白单独免疫的效果。
[0194]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出
的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

技术特征：
1.一种猪轮状病毒的抗原组合，其特征在于，所述抗原组合包括p7型vp4蛋白和p23型vp4蛋白，所述p7型vp4蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示，所述p23型vp4蛋白的氨基酸序列如seq id no.4所示。2.一种编码如权利要求1所述的抗原组合的基因组合，其特征在于，包括核苷酸序列分别如seq id no.1和seq id no.3所示的基因。3.一种重组质粒组合，其特征在于，包括表达p7型vp4蛋白的重组质粒和表达p23型vp4蛋白的重组质粒；表达p7型vp4蛋白的重组质粒包括如seq id no.1所示的基因；表达p23型vp4蛋白的重组质粒包括如seq id no.3所示的基因。4.一种重组微生物菌株组合，其特征在于，包括表达p7型vp4蛋白的重组微生物菌株和表达p23型vp4蛋白的重组微生物菌株；表达p7型vp4蛋白的重组微生物菌株包括如seq id no.1所示的基因；表达p23型vp4蛋白的重组微生物菌株包括如seq id no.3所示的基因。5.一种如权利要求1所述的抗原组合、权利要求2所述的基因组合、权利要求3所述的重组质粒组合或权利要求4所述的重组微生物菌株组合在制备猪轮状病毒疫苗中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述猪轮状病毒为g9型a群猪轮状病毒。7.一种猪轮状病毒蛋白疫苗，其特征在于，包括权利要求1所述的抗原组合。8.根据权利要求7所述的猪轮状病毒蛋白疫苗，其特征在于，所述猪轮状病毒蛋白疫苗还包括药学上可接受的辅料。9.根据权利要求8所述的猪轮状病毒蛋白疫苗，其特征在于，所述辅料包括疫苗佐剂。10.一种猪轮状病毒dna疫苗，其特征在于，包括权利要求2所述的基因组合、权利要求3所述的重组质粒组合或权利要求4所述的重组微生物菌株组合。

技术总结
本发明公开了一种猪轮状病毒的抗原组合及其应用，涉及生物医药技术领域。所述抗原组合包括P7型VP4蛋白和P23型VP4蛋白，所述P7型VP4蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述P23型VP4蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。本发明以正在呈上升趋势流行的两种血清型猪轮状病毒的P7型VP4和P23型VP4为抗原免疫动物，结果显示，VP4蛋白具有良好的免疫原性，两种蛋白混合形成的二价亚单位疫苗效果优于P7型VP4或P23型VP4单独作为免疫原产生的免疫效果，二价亚单位疫苗可以有效诱导动物产生良好的体液免疫及细胞免疫。的体液免疫及细胞免疫。的体液免疫及细胞免疫。


技术研发人员：李彬 张雪寒 周金柱 汤学超 朱雪蛟 陶然 范宝超 汪伟 郭容利
受保护的技术使用者：江苏省农业科学院
技术研发日：2023.06.06
技术公布日：2023/8/1