一种caco-2细胞玻璃爬片及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及细胞培养领域，特别是一种caco-2细胞玻璃爬片及其制备方法和应用。


背景技术：

2.辅料技术是一种产业成熟度较高的口服大分子药物(如多肽、单克隆抗体等)改良型新药的创新路径。目前存在的辅料产品，如tpe，snac等技术的核心均采用了一种或多种脂溶性分子帮助促进药物渗透通过单层肠道/胃上表皮细胞。这类辅料分子的具体作用机制目前尚未明确，其大致为扰动磷酸双分子层，以帮助药物跨膜进入细胞以穿过单层细胞，或打开细胞间的紧密连接蛋白以帮助药物穿过细胞旁通路。
3.不同的大分子药物间的分子量、水/脂溶性、作用机制等性质存在较大差异，辅料的选用需根据缩递送的药物进行差异化组合。目前药企普遍使用现有的辅料技术来研发大分子口服改良型新药，达到的效果有限，成功概率较低，而新辅料分子的发现进行很缓慢。体外实验是发现新的潜在辅料分子的高效快速的方法(此处相较于动物实验)，目前主流使用的体外模型为生长在可穿透性细胞小室上面的单层caco-2细胞模型。caco-2单层膜结构可模拟肠道上表皮细胞的形态及功能，是一种较为成熟的学术研究方法。该方法优点在于可用于研究在加入辅料分子之后的大分子药物的渗透效率。
4.如中国专利申请号cn202010300968.1公开了一种caco-2细胞单层膜形成培养方法：用含20％胎牛血清、1％青霉素/链霉素的mem培养基培养caco-2细胞，当细胞汇合度达到60％-70％时胰酶消化，连续传代培养2-3次，待细胞培养到对数生长期，过量接种细胞培养，细胞贴壁展开后，用pbs清洗未贴壁细胞，即得到caco-2单层膜细胞。本发明方法建立的caco-2单层膜模型状态良好，呈铺路石状镶嵌状排列，细胞之间紧密连接，基本无空泡形成，caco-2细胞模型可靠稳定、重复性好，为后续的药物吸收、转运研究奠定实验基础。
5.但该方法实验周期较长，细胞需要生长21天完成极化以便实验所需，并且培育难度较高，操作精度要求极高，成功率低，需要操作者拥有一定的经验，提高了用人与时间成本，不利于企业的高效率筛选。而使用玻璃爬片可以快速(～3天)获得caco-2细胞岛状结构用以研究不同分子对细胞间紧密连接结构以及细胞膜结构的影响，但caco-2细胞是一种非常需要固定锚点的细胞，不适合生长于玻璃表面，在加入影响细胞膜的分子后会快速导致细胞大量脱落，无法进行荧光染色实验，因此在此研究方向下极少被使用。


技术实现要素：

6.为了解决上述技术问题，本发明提供了一种caco-2细胞玻璃爬片及其制备方法和应用。
7.为达到上述目的，本发明是按照以下技术方案实施的：
8.本发明的第一个目的是要提供一种caco-2细胞玻璃爬片的制备方法，包括以下步骤：
9.s1、用0.012mg/ml的ⅰ型胶原蛋白溶于0.006m乙酸得到ⅰ型胶原蛋白包被液，将ⅰ型胶原蛋白包被液包被到无菌的玻璃爬片上于37℃过夜；第二天用无菌双蒸水清洗玻璃爬片两遍后晾干备用；
10.s2、用装有细胞培养基的t75培养瓶将培养至汇合度达到70％的对数生长期的caco-2细胞用胰蛋白酶溶液消化处理；之后用9ml细胞培养基收集细胞并离心，离心转速为3000rpm/s，时间为3分钟；弃上清液并用1ml培养基吹打后用70微米孔径的细胞过滤器将成团的caco-2细胞筛选出来并计数，将caco-2细胞接种在玻璃爬片上，接种密度为51000细胞/cm2，将接种caco-2细胞的玻璃爬片放入37℃、5％co2的培养箱中培养48小时，使caco-2细胞在玻璃爬片上形成岛状拥有紧密连接结构的细胞集落即caco-2细胞单层膜，得到caco-2细胞玻璃爬片。
11.进一步地，所述ⅰ型胶原蛋白为ⅰ型鼠尾胶原蛋白。
12.进一步地，所述ⅰ型胶原蛋白包被液在玻璃爬片上的包被浓度为2μg/cm2。
13.进一步地，步骤s2中胰蛋白酶消化的具体步骤为：
14.1)取汇合度达到70％的对数生长期的caco-2细胞，用pbs冲洗一次后，将2
×
106caco-2细胞装入t75培养瓶中；
15.2)向t75培养瓶中加入1ml胰蛋白酶溶液，胰蛋白酶溶液由以下组分组成：胰蛋白酶0.105mm、edta 0.91mm、酚红指示剂0.025mm；在37℃5％ co2环境孵育5分钟。
16.进一步地，所述细胞培养基由以下组分组成：earle’s盐，non-essential amino acid，l-谷氨酰胺2mm，nahco
3 2200mg/l，d-葡萄糖1000mg/l，酚红指示剂10mg/l，青霉素-链霉素100u/ml，该细胞培养基中还添加有10％(v/v)的胎牛血清fbs；ph为7.2
–
7.4。
17.本发明的第二个目的是要提供一种利用上述方法制备的caco-2细胞玻璃爬片。
18.本发明的第三个目的是要提供一种caco-2细胞玻璃爬片在筛选促渗辅料分子中的应用，具体步骤为：
19.s1、将caco-2细胞玻璃爬片置于24孔板中，并在每个孔中加入500ul细胞培养基，在37℃、5％co2潮湿培养箱中培养3天-7天，期间每两天更换一次caco-2每个孔中的细胞培养基(可根据所需研究的蛋白表达时间调整，例如，蛋白在5天时表达量较高则培养5天)；
20.s2、实验当天将培养基换为不含血清的hbss缓冲液，并加入待研究辅料；
21.s3、在37℃、5％co2潮湿培养箱中孵育1
ꢀ‑
2小时后使用4％
22.paraformaldehyde+溶于pbs中的4％蔗糖溶液固定，并使用zo-1+
23.claudin-4/occludin/tricellulin进行荧光染色；
24.s4、将制备好的细胞样本使用共聚焦显微镜成像，成像规格：物镜使用40
×
油镜，1024
×
1024像素，色深12bit，孔径根据波长选择1airy unit，根据使用所研究蛋白特异性抗体选择激发光波长；从细胞基底层开始拍摄间隔为0.7μm的zstack连续图像至细胞顶端，根据荧光成像结果分析细胞膜及紧密连接蛋白结构的变化从而筛选可作为促渗剂的促渗辅料分子。
25.与现有技术相比，本发明的caco-2细胞表面表达大量α2β1受体，被ⅰ型胶原蛋白包被液包被后与ⅰ型鼠尾胶原蛋白粘合，之后在玻璃爬片上48小时内形成岛状拥有紧密连接结构的细胞集落，增强caco-2细胞玻璃爬片贴壁能力，从而使caco-2细胞在玻璃爬片上生长并不受到表面活性剂类分子影响；使用本发明的caco-2细胞玻璃爬片可以快速用于表面
活性剂类型促渗辅料的筛选。
附图说明
26.图1为div 3的caco-2细胞玻璃爬片上的caco-2单层膜结构图。
27.图2为对比例的div 3的caco-2细胞玻璃爬片上的caco-2单层膜结构图。
28.图3为本发明的caco-2细胞玻璃爬片用于β-环糊精孵育后其上的caco-2单层膜结构图。
29.图4为本发明的caco-2细胞玻璃爬片用于十二烷基-β-d-麦芽糖苷(ddm)孵育后其上的caco-2单层膜结构图。
具体实施方式
30.为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定发明。
31.实施例1
32.1)用0.012mg/ml的ⅰ型鼠尾胶原蛋白溶于0.006m乙酸得到ⅰ型胶原蛋白包被液，将ⅰ型胶原蛋白包被液包被到无菌的玻璃爬片(包被浓度为2μg/cm2)上于37℃过夜；第二天用无菌双蒸水清洗玻璃爬片两遍后晾干备用；
33.2)用装有细胞培养基(细胞培养基由以下组分组成：earle’s盐，non-essential amino acid，l-谷氨酰胺2mm，nahco
3 2200mg/l，d-葡萄糖1000mg/l，酚红指示剂10mg/l，ph为7.2
–
7.4)的t75培养瓶培养caco-2细胞至对数生长期使caco-2细胞汇合度达到70％，取汇合度达到70％的对数生长期的caco-2细胞，用pbs冲洗一次后，将2
×
106caco-2细胞装入新的t75培养瓶中；向t75培养瓶中加入1ml胰蛋白酶溶液，胰蛋白酶溶液由以下组分组成：胰蛋白酶0.105mm、edta 0.91mm、酚红指示剂0.025mm，青霉素-链霉素100u/ml，该细胞培养基中还添加有10％(v/v)的胎牛血清fbs；在37℃5％ co2环境孵育5分钟；之后用9ml细胞培养基收集细胞并离心，离心转速为3000rpm/s，时间为3分钟；弃上清液并用1ml培养基吹打后用70微米孔径的细胞过滤器将成团的caco-2细胞筛选出来并计数，将caco-2细胞接种在玻璃爬片上，接种密度为51000细胞/cm2，将接种caco-2细胞的玻璃爬片放入37℃、5％co2的培养箱中培养48小时，使caco-2细胞在玻璃爬片上形成岛状拥有紧密连接结构的细胞集落即caco-2细胞单层膜，得到caco-2细胞玻璃爬片。
34.对比例1
35.1)用无菌双蒸水清洗玻璃爬片两遍后晾干备用；
36.2)用装有细胞培养基(细胞培养基由以下组分组成：earle’s盐，non-essential amino acid，l-谷氨酰胺2mm，nahco
3 2200mg/l，d-葡萄糖1000mg/l，酚红指示剂10mg/l，ph为7.2
–
7.4)的t75培养瓶培养caco-2细胞至对数生长期使caco-2细胞汇合度达到70％，取汇合度达到70％的对数生长期的caco-2细胞，用pbs冲洗一次后，将2
×
106caco-2细胞装入新的t75培养瓶中；向t75培养瓶中加入1ml胰蛋白酶溶液，胰蛋白酶溶液由以下组分组成：胰蛋白酶0.105mm、edta 0.91mm、酚红指示剂0.025mm；在37℃5％ co2环境孵育5分钟；之后用9ml细胞培养基收集细胞并离心，离心转速为3000rpm/s，时间为3分钟；弃上清液并用1ml培养基吹打后用70微米孔径的细胞过滤器将成团的caco-2细胞筛选出来并计数，将caco-2
细胞接种在玻璃爬片上，接种密度为51000细胞/cm2，将接种caco-2细胞的玻璃爬片放入37℃、5％co2的培养箱中培养48小时，使caco-2细胞在玻璃爬片上形成岛状拥有紧密连接结构的细胞集落即caco-2细胞单层膜，得到caco-2细胞玻璃爬片。
37.如图1所示为实施例1制备的div 3的caco-2细胞玻璃爬片上的caco-2单层膜结构图，由图1可以看出：细胞核(蓝色)、细胞骨架(青色)与细胞间紧密连接蛋白zo-1(红色)结构均生长完成，可用于辅料分子筛选。
38.如图2所示为对比例的div 3的caco-2细胞玻璃爬片上的caco-2单层膜结构图，由图2可以看出：未经ⅰ型胶原蛋白包被液包被的玻璃爬片在经过荧光染色过程之后会出现细胞脱离爬片的现象(上图右上黑色无染色区域)。
39.实施例2
40.将上述实施例1制备的caco-2细胞玻璃爬片用于筛选促渗辅料，本实施例以β-环糊精和十二烷基-β-d-麦芽糖(ddm)为例，具体操作过程如下：
41.s1、将caco-2细胞玻璃爬片置于24孔板中，在37℃、5％co2潮湿培养箱中培养3天-7天，期间每两天更换caco-2细胞玻璃爬片上的细胞培养基(可根据所需研究的蛋白表达时间调整，例如，蛋白在5天时表达量较高则培养5天)；
42.s2、实验当天将培养基换为不含血清的hbss缓冲液，分别加入10mm的β-环糊精和0.5mm的十二烷基-β-d-麦芽糖(ddm)；
43.s3、在37℃、5％co2潮湿培养箱中孵育1
ꢀ‑
2小时后使用4％paraformaldehyde+4％蔗糖溶液(溶于pbs中)固定并使用zo-1(闭锁小带蛋白1)+claudin-4(密封蛋白-4)/occludin/tricellulin(三细胞闭锁蛋白)进行荧光染色，荧光染色的具体过程如下：
44.1.吸出24孔板中的complete mem；
45.2.在对应孔中加入hbss辅料溶液，将24孔板放入二氧化碳培养箱中放置1小时；
46.3.吸出24孔板中的hbss；
47.4.用干净的hbss快速清洗并吸出(1次)；
48.5.用pbs快速清洗并吸出(1次)；
49.6.加入4％pfa/4％蔗糖固定液(300ul/孔)；
50.7.摇床15rpm,10min；
51.8.吸出pfa并加入pbs快洗2次，摇床5分钟3次；
52.9加入0.3m glycine(500ul/孔)；
53.10.摇床15rpm，10min；
54.11.吸出glycine并加入pbs快洗2次，5min摇床3次；
55.12.在对应孔中加入0.5％triton-x-100(300ul/孔)；
56.13.摇床15rpm，10min；
57.14.吸出0.5％triton-x-100，快洗2次，摇床5分钟3次；
58.15.加入1％ bsa/pbs(500ul/孔)；
59.16.摇床30min，15rpm；
60.17.加入1
°
ab(溶于1％ bsa/pbs)(150ul/孔)；
61.anti-z0-1(ms)l:200；
62.anti-occludin/claudin4/tricellulin(rb)1:500；
63.18.摇床2h，15rpm；
64.19.吸出1
°
ab并加入pbs快洗2次，摇床5min3次；
65.20.加入1％ bsa/pbs(500ul/孔)；
66.21.摇床30min，15rpm；
67.22.吸出1％ bsa/pbs并加入2
°
ab(150ul/孔，从该步骤起全程避光)，使用前，将2
°
ab进行离心(10000rpm，2min)；
68.anti-ms-555 1:750；
69.anti-rb-488 1:750；
70.dapi-405 1：1000；
71.phalloidin-647 1:1000；
72.23.摇床1h，15rpm；
73.24.吸出2
°
ab并加入pbs快洗2次，摇床5min 3次；
74.25.将爬片取出并保存在载玻片上(覆盖有约10ul anti-fade mounting reagent)上，并置于室温过夜；
75.s4、将制备好的细胞样本使用carl zeiss lsm880共聚焦显微镜成像并分析。成像规格：物镜使用40
×
油镜，1024
×
1024像素，色深12bit，所有通道的有效数值孔径均为1.3μm，小孔径分别为46μm(647nm激发光通道)，41μm(555nm激发光通道)，32μm(488nm激发光通道)；从细胞基底层开始拍摄间隔为0.7μm的zstack连续图像至细胞顶端，根据荧光成像结果分析细胞膜及紧密连接蛋白结构的变化从而研究十二烷基-β-d-麦芽糖(ddm)的促渗功能。
76.如图3所示为caco-2细胞玻璃爬片用于β-环糊精孵育后其上的caco-2单层膜结构图(比例尺＝20μm)，由图3可以看出：β-环糊精未对紧密连接结构造成破坏；如图4所示为caco-2细胞玻璃爬片用于十二烷基-β-d-麦芽糖(ddm)孵育后其上的caco-2单层膜结构图(比例尺＝20μm)，由图4可以看出：十二烷基-β-d-麦芽糖(ddm)使紧密连接结构染色呈弥散状，因此得出结论，在实验所用两种辅料中，十二烷基-β-d-麦芽糖(ddm)可以破坏紧密连接结构，是潜在促渗剂。
77.本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种caco-2细胞玻璃爬片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：s1、用0.012mg/ml的ⅰ型胶原蛋白溶于0.006m乙酸得到ⅰ型胶原蛋白包被液，将ⅰ型胶原蛋白包被液包被到无菌的玻璃爬片上于37℃过夜；第二天用无菌双蒸水清洗玻璃爬片两遍后晾干备用；s2、用装有细胞培养基的t75培养瓶将培养至汇合度达到70％的对数生长期的caco-2细胞用胰蛋白酶溶液消化处理；之后用9ml细胞培养基收集细胞并离心，离心转速为3000rpm/s，时间为3分钟；弃上清液并用1ml培养基吹打后用70微米孔径的细胞过滤器将成团的caco-2细胞筛选出来并计数，将caco-2细胞接种在玻璃爬片上，接种密度为51000细胞/cm2，将接种caco-2细胞的玻璃爬片放入37℃、5％co2的培养箱中培养48小时，使caco-2细胞在玻璃爬片上形成岛状拥有紧密连接结构的细胞集落即caco-2细胞单层膜，得到caco-2细胞玻璃爬片。2.根据权利要求1所述的caco-2细胞玻璃爬片的制备方法，其特征在于：所述ⅰ型胶原蛋白为ⅰ型鼠尾胶原蛋白。3.根据权利要求1所述的caco-2细胞玻璃爬片的制备方法，其特征在于：所述ⅰ型胶原蛋白包被液在玻璃爬片上的包被浓度为2μg/cm2。4.根据权利要求1所述的caco-2细胞玻璃爬片的制备方法，其特征在于，所述步骤s2中胰蛋白酶消化的具体步骤为：1)取汇合度达到70％的对数生长期的caco-2细胞，用pbs冲洗一次后，将2
×
106caco-2细胞装入t75培养瓶中；2)向t75培养瓶中加入1ml胰蛋白酶溶液，胰蛋白酶溶液由以下组分组成：胰蛋白酶0.105mm、edta 0.91mm、酚红指示剂0.025mm；在37℃5％co2环境孵育5分钟。5.根据权利要求1或4所述的caco-2细胞玻璃爬片的制备方法，其特征在于：所述细胞培养基由以下组分组成：earle’s盐，non-essential amino acid，l-谷氨酰胺2mm，nahco
3 2200mg/l，d-葡萄糖1000mg/l，酚红指示剂10mg/l，青霉素-链霉素100u/ml，该细胞培养基中还添加有10％(v/v)的胎牛血清fbs；ph为7.2
–
7.4。6.一种如权利要求1-5所述的方法制备的caco-2细胞玻璃爬片。7.一种如权利要求6所述的caco-2细胞玻璃爬片在筛选促渗辅料分子中的应用。8.根据权利要求7所述的caco-2细胞玻璃爬片在筛选促渗辅料分子中的应用，具体步骤为：s1、将caco-2细胞玻璃爬片置于24孔板中，并在每个孔中加入500ul细胞培养基，在37℃、5％co2潮湿培养箱中培养3天-7天，期间每两天更换一次caco-2每个孔中的细胞培养基；s2、实验当天将细胞培养基换为不含血清的hbss缓冲液，并加入待研究辅料；s3、在37℃、5％co2潮湿培养箱中孵育1-2小时后使用4％paraformaldehyde+溶于pbs中的4％蔗糖溶液固定，并使用zo-1+claudin-4/occludin/tricellulin进行荧光染色；s4、将制备好的细胞样本使用共聚焦显微镜成像，成像规格：物镜使用40
×
油镜，1024
×
1024像素，色深12bit，孔径根据波长选择1airy unit，根据使用所研究蛋白特异性抗体选择激发光波长；从细胞基底层开始拍摄间隔为0.7μm的zstack连续图像至细胞顶端，根据
荧光成像结果分析细胞膜及紧密连接蛋白结构的变化从而筛选可作为促渗剂的促渗辅料分子。

技术总结
本发明属于细胞培养领域，具体公开了一种caco-2细胞玻璃爬片及其制备方法和应用，本发明的caco-2细胞表面表达大量α2β1受体，被Ⅰ型胶原蛋白包被液包被后与Ⅰ型鼠尾胶原蛋白粘合，之后在玻璃爬片上48小时内形成岛状拥有紧密连接结构的细胞集落，增强caco-2细胞玻璃爬片贴壁能力，从而使caco-2细胞在玻璃爬片上生长并不受到表面活性剂类分子影响；使用本发明的caco-2细胞玻璃爬片可以快速用于表面活性剂类型促渗辅料的筛选。剂类型促渗辅料的筛选。剂类型促渗辅料的筛选。


技术研发人员：随宇声 袁邦皓 麦扬 窦浏
受保护的技术使用者：深圳奥礼生物科技有限公司
技术研发日：2023.05.30
技术公布日：2023/8/1