一种实用型类脑微器官的构建与应用

1.本发明属于神经科学和再生医学领域；更具体地，本发明涉及一种实用型类脑微器官的构建与应用。


背景技术：

2.随着老龄人口的增多和社会压力的增加，脑相关疾病已成为危害人类生活质量的一类重要疾病。人脑是一个高度有序的结构，由各种细胞类型组成，包括神经元、神经胶质细胞和血管细胞等。由于涉及到不同的信号在时空上的复杂相互作用，因此模拟人脑发育极具挑战性。
3.类脑器官是由干细胞衍生的3d培养物，它能在一定程度上模拟人脑的细胞和结构特征，因此也使其成为细胞治疗的重要移植材料来源。以往的研究表明，在移植到成年小鼠皮层后，人类大脑类器官可以表现出神经元成熟和相应功能，同时其中也会产生由宿主介导的血管网络。这些发现提示使用脑类器官移植治疗神经系统疾病具有广阔的前景。
4.以往的研究通过将人类大脑类器官(human cerebral organoids，hcos)移植到啮齿动物皮层来评估它们的整合和治疗效果，但此类大脑类器官在移植后，还存在一系列挑战，包括：移植体内后发生凋亡、存活率不够理想，体内分化能力(如但不限于分化为神经元细胞、周细胞样和成熟脉络丛细胞、星形胶质细胞、类周细胞或脉络丛细胞的能力)还需加强。
5.此外，成熟的大脑类器官通常会形成较大的细胞聚集体(直径可达3-5毫米)，需要使用较粗的导管进行类器官的注射，这会在整个手术过程中给健康组织带来更多的损伤，这一问题在类器官移植到深部脑区时更为突出。
6.因此，本领域迫切需要一种新的类脑器官构建技术，以尽量减少对宿主大脑的伤害。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供一种实用型类脑微器官的构建与应用。
8.在本发明的第一方面，提供一种制备类脑微器官的方法，所述方法包括：(1)培养多潜能干细胞，获得拟胚体(eb)；(2)培养(1)的拟胚体，以神经外胚层分化条件诱导，获得含有适合大小的早期类脑微器官(群)培养物，该早期类脑微器官的直径为150～600μm；较佳地为200～500μm；和(3)从(2)的培养物中分离早期类脑微器官(群)。
9.在一个或多个实施方式中，所述的步骤(1)和步骤(2)的方法为体外方法。
10.在一个或多个实施方式中，所述的早期类脑微器官包括早期类脑微器官群体。
11.在一个或多个实施方式中，所述的步骤(2)之后，即进行步骤(3)，分离出早期类脑微器官，用于移植体内。
12.在一个或多个实施方式中，所述的多潜能干细胞选自(但不限于)：多能干细胞(hpsc)、胚胎干细胞(es)或诱导多能干细胞(ips)。
13.在一个或多个实施方式中，所述的多潜能干细胞是人或非人哺乳动物的胚胎干细胞。
14.在一个或多个实施方式中，所述的非人哺乳动物包括(但不限于)：啮齿类动物(包括小鼠，大鼠，仓鼠等)，非人灵长类动物(如猴，猩猩等)，家畜(如牛，羊，狗，猪，兔等)。
15.在一个或多个实施方式中，步骤(3)中，将步骤(2)获得的早期类脑微器官(群)从培养基中分离出，加入到药学上/生理学上可接受的载体中。
16.在一个或多个实施方式中，步骤(3)中，将步骤(2)获得的早期类脑微器官(群)从培养基中分离出，消化为分离的细胞后，加入到药学上/生理学上可接受的载体中。
17.在一个或多个实施方式中，所述药学上/生理学上可接受的载体包括溶剂、悬浮剂；例如为缓冲液(ph7.2-7.6，优选ph7.3-7.5，更优选ph7.35-7.45)、生理盐水等。
18.在一个或多个实施方式中，步骤(1)中，培养时间为5
±
1天；较佳地5
±
0.5天。
19.在一个或多个实施方式中，步骤(2)中，培养时间为24～72小时；较佳地为36～60小时；更佳地为40～55小时；最佳的为48
±
2小时。
20.在一个或多个实施方式中，步骤(2)中，培养时间例如为38、40、42、44、46、48、50、52、54小时，优选的48小时。
21.在一个或多个实施方式中，步骤(1)中，培养基为拟胚体(诱导)培养基；较佳地其为eb formation medium eb形成培液(如购自stem cell technologies)。
22.在一个或多个实施方式中，步骤(2)中，培养基为类脑器官诱导培养基；较佳地其为induction medium诱导分化培液(如购自stem cell technologies)。
23.在一个或多个实施方式中，运用低吸附的培养容器进行培养。
24.在一个或多个实施方式中，所述的培养容器为培养孔板，如12、24、36、48、96、192、384孔板。
25.在一个或多个实施方式中，所述的步骤(1)中，以9000
±
5000个(如9000
±
4000个；较佳地9000
±
3000个；较佳地9000
±
2000个；更佳地9000
±
1000个)细胞每孔的密度加入低吸附96孔u底板中培养。
26.在一个或多个实施方式中，所述的步骤(2)中，将(1)的拟胚体转移入低吸附的24孔板中培养。
27.在一个或多个实施方式中，(1)中，所述的多潜能干细胞为携带报告基因或示踪标记的多潜能干细胞；较佳地，所述的报告基因通过病毒(如慢病毒、腺病毒、腺相关病毒)转染被引入所述多潜能干细胞中；更佳地，通过单细胞悬浮转染法(短时间单细胞悬浮转染法)进行病毒转染。
28.在一个或多个实施方式中，(2)中，不包括matrigel包被的步骤。
29.在本发明的另一方面，提供一种早期类脑微器官(群)，其由前面任一所述的方法制备获得。
30.在一个或多个实施方式中，所述的早期类脑微器官(群)在移植入脑、较佳地移植入(但不限于)脑纹状体、海马，皮层后，形成成熟的类脑器官，其表现如下的性能：
31.包含周细胞样和成熟脉络丛细胞(chp上皮样细胞)包围的结构(较佳地，显著性多于同时期体外培养时的微器官所含的该结构)；
32.发生神经元的分化；较佳地，其包含表达成熟神经元标记map2的神经元细胞；
33.发生星形胶质细胞分化；较佳地，其包含表达星形胶质细胞标记gfap的神经元细胞；
34.发生类周细胞分化；较佳地，其包含pdgfrβ阳性的类周细胞(同时期体外培养时的微器官不含或鲜少的该细胞)；
35.发生脉络丛细胞分化；较佳地，其包含ttr阳性的脉络丛细胞(同时期体外培养时的微器官不含或鲜少的该细胞)；和/或
36.细胞应激和/或细胞凋亡水平低(存活度好)；较佳地其caspase 3染色水平显著低(显著低于同时期体外培养时的微器官的其caspase 3水平)。
37.在一个或多个实施方式中，所述的早期类脑微器官(群)通过立体定位注射进行移植。
38.在一个或多个实施方式中，所述的“低/低于”或“高/高于”是指具有统计学意义的或具有显著性的“低/低于”或“高/高于”，例如与对照相比，“低/低于”或“高/高于”1％～99％(如2％、5％、10％、15％、20％、30％、50％、60％、80％、90％、95％或98％)。
39.在一个或多个实施方式中，所述的对照包括(但不限于)：未移植的阴性对照，或体外微器官；较佳地，所述体外微器官为体外同时期培养阶段的微器官。
40.在本发明的另一方面，提供前面任一所述的早期类脑微器官(群)的应用，用于制备脑移植用组合物，所述脑移植用组合物用于形成成熟的类脑器官，从而：
41.增加脑内周细胞样和成熟脉络丛细胞(chp上皮样细胞)包围的结构；
42.增加脑内神经元细胞(如表达成熟神经元标记map2的神经元细胞)；
43.增加脑内星形胶质细胞(如表达星形胶质细胞标记gfap的神经元细胞)；
44.增加脑内类周细胞(如pdgfrβ阳性的类周细胞)；和/或
45.增加脑内脉络丛细胞(如ttr阳性的脉络丛细胞)。
46.在本发明的另一方面，提供前面任一所述的早期类脑微器官(群)的应用，用于制备脑移植用组合物，所述脑移植用组合物用于缓解或治疗脑损伤。
47.在一个或多个实施方式中，所述的脑损伤包括(但不限于)：神经损伤、帕金森症，阿尔茨海默症，路易体痴呆，亨廷顿病、肌萎缩侧索硬化症。
48.在本发明的另一方面，提供一种脑移植用组合物，其包括：前面任一所述的早期类脑微器官(群)；以及，药学上可接受的载体。
49.在一个或多个实施方式中，所述的早期类脑微器官(群)在所述脑移植用组合物中的量为有效量。
50.在一个或多个实施方式中，所述的组合物包括药物组合物。
51.本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
52.图1、体内构建ivd类脑器官。
53.(a)ivd类脑器官构建流程。
54.(b)ivd类脑器官体内结构。
55.(c)ivd类脑器官与等量分离细胞的dapi和stem121(人源细胞标志物)染色情况。
56.(d)ivd类脑器官中map2染色情况。
57.(e)ivd类脑器官中gfap染色情况。
58.图2、ivd类脑器官的细胞构成和状态分析。
59.(a)ivd类脑器官和hcos中pdgfrβ染色情况。
60.(b)ivd类脑器官和hcos中ttr染色情况。
61.(c)ivd类脑器官和hcos中cleaved caspase3染色情况。
具体实施方式
62.本发明人致力于实用型类脑微器官的培养优化及移植研究，经过深入研究，揭示一种优化的制备类脑微器官的方法，所述方法包括诱导培养类脑器官，在适当的培养阶段收获早期类脑微器官，其在体内可继续生长和分化、产生成熟的、功能性的类脑器官。
63.术语
64.如本文所用，“类脑微器官(群)”是指由多潜能干细胞经由本发明的诱导分化获得的、具有适当大小的、适于移植且在体内能够产生成熟的类脑器官的多细胞/组织，本发明中也可称为移植物。
65.如本文所用，“器官”是指非单细胞的状态，其包含两个或更多相邻组织层，其中组织层维持一些形式的细胞-细胞和/或细胞-基质的相互作用，以产生微体系结构。在本发明中，除非另外说明，所述器官为脑器官。
66.如本文所用，“微器官培养物”或“微器官群”是指分离的细胞群，如具有分离该细胞的器官或组织的微体系结构的移植物。也就是说，分离的细胞一起形成模拟/保留空间相互作用的三维结构，如细胞-细胞，细胞-基质和细胞-基质相互作用。
67.如本文所用，“分离”是指例如“早期类脑微器官(群)”已经从培养体系/诱导体系中被独立地区分出来。
68.如本文所用，所述的“哺乳动物”是脊索动物门(chordata)脊椎动物亚门(vertebrata)哺乳纲(mammalia)的动物。所述的哺乳动物包括但不限于灵长类动物(包括人)，偶蹄目动物，食肉目动物，啮齿目动物等。本发明所述的哺乳动物包括人，也包括非人哺乳动物。所述的非人哺乳动物例如但不限于包括啮齿类动物(具体如小鼠、大鼠)，灵长类动物(具体如猿、猴、猩猩)，家畜(具体如兔、狗、兔、猪、牛、羊、马)等等。
69.在本发明的一些实施方式中，以鼠作为模式生物，和人类相比，它无论在基因组的组成、个体的发育、代谢方式、器官解剖、疾病发病机制等都和人类非常接近；因此，本发明列举的一些适用于鼠的情况可以毫无疑义地适用于人等其它哺乳动物。
70.如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由
……
构成”、“基本上由
……
构成”、和“由
……
构成”；“主要由
……
构成”、“基本上由
……
构成”和“由
……
构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。
71.如本文所用，“功能性”是指根据所描述的方法获得的精子具有与所预期的相同或相似的功能。
72.如本文所用，“分化”指谱系定型(lineage commitment)的发育过程。“谱系”指细胞发育的途径，其中前体或“祖先”细胞(本发明中为干细胞)经历渐进的生理变化以成为具有特征性功能的特定细胞/器官类型(本发明中为类脑微器官)。
73.如本文所用，“富集的早期类脑微器官(群)”指早期类脑微器官(群)经由纯化的或半纯化后的微器官(群)。
74.如本文所用，所述的“ivd”为in vivo developed organoids，体内构建类脑器官。
75.制备早期类脑微器官
76.基于本发明人的新发现，本发明提供一种以多潜能干细胞作为出发细胞、制备类脑微器官的方法，所述方法包括：(1)培养多潜能干细胞，获得拟胚体(eb)；(2)培养(1)的拟胚体，以诱导分化培养基(induction medium)诱导，获得含有适合大小的早期类脑微器官(群)培养物，该早期类脑微器官的直径为150～600μm；较佳地为200～500μm；和(3)从(2)的培养物中分离早期类脑微器官(群)。
77.本发明中，所述的“多潜能干细胞”在制备过程中，首先需要使未分化的多潜能干细胞形成拟胚体，拟胚体的培养是本领域人员已知的技术。作为本发明的优选方式，采用悬浮培养的方式制备拟胚体。在获得拟胚体后，进行脑微器官方向的诱导分化。
78.本领域中，已经有培养/诱导多潜能干细胞，获得拟胚体的商品化的试剂(培养基)，此类试剂可被应用于本发明中。作为本发明的优选方式，所述培养拟胚体的培养基为eb formation medium(购自stem cell technologies)；作为本发明的优选方式，类脑器官诱导培养基为induction medium(购自stem cell technologies)。
79.作为本发明的优选方式，培养多潜能干细胞以获得拟胚体的时间优选地为5
±
1天，较佳地5
±
0.5天。培养拟胚体以获得早期类脑微器官的时间优选地为24～72小时，较佳地为36～60小时，更佳地为40～55小时，最佳的为48
±
2小时。利用这样的培养时间设置，可以获得合适大小且移植体内后发育状态理想的移植物。
80.本发明中，“移植”、“导入”和“给予”可以互换使用，是指用使得本发明制备的早期类脑微器官(群)定位于期望部位的方法或途径，从而将本发明的早期类脑微器官(群)放置于受试者中，如同种异体或异种受试者。可以用多种适当途径将早期类脑微器官(群)给予受试者，该途径导致早期类脑微器官(群)传递到受试者中的期望部位，在那里至少一部分早期类脑微器官保持有活力。优选至少大约20％、优选至少大约40％、更优选至少大约50％、更优选至少大约60％、更优选至少大约80％、最优选至少大约85％、90％、95％、98％或99％或更多早期类脑微器官(群)在给予受试者之后保持有活力。给予受试者后早期类脑微器官进一步发育和成熟，其活力期优选地可以是长期的，如几周、几月或几年。作为本发明的优选方式，所述早期类器官通过立体定位注射移植到脑内。
81.运用本发明的培养方法以及培养基，可以通过二维培养体系或三维培养体系培养。作为本发明的优选方式，运用低吸附的培养容器进行培养。例如，所述的培养容器为培养孔板，如12、24、36、48、96、192、384孔板。
82.只要在合适的时间进行分离，本发明对分离早期类脑微器官(群)的方法没有特别的限制，可采用本领域常规使用的方法。
83.传统类脑器官移植采用成熟大脑类器官(通常尺寸较大)，易造成健康脑组织的损伤。与传统的移植成熟大脑类器官的方法相比，本发明创新性地将早期类脑微器官(具有适合的大小)注射至大脑待移植部位，其在体内可继续生长和分化、并产生成熟的类脑器官(ivd类脑器官)。
84.在一些实施方式中，本发明所述的多潜能干细胞可以为携带报告基因或示踪标记
的多潜能干细胞，从而有利于观测其体内的状态。较佳地，所述的报告基因通过病毒(如慢病毒、腺病毒、腺相关病毒)转染被引入所述多潜能干细胞中。作为本发明的优选方式，本发明人还优化了病毒转染条件，通过单细胞悬浮转染法；更佳地，所述单细胞悬浮转染法为短时间(例如1-2小时时间)单细胞悬浮转染法)进行病毒转染。由于hpsc聚集成团生长，若在普通贴壁条件下进行病毒转染，则因只能转染外圈细胞而大大降低转染效率，本发明采用短时间单细胞悬浮转染法，极大提高了转染效率并避免了长时间与病毒共孵育产生的细胞毒性，为类脑微器官的示踪标记和基因治疗提供了一种新的手段。所述的报告基因或示踪标记可以运用本领域常用的报告基因或示踪标记，例如但不仅限于gfp或egfp等。
85.作为本发明的优选方式，本发明的技术方案中，在培养获得微器官后直接将之用于移植，不运用matrigel包被移植材料。而传统类脑器官的中后期培养需要matrigel包被，覆盖在类脑器官表面的matrigel层将阻碍移植物和宿主组织间的充分接触和物质交流，如使用matrigel去除试剂处理又将不可避免地降低移植物的细胞活力。本发明中类脑微器官的制备过程不涉及matrigel包被，有效避免了上述问题。
86.在本发明中，本发明人没有移植大尺寸的成熟大脑类器官，而是创新性地将较小的早期类脑微器官注射至小鼠大脑，让它们在体内继续生长和分化以产生成熟的类脑器官(ivd类脑器官)。通过免疫染色分析，本发明人发现在ivd类脑器官中存在表达map2标记的成熟神经元细胞。同时与体外培养的人类脑器官相比，本发明人还发现在ivd类脑器官中产生了更多的周细胞样和成熟脉络丛(chp)细胞，这有利于脑内稳态的维持。更重要的是，这些ivd类脑器官还显示出细胞应激和细胞凋亡水平降低。因此，本发明人的结果表明，ivd类脑器官技术能有效降低类脑器官移植时的手术损伤风险，有望成为一种神经系统疾病的新型细胞疗法。
87.利用本发明的方法，可建立哺乳动物多潜能干细胞向早期类脑微器官(群)分化的系统，为研究哺乳动物干细胞定向分化的分子机制提供新的研究模型为微器官移植的临床研究和基础研究提供良好途径。
88.类脑微器官
89.本发明还包括采用前述的制备方法获得的早期类脑微器官(群)，较佳地，其是分离的、易于作为移植物的早期类脑微器官(群)。作为一种存在方式，所述的微器官群中，早期类脑微器官的数量占总数量的60％以上，较佳地占总数量的70％以上；更佳地占总数量的80％、85％、90％、95、98％或99％以上。
90.作为本发明的优选方式，所述早期类脑微器官(群)在移植入脑后，保持良好的活性状态，可持续发育，形成成熟的类脑器官，其表现如下的性能：包含周细胞样和成熟脉络丛细胞(chp上皮样细胞)包围的结构；发生神经元的分化；发生星形胶质细胞分化；发生类周细胞分化；发生脉络丛细胞分化。同时，所述的早期类脑微器官(群)的细胞应激和/或细胞凋亡水平低，也即体内存活率非常好。
91.利用facs和表面标记技术、rt-pcr技术或其它基因表达分析技术，可以分析器官/组织/细胞所呈现的标记物特征，例如成熟神经元标记map2、星形胶质细胞标记gfap、类周细胞标记pdgfrβ、阳性的脉络丛细胞标记ttr。
92.本发明中，起始细胞/出发细胞是哺乳动物(人或非人哺乳动物)的多潜能干细胞(如多能干细胞、胚胎干细胞或诱导多能干细胞)，或是通过商业途径购买的，而并非通过破
坏胚胎的方式获得的胚胎干细胞。所述的起始细胞/出发细胞优选的是人来源的细胞，也可以是非人哺乳动物(如兔、鼠、羊、猪、猴)来源的细胞。
93.本发明还提供了所述的早期类脑微器官的用途，用于制备脑移植用组合物，所述脑移植用组合物用于形成成熟的类脑器官，从而：增加脑内周细胞样和成熟脉络丛细胞包围的结构；增加脑内神经元细胞；增加脑内星形胶质细胞；增加脑内类周细胞；和/或增加脑内脉络丛细胞。
94.本发明还提供了所述的早期类脑微器官的用途，用于缓解或治疗脑损伤；或，用于制备脑移植用组合物，所述脑移植用组合物用于缓解或治疗脑损伤。
95.本发明的组合物包括药物组合物，其含有有效量(如1～200个，较佳地1～150个；较佳地2～100个；较佳地2～80个；较佳地2～60个；较佳地2～40个；较佳地3～30个；较佳地3～20个；较佳地3～15个；较佳地3～10个；较佳地3～8个；较佳地3～5个；例如但不限于4、6、8、9、10、12、16、18、25、35、45、55、65、75、85、95、110、120、130、140、150、160、180、190个等)的本发明的早期类脑微器官作为活性成分。
96.可将本发明的早期类脑微器官与适当的药学载体混合，制备成药物组合物的形式。所述的药物组合物对于需要的群体(例如神经元丢失严重或神经退行性疾病的患者)是有用的。
97.本发明中，“药学上可接受的”成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的物质，即有合理的效益/风险比的物质。
98.本发明中，“药学上可接受的载体(药学载体)”是用于将早期类脑微器官传送给动物或人的药学上可接受的溶剂、悬浮剂或培养液。
99.本发明的技术方案能有效降低类脑器官移植时的手术损伤风险，移植物在ivd类脑器官中可产生更多的周细胞样和成熟脉络丛(chp)细胞，这有利于脑内稳态的维持；同时这些ivd类脑器官还显示出细胞应激和细胞凋亡水平降低。
100.从移植物的体积方面而言，本发明的方法获得的早期类脑微器官能有效降低类脑器官移植时的手术损伤风险，有望成为一种神经系统疾病的新型细胞疗法。
101.从移植物的体内发育状况而言，本发明的方法获得的早期类脑微器官比之在体外较长时间培养的类器官，呈现更为优异的体内性能，例如，其呈现显著性多于同时期体外培养时的周细胞样和成熟脉络丛细胞、类周细胞、脉络丛细胞；其呈现显著低于显著低于同时期体外培养时的微器官的其caspase 3水平(凋亡率低)。
102.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如j.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
103.实施例1、早期类脑微器官的体外构建
104.用温和细胞解离试剂将人源多能干细胞(hpsc)消化成单细胞后，用fugw-gfp慢病毒转染1个小时(同时加入4mg/ml聚凝胺(polybrene)处理)，获得gfp标记的hpsc。
105.转染完后用eb培液(eb formation medium；stem cell technologies)重悬，并以9000个细胞每孔的密度加入低吸附96孔u底板中。
106.5天后将形成的eb转移入低吸附的24孔板中，每孔约1-2个，并加入诱导培液
(induction medium；stem cell technologies)继续培养2天。
107.上述培养至第7天的早期类脑微器官(直径200～500μm)，用缓冲液(hbss)清洗，注射器吸取后直接用于后续注射。之后，用于实施例2中进行移植。
108.该阶段的早期类器官具有以下特征：形态上已经初步具有类器官的构造，其中细胞构成以神经干细胞和前体为主，区别于成熟类脑器官以成熟神经元为主。
109.实施例2、体内构建ivd类脑器官及染色检测方法
110.本实施例中，将上述实施例1获得的gfp标记的hpsc分化获得的早期类脑微器官进行体内移植。
111.1、立体定位注射
112.125mg/kg三溴乙醇(medchemexpress)麻醉小鼠，并将其置于立体定向装置中。在颅骨上钻孔以暴露硬脑膜，并将三个(由于上述获得的早期类脑微器官主要细胞构成为神经干细胞和前体细胞，注射入脑内后还会继续生长和分化)早期类脑微器官或来自相同数量来自早期类脑微器官消化后的分离细胞用带有22号针头的5微升汉密尔顿注射器按以下坐标注射：类脑器官，ap:+0.5mm，ml:+2mm；分离细胞，ap:+0.5mm，ml:-2mm。注射后，将针头留在原位2分钟，然后取出，以避免回流。
113.2、免疫荧光染色
114.小鼠大脑pfa固定后，在30％蔗糖中浸泡2-3天，直到样品下沉。然后将小鼠大脑置入oct，并以30μm厚度冷冻切片。抗原修复用柠檬酸盐抗原回收液(beyotime)在95℃下进行20分钟。载玻片在4℃一抗孵育过夜，一抗用含有0.3％triton x-100和3％驴血清的pbs中稀释。pbs三次洗涤后，载玻片在室温下与二抗孵育1小时，pbs三次洗涤并用dapi共染。使用的主要抗体如下：map2(兔抗，millipore ab5622，1:500)，gfap(兔抗，dako z033401，1:1000)，stem121(鼠抗，takara y40410，1:500)，pdgfr(大鼠抗thermofisher 14-1402-81，1:500)，zbtb20(兔抗proteintech 23987-1-ap，1:200)，ttr(鼠抗r&d mab7505，1:500)使用的二级抗体如下：驴抗兔cy3(jackson immunoresearch 711-165-152，1:1000)、驴抗鼠alexa 647(jackson immunoresearch a31571，1:1000)、驴抗鼠cy3(分子探针715-165-150，1:1000)、驴抗鼠cy3(jackson immunoresearch 712-165-150，1:1000)。所有图像均使用olympus fv10i共焦显微镜进行扫描。
115.实施例3、体内分化检测
116.前述制备的gfp标记的hpsc分化的早期类脑微器官，在体外培养7天后，这些早期类器官通过立体定位注射移植到免疫缺陷小鼠的纹状体中。作为对照，本发明人还将来自相同数量从早期类脑微器官分离的细胞注射到同一只小鼠另一侧的纹状体中。体内构建ivd类脑器官的流程示意图如图1a。
117.移植8周后，本发明人通过对脑片的分析，发现gfp标记的ivd类脑器官能够很好地在宿主脑内存活，并且其中还有周细胞样和成熟脉络丛细胞(chp上皮样细胞)包围的结构。ivd类脑器官体内结构的免疫组织化学染色图如图1b。
118.ivd类脑器官与等量分离细胞的dapi和stem121(人源细胞标志物)染色情况如图1c，而在移植来自早期类脑微器官的分离细胞的对侧大脑纹状体中没有观察到这种结构。该结果表明，该类器官样结构是ivd类脑器官所特有的。
119.ivd类脑器官中map2、gfap染色情况如图1d、1e，本发明人也检测到成熟神经元标
记map2和星形胶质细胞标记gfap，提示在ivd类脑器官中的神经元和星形胶质细胞分化。
120.实施例4、ivd类脑器官的细胞构成和状态分析
121.本发明人对ivd类脑器官的细胞构成和状态进行了分析。
122.通过进一步免疫染色分析，本发明人发现ivd类脑器官中存在pdgfrβ阳性的类周细胞(图2a)和ttr阳性的脉络丛细胞(图2b)，这两者都是重要的支持性细胞，对于脑内稳态的维持具有重要调控作用，而这两种细胞在体外培养的hcos中不存在或者数量很少。
123.ivd类脑器官和hcos中cleaved caspase3染色情况如图2c。该结果显示，与体外培养的hcos相比，ivd类脑器官的caspase 3染色水平更低，提示其具有更好的存活度。
124.实施例5、不同方式进行早期类脑微器官的体外构建的比较
125.如实施例1所述的方法进行转染，获得gfp标记的hpsc。转染完后用eb培液(stem cell technologies)重悬，并以9000个细胞每孔的密度加入低吸附96孔u底板中。
126.5天后将形成的eb转移入低吸附的24孔板中，并加入诱导培液(stem cell technologies)继续培养1天、2天、5天、45天。观测所形成的类脑器官；同时，将共培养后的类脑器官移植体内，观测其后续的体内状态。结果如表1所示。
127.表1
[0128][0129]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。同时，在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。

技术特征：
1.一种制备类脑微器官的方法，其特征在于，所述方法包括：(1)培养多潜能干细胞，获得拟胚体；(2)培养(1)的拟胚体，以神经外胚层分化条件诱导，获得含有适合大小的早期类脑微器官培养物，该早期类脑微器官的直径为150～600μm；较佳地为200～500μm；和(3)从(2)的培养物中分离早期类脑微器官。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，培养时间为5
±
1天；较佳地5
±
0.5天。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，培养时间为24～72小时；较佳地为36～60小时；更佳地为40～55小时；最佳的为48
±
2小时。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，培养基为拟胚体培养基；较佳地其为eb formation medium eb形成培液；或步骤(2)中，培养基为类脑器官诱导培养基；较佳地其为induction medium诱导分化培液。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，运用低吸附的培养容器进行培养。6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(1)中，所述的多潜能干细胞为携带报告基因或示踪标记的多潜能干细胞；较佳地，所述的报告基因通过病毒转染被引入所述多潜能干细胞中；更佳地，通过单细胞悬浮转染法进行病毒转染。7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(2)中，不包括matrigel包被的步骤。8.一种早期类脑微器官，其特征在于，其由权利要求1～7任一所述的方法制备获得。9.如权利要求8所述的早期类脑微器官，其特征在于，所述的早期类脑微器官在移植入脑、较佳地移植入脑纹状体、海马，皮层后，形成成熟的类脑器官，其表现如下的性能：包含周细胞样和成熟脉络丛细胞包围的结构；发生神经元的分化；较佳地，其包含表达成熟神经元标记map2的神经元细胞；发生星形胶质细胞分化；较佳地，其包含表达星形胶质细胞标记gfap的神经元细胞；发生类周细胞分化；较佳地，其包含pdgfrβ阳性的类周细胞；发生脉络丛细胞分化；较佳地，其包含ttr阳性的脉络丛细胞；和/或细胞应激和/或细胞凋亡水平低；较佳地其caspase 3染色水平显著低。10.权利要求8～9任一所述的早期类脑微器官的应用，用于制备脑移植用组合物，所述脑移植用组合物用于形成成熟的类脑器官，从而：增加脑内周细胞样和成熟脉络丛细胞包围的结构；增加脑内神经元细胞；增加脑内星形胶质细胞；增加脑内类周细胞；和/或增加脑内脉络丛细胞。11.权利要求8～9任一所述的早期类脑微器官的应用，用于制备脑移植用组合物，所述脑移植用组合物用于缓解或治疗脑损伤。12.一种脑移植用组合物，其特征在于，其包括：权利要求8～9任一所述的早期类脑微器官；以及药学上可接受的载体。

技术总结
本发明提供了一种实用型类脑微器官的构建与应用。本发明揭示一种优化的制备类脑微器官的方法，所述方法包括诱导培养类脑器官，在适当的培养阶段收获早期类脑微器官，其在体内可继续生长和分化、产生成熟的、功能性的类脑器官。器官。


技术研发人员：裴钢 黄世超
受保护的技术使用者：中国科学院分子细胞科学卓越创新中心
技术研发日：2022.01.26
技术公布日：2023/8/4