一种羊源性基因组DNA的提取方法、试剂盒和应用

一种羊源性基因组dna的提取方法、试剂盒和应用
技术领域：
：1.本发明属于生物
技术领域：
：，具体涉及一种羊源性基因组dna的提取方法、试剂盒和应用。
背景技术：
：：2.正所谓“民以食为天”，食品安全是世界公共卫生问题中非常关键的一部分。人类生存的必要条件就是食品。蛋白质是维持人体健康的必须物质，而肉类食品中富含蛋白质和微量元素，故在食品消费中占比很大。近些年来，随着社会经济水平的不断提高，肉制食品的需求也不断提高，很多商贩为获取更多收益而出现了违法行为，将价格较低的肉类夹杂进牛羊肉后再以高价售出。这极大的影响了食品的安全问题。3.分析测试技术发展日新月异，从传统物理方法到核酸检测鉴定，肉类制品掺假的检测能力也逐渐提高。传统的物理方法是通过显微镜观察肉类样品的颗粒形态学构造来区分不同动物组织，该方法出现假阳性较少，热稳定性较为理想，不过主观因素影响较为严重，分辨力也无法保证，且无法区分动物种类1.。近年来，以特征蛋白质和核酸为目标物的肉类掺假检测技术逐渐兴起[2-5]，利用免疫学方法可以定量测定动物源成分，其中微孔板elisa在定量上的精确度较高[6-7]。胡连霞[8]等人开发了实时荧光pcr检测法对添加4类假肉的样品进行同时检测，与其他检测方法相比时间更短，能够实现快速检测。qiangwang等[9]基于数字pcr技术，建立了一种高精度的肉制品中山羊和绵羊含量定量分析方法(mgoat＝nⅹ0.0019ⅹc-3.35；msheep＝nⅹ0.0017ⅹc+2.08)，山羊和绵羊成分检测限(lod)和定量限(loq)分别为1拷贝/μl和5拷贝/μl。与其他检测方法对比来看需要的时间更少，能够实现快速检测。因此，本文将分别从光谱技术，免疫学技术和核酸检测技术等角度，针对肉类和肉类制品中具有的动物源性成分检测方法以及鉴别技术展开分析和阐述，对多种方式的优势和劣势对比分析，旨在为进一步的研究和标准制定提供参考。[0004]一、市场上常见的掺假形式[0005]羊肉含丰富的营养，味道鲜美，因此消费者对羊肉特别钟爱。但近年来，很多商贩为获取更多收益将价格较低的鸭肉和猪肉掺杂进牛羊肉后以高价售出，影响肉类市场的流通和消费者的健康。按照掺假严重性对肉类掺假进行分类，共有三种[11]。第一类是将低价肉类如鸭肉等加入到牛羊肉中再以高价出售，这种掺假方式在生活中最为常见也最为严重。且羊肉制品多是在涮火锅时食用，通过添加各种调味剂，在很大程度上掩盖了羊肉原有的味道，这也使得消费者难以简单的从感官上进行辨别。第二种是利用一些如马肉、狐狸肉以及水貂肉等非可食用的肉类进行掺假。鉴于这些肉类大多是由与皮毛生产有关的养殖场提供的，在动物饲养过程中往往无节制的使用药物，因此这类肉制品中存在很大的安全隐患。第三种是利用来源不明确的非可食用肉类在羊肉中进行掺假，常见的有：流浪的猫肉，狗肉以及老鼠肉等未经过正规的食品安全检测的肉类，此类掺假方式多见于流动商贩，因其没有固定场所，无法追踪，而且食用这些肉制品后极易感染疫病，故其行为也是最为恶劣的。[0006]二、基于光谱法的鉴别方法[0007]拉曼光谱法[0008]这种方法是通过物质分子光散射作用下非破坏指纹成像技术，对各种照射光的频率进行散射光谱研究，能够获取分子转动与振动的相关数据，可利用其完成分子结构的分析。fowler等[12]指出拉曼光谱技术之所以可以运用在食品成分检测中，是因为它可以对食品中的主要成分含量和结构进行分析，既可定性检测物质的分子结构又可定量的检测某种成分的含量。拉曼光谱法的优点在于重复性能好、灵敏且应用很简单等[13-14]。[0009]红外光谱法[0010]这种方法基本上是针对分子呈现偶极矩变化且振动状态的化合物进行分析，不同红外辐射波长对应的吸收效果也存在差异，可利用光谱图中吸收峰的波长、形状与强度展开物质的研究。一般来说分子结构特征可以通过吸收谱带长度与红外吸收带波长真实位置来体现，这在未知物质化学基团与分子结构的研究有非常关键的作用和价值[4]。另外，化学基团或者分子构成通常会对谱带吸收强度有影响，能够检测物质纯度，也能够完成定量分析。[0011]红外光谱一般分成远红外、中红外和近红外三大区域。近年来，科技进步速度持续加快，该技术因存在效率高、快捷、操作简单等有点，已广泛应用于食用油、蜂蜜、奶制品以及肉制品掺假、鉴别检测等方面。方瑶等[15]将近红外光谱，plsr偏最小二乘法以及msc多元散射校正算法相结合对金鲳鱼鱼肉进行检验。分析后可知预测集均方根误差是1.8454，即rmsep＝1.8454，决定系数(r2)是0.8841，即基于以红外光谱法为基础的预测模型对金鲳鱼肉质的检测有较高的精度。[0012]三、基于免疫学的鉴别方法[0013]环状沉淀法[0014]这种方式是可视的，通过抗体和抗原特异性融合产生肉眼可见的沉淀物。李景鹏等[16]利用环状沉淀法对牛肉中是否掺入马肉进行检测，通过观察已知血清与肉样是否产生沉淀来辨别肉类是否掺假。该方法快速，简单且特异性良好。[0015]elisa[0016]elisa即酶联免疫吸附分析法，也可以称作酶标法，这种技术方法是以免疫酶为前提研究而形成的技术[17]。elisa技术原理：有效融合待检样品与酶标抗体或者抗原，然后将其吸附在固相抗原或者抗体上，在其表面完成相应反应，液相内游离成分通过洗涤剂完成清洗，然后添加酶底物显色，定性分析依据颜色的深浅来完成；而且，被检物质与产物的含量之间存在一定联系，所以定量分析也可以开展[18]。骆训国等[19]研究夹心elisa技术法，可以对猪肉成分进行检验，这种方法捕获抗体为抗猪igg-fc单克隆抗体，检测标志物为猪肉免疫球蛋白(igg)，结果显示单抗的最佳浓度为1μg/ml，此时酶标抗体浓度为1：5000稀释，最终可以检测出混合物中猪肉掺假占比1％。该方法的优点在于快捷性、简单和特异性等。[0017]四、基于dna生物学的分析技术[0018]普通pcr[0019]因在各动物物种或个体之间，基因组dna都有其各自的特点，且终生不变，故可利用种属特异性的dna序列为靶标完成pcr反应，这种方式灵敏性非常高，已逐渐成为了检测肉类是否掺假的重要方法之一[20-22]。陈颖等[23]依据牛、羊线粒体dna序列，设计了牛和羊的特异性扩增引物，并且建立了基于pcr的牛、羊原始成分快速检测方法。利用该方法进行检测，针对于牛源性成分的检测限度最小是0.05％，山羊、绵羊源性成分对应的最低检测限依次为0.005％和0.5％，可为食品中动物源性掺假的鉴定提供有效的实际意义。[0020]荧光pcr[0021]检测扩增产物时，若应用常规pcr技术只能检测终点，实时荧光定量pcr技术指的是荧光基团融入到pcr反应系统中，对荧光信号强烈程度观测从而观察实验全过程，其中指数增长阶段数据分析最为适用，并且样品dna含量与ct值(循环数)二者间关系为线性，因此样品的定量分析可完成标准曲线制定后开展[24-25]。实时荧光定量pcr类型分为两种，即sybrgreenreal-timepcr和taqmanreal-timepcr。对于第一种pcr来说，sybr荧光染料可以实现以特异性方式插入dna双链中，并将荧光信号输出，sybr荧光染料未插入dna中则分子不会出现荧光，对于荧光信号观察过程中通过荧光信号的强弱程度来确定pcr产物含量。dna扩增以后，该技术可以通过溶解曲线对单碱基突变进行检验[26]。对于第二种pcr来说，荧光强度改变是通过荧光标记探针的荧光基团解离来实现的。在探针完整的情况下，猝灭基团可以把报告基团的荧光信号吸收；而扩增过程中，探针被酶切，两基团分离，故产生荧光信号并被接收，最终通过荧光信号的强弱来观测产物的形成。这样的方式主要特点是模板与探针融合和水解使特异性更强，而且电泳不需要进行，流程得以简化，实现单个反应将多种肉类同时进行鉴定。wang等[27]以taqmanreal-timepcr为基础，根据牦牛细胞色素b基因设计特异性引物和探针，并与其他动物物种的dna进行扩增。实践验证可知，扩增曲线仅牦牛能够形成，并且和其他物种dna之间不存在交叉反应，灵敏度可达到0.001％，对牛肉的掺假检测有十分重要的意义。[0022]数字pcr[0023]实时荧光定量pcr在肉及其制品的检测上可以准确的定性或定量，简便快捷。不过也有较多因素对其扩增效率有所影响，针对标准样和样品之间的扩增效率的不同进行对比分析，反应过程中的差异等都会导致ct值发生变化，相应就会使标准曲线出现偏差，最终导致实验误差的产生。然而，随着相关检测部门的要求越来高，原本的实时荧光定量pcr显然已经无法满足需求。在此情况下，数字pcr(digitalpcr)应运而生。数字pcr并非依靠循环阈值完成定量，而且扩增效率不会因其他因子而被影响，因此对于dna复制数量的绝对定量是能够实现的，重复性和准确性都也较为理想。ddpcr一般有两个实验步骤，先完成pcr扩增，然后研究荧光信号。pcr扩增时稀释待测样品为单分子后再实验，并在扩增结束后采集各个反应单元的荧光信号，然后利用泊松分布计算所测样品dna的原始含量和浓度大小[28]。王珊等[29]利用已知羊肉和猪肉源性特异性引物和探针对羊肉制品中羊肉源和猪肉源性成分进行了微滴数字pcr反应，同时和sn/t2051-2008标准下实时荧光定量pcr方法对比分析，分析后发现对于肉类制品中猪肉和羊肉源性成分的检测，利用这两种方法都可以，不过定量分析dna模板时，最准确的方式还是微滴数字pcr技术。[0024]食品掺假问题作为全球性的公共问题将会长期存在，但是传统的物理学方法，即依靠感官的形态学鉴别已经不能满足日益发展的监管与检测要求。目前，鉴别方法的适用性和简便性这两大问题亟待解决。近年来，基于光谱、免疫学、核酸的检测方法应运而生，但是对于经过深加工处理的肉类，如牛肉干、卤牛肉、火锅肥羊等肉类的检测方法就存在一定的局限性，故研究开发可以精确检测加工后样品的方法对市场监管的发展具有重要作用。其次，结合各种技术的检测方法大多依赖于一些大型进口仪器，这些仪器在生活中不常用，大多都在规模较大的实验室中配备，这对现场快速检测造成了一定的难度。因此，开发操作简便，低成本，仪器设备简单便携的方法对现场检测工作效率的提高有极大的现实意义。[0025]用pcr方法检测动物产品中牛、羊源性成分时，首先要提取dna，而不同材料的dna提取方法有所不同。dna的质量关系到pcr的成败，dna要尽可能纯化，否则会干扰反应，降低检测的灵敏度和重复性。目前dna的常用提取方法有以下几种：[0026]ctab法：ctab是一种阳离子去污剂，能与核酸形成复合物，此复合物在高盐(》0.7mol/l)浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度(0.1～0.5mol/lnacl)下ctab-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。经离心弃上清后，ctab-核酸复合物再用70％酒精浸泡可洗脱掉ctab。[0027]蛋白酶k法：蛋白酶k是一种从白色念珠菌分离出来的强力蛋白溶解酶，具有很高的比活性，是dna提取的关键试剂。该酶在较广的ph范围(4～12.5)内及高温(50～70℃)均有活性，用于质粒或基因组dna、rna的分离。在dna提取中，主要作用是酶解与核酸结合的组蛋白，使dna游离在溶液中，随后用不同方法进行抽提，除去杂质，收集dna。[0028]sds法：sds是一种阴离子去垢剂，在高温(55～65℃)条件下能裂解细胞，使染色体离析、蛋白变性，同时sds与蛋白质和多糖结合成复合物，释放出核酸；提高盐(kac或nh4ac)浓度并降低温度(冰浴)，使sds-蛋白质复合物转变为溶解度更小的钾盐形式，使蛋白质及多糖杂质沉淀更加完全，离心后除去沉淀；上清液中的dna用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的dna。sds法操作简单，温和，也可提取到高分子量的dna，但所得到的产物含糖类杂质较多。技术实现要素：[0029]为了解决上述的技术问题，本技术尝试在蛋白酶k法的基础上，向裂解液的组成成分中添加了一种化学螯合树脂chelex-100，同时与上述几种常用的dna提取方法进行比较，筛选得到了高质量羊源性基因组dna的提取方法。采用本技术方法可以在进行大量提取时保证dna质量，且提取的dna可作为羊源性成分检测中的dna模板，具有适宜实验的浓度和纯度。[0030]为了实现上述的发明目的，本发明采用了以下的技术方案：[0031]一种羊源性基因组dna的提取方法，所述方法包括以下步骤：[0032](1)用手术刀切取动物组织，再将组织剁成匀浆状，之后将组织匀浆转移到离心管中；[0033](2)加入含有蛋白酶k的50-60℃预热的裂解液，旋涡振荡使组织匀浆分散开，使组织与裂解液充分接触；之后将离心管转移至50-60℃水浴锅中直至组织匀浆全部溶解，水浴期间每隔一段时间都需重新旋涡振荡，防止组织匀浆沉底，帮助组织溶解；[0034](3)加入抽提液，盖紧管盖，振荡使其混匀；≥12000g离心5分钟；[0035](4)吸取步骤(3)中的上清液，转移到一个新的离心管中；[0036](5)重复抽提步骤(3)和(4)一至两次；[0037](6)吸取步骤(5)中的上清液，加入6ml异丙醇，盖紧管盖，使上清液和异戊醇混匀；[0038](7)吸取步骤(6)中15ml混合液加入核酸纯化柱中，盖上管盖，≥12000g离心1分钟；[0039](8)弃离心管中的滤液，将所述核酸纯化柱置回到离心管中，在所述核酸纯化柱中加入10ml洗脱液，盖上管盖，≥12000g离心1分钟；[0040](9)弃离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到离心管中，在核酸纯化柱中加入15ml乙醇，盖上管盖，≥12000g离心1分钟；[0041](10)重复步骤(10)一次；[0042](11)弃离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到离心管中，≥12000g离心5分钟；[0043](12)弃离心管，将核酸纯化柱置于一个新的离心管中，在核酸纯化柱中加入1-3ml50-60℃温育的te，盖上管盖，50-60℃恒温培养箱中静置5分钟，≥12000g离心1分钟；[0044](13)弃核酸纯化柱，洗脱的dna可立即用于后续实验；或将dna储存于-20℃备用；[0045](14)测dna浓度和纯度。[0046]其中，所述裂解液中含有chelex-100。[0047]作为优选，所述裂解液由以下组成成分构成：nacl、tris-hcl、edta,ph8.0、sds、proteinasek、chelex-100和无菌水。[0048]作为优选，所述裂解液中各组成成分的终浓度如下：nacl100mm；tris-hcl10mm；edta,ph8.025mm；sds0.5％；proteinasek0.1mg/ml和chelex-1005％。[0049]作为优选，所述抽提液包含以下组成成分：苯酚、氯仿和异戊醇。[0050]作为优选，所述抽提液中苯酚、氯仿和异戊醇的体积比为25：24:：1。[0051]作为优选，所述裂解液的加入量为每1g动物组织加入7.5ml。[0052]作为优选，所述抽提液的加入量为每1g动物组织加入7.5ml。[0053]作为优选，所述洗脱液为75％乙醇。[0054]进一步，本技术提供了一种羊源性基因组dna提取试剂盒，所述试剂盒采用所述的方法。[0055]进一步，本技术提供了所述的方法和所述的试剂盒在羊源性基因组dna提取中的应用。[0056]采用本发明的有益技术效果：[0057]1、本技术采用的chelex-100是一种由苯乙烯、二乙烯苯共聚体组成的化学螯合树脂，含有成对的亚氨基二乙酸盐离子，可螯合多价离子，特别是对高价金属离子有很高的亲和力和螯合作用。在低离子强度、碱性及煮沸的条件下，可以使细胞膜破裂，并使蛋白质变性，通过离心除去chelex颗粒，使其结合的物质与dna分离。本技术将其作为裂解液的组成成分，同时通过调整其他组分的浓度，较好地促进和保护了基因组dna的溶出，得到的dna完整度和纯度较好。[0058]2、本技术方法可以应用于大量提取，且能够保证提取到的羊源性基因组dna质量符合实验要求。[0059]3、本技术方法还可以解决动物源性dna提取速度慢的技术问题，尤其适合羊源性基因组dna提取。具体实施方式[0060]下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清查、完整的描述，进而进一步解释发明。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例。给予本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。[0061]实施例1实验材料试剂[0062]样品选用羊肉、牛肉、鸡肉和鸭肉四种生肉，均来自于浙江省农业科学院畜牧所。[0063]试剂如表1所示：[0064]表1[0065][0066]实施例2核酸提取方法的筛选[0067]本技术的dna提取方法步骤如下：[0068](1)用手术刀切取动物组织(≤2.5g)，再将组织剁成匀浆状(尽量挑选不带筋膜的组织)，之后将组织匀浆转移到一个50ml离心管中。[0069](2)加入15ml含有蛋白酶k的56℃预热的裂解液，旋涡振荡数秒使组织匀浆分散开，使组织与裂解液充分接触。之后将离心管转移至56℃水浴锅中直至组织匀浆全部溶解(时间约为1-2小时)，水浴期间每隔一段时间都需重新旋涡振荡，防止组织匀浆沉底，帮助组织溶解。[0070](3)加入15ml抽提液，盖紧管盖，振荡使其混匀。≥12000g离心5分钟。[0071](4)吸取步骤3中的上清液，转移到一个新的50ml离心管中。[0072](5)重复抽提步骤3和4一至两次。[0073](6)吸取上一步中的上清液，加入6ml异丙醇，盖紧管盖，使上清液和异戊醇混匀。[0074](7)吸取15ml混合液加入核酸纯化柱中，盖上管盖，≥12000g离心1分钟。[0075](8)弃50ml离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到50ml离心管中，在核酸纯化柱中加入10ml洗脱液，盖上管盖，≥12000g离心1分钟。[0076](9)弃50ml离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到50ml离心管中，在核酸纯化柱中加入15ml乙醇，盖上管盖，≥12000g离心1分钟。[0077](10)重复步骤10一次。[0078](11)弃50ml离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到50ml离心管中，≥12000g离心5分钟。[0079](12)弃50ml离心管，将核酸纯化柱置于一个新的50ml离心管中，在纯化柱中加入1-3ml56℃温育的te，盖上管盖，56℃恒温培养箱中静置5分钟，≥12000g离心1分钟。[0080](13)弃纯化柱，洗脱的dna可立即用于后续实验；或将dna储存于-20℃备用。[0081]所提取的dna用nanodrop2000和qubit2.0进行纯度和浓度的检验[0082]裂解液组成如表2所示：[0083]表2[0084][0085]注：添加无菌水至20ml。使用前添加新鲜蛋白酶k。[0086]抽提液：苯酚-氯仿-异戊醇(体积比为25：24:：1)。[0087]洗脱液：75％乙醇。[0088]快速提取法：选用的是安普未来的试剂盒，通过试剂盒提供的裂解液在95℃水浴一步提取。[0089]实施例3提取结果比较分析[0090]表3[0091][0092]通过分析比较不同动物源性样品以及不同提取方法所得dna纯度和浓度数据，可以发现，本技术dna提取方法有以下优势：[0093]在标准物质的制备过程中，由于需要大量的dna样品，故在dna的提取步骤中要求所提取的dna浓度和纯度都应达到较高的水平。因此，相较于其他的提取方法，本实验的提取方法，在实验时间上适中；所提取出的dna浓度较高，且纯度教好；同时能满足标准物质制备中需要的份量，一次提取最终可得到1-3ml的目标dna溶液，缩短了标准物质制备的时间，为之后的方法建立及各项指标的定期检测创造了更充足的时间。也使实验结果更加准确，减少了提取不纯所带来的误差。[0094]参考文献[0095][1]任君安，黄文胜，葛毅强，等.肉制品真伪鉴别技术研究进展[j].食品科学，2016，37(1):247－257.[0096][2]xiaofuwang，tingtang，qingmeimiao，etal.detectionoftransgenicricelinett51-1inprocessedfoodsusingconventionalpcr，real-timepcr，anddropletdigitalpcr[j].foodcontrol98(2019)380-388.[0097][3]mingfu，quanwangzhang，xiangzhou，etal.recombinasepolymeraseamplificationbasedmultiplexlateralflowdipstickforfastidentificationofduckingredientinadulteratedbeef[j].animals，2020，10，1765[0098][4]李宗梦，赵良娟，赵宏，等.肉及肉制品动物源性成分鉴别技术研究进展[j].食品研究与开发，2014，35(18):122－127.[0099][5]石盼盼，李旭，魏法山，等.肉类掺假的分子生物学检测[j].食品与生物技术学报，2017，36(7):773－777.[0100][6]任秀，骆海朋，崔生辉.酶联免疫吸附法和dna检测法在肉类鉴别中的应用[j].中国食品卫生杂志，2015(1):93－98.[0101][7]王守云，袁明美，封聪，等.肉类掺假鉴别技术研究进展[j].肉类研究，2017，31(4):56－61。[0102][8]胡连霞，孙晓霞，陈启跃，等.gnmc7-8实时荧光pcr系统对掺假肉制品中多种动物源性成分的同时检测[j].食品工业科技，2019(14):240-246.[0103][9]qiangwang，yicuncai，yupinghe，etal.dropletdigitalpcr(ddpcr)methodforthedetectionandquantificationofgoatandsheepderivativesincommercialmeatproducts[j].eurfoodrestechnol(2018)244:767–774.[0104][10]o’mahonypj.findinghorsemeatinbeefproducts‑‑aglobalproblem[j].qjm:monthlyjournaloftheassociationofphysicians，2013，106(6):595-597.[0105][11]孟楠，樊振江.肉及肉制品动物源性成分鉴别技术研究进展[j].现代食品，2016(22):82-84.[0106][12]fowlersm，schmidt.ramanspectroscopycomparedagainsttraditionalpredictorsofshearforceinlambm.longissimuslumborum[j].meatscience，2014，98(4):652-656.[0107][13]赵淑平，何栩翊，卢静，等.拉曼光谱检测技术应用[j].科技经济市场，2018(1):1-2.[0108][14]nieuwoudtmk，holroydse，mcgoverincm，etal.rapid，sensitive，andreproduciblescreeningofliquidmilkforadulterantsusingaportableramanspectrometerandasimple，optimizedsamplewell[j].journalofdairyscience，2016，99:7821-7831.[0109][15]方瑶，谢天铧，郭渭，等.基于近红外光谱的金鲳鱼新鲜度快速检测技术[j].江苏农业学报，2021，37(1):213-218.[0110][16]李景鹏，王君伟，宣世伟，等.应用免疫学技术鉴别鲜牛肉和马肉的试验研究[j].黑龙江畜牧兽医，1990(8):7-9.[0111][17]张占军，王富花.酶联免疫吸附技术及其在食品安全检测中的应用[j].食品研究与开发，2011，32(1):157-160.[0112][18]c.h.s.hitchcock；a.a.crimes；l.weeks；j.s.woodhead；r.n.smith.moderntechniquesandapplicationsinimmunoassay[j].analyticalproceedings，1983(20):413-418.[0113][19]骆训国，栗绍文，周蕾蕾，等.夹心elisa方法检测生肉混合物中的猪肉成分的研究[j]，动物医学进展，2010，31(202):20-22.[0114][20]fangx，zhangc.detectionofadulteratedmurinecomponentsinmeatproductsbytaqmanreal-timepcr[j].foodchemistry，2016，192:485－490.[0115][21]erwantoy，rohmana，arsyantil，tal.identificationofpigdnainfoodproductsusingpolymerasechainreaction(pcr)forhalalauthentication—areview[j].int.foodres.j.，2018，25(4):1322－1331.[0116][22]kimmj，kimhy.afastmultiplexreal-timepcrassayforsimultaneousdetectionofpork，chicken，andbeefincommercialprocessedmeatproducts[j/ol].foodsci.technol.，2019，114:108390[2020－11－16].https://doi.org/10.1016/j.lwt.2019.108390.[0117][23]陈颖，钱增敏，徐宝梁，等.保健品中牛羊源性成分的pcr检测[j].食品科学，2004，25(10):215-218.[0118][24]soaress，amaraljs，mafrai，etal.quantitativedetectionofpoultrymeatadulterationwithporkbyaduplexpcrassay[j].meatscience，2010，85(3):531-536.[0119][25]primroses，woolfem，rollinsons.foodforensics:methodsfordeterminingtheauthenticityoffoodstuffs[j].trendsinfoodscience&technology，2010，21(12):582-590.[0120][26]ballinnz，madsenkg.sexdeterminationinbeefbymeltingcurveanalysisofpcrampliconsfromtheamelogeninlocus[j].meatscience，2007，77(3):384-348.[0121][27]wangping，huyue，yanghairong，etal.dna-basedauthenticationmethodfordetectionofyak(bosgrunniens)inmeatproducts[j].journalofaoacinternational，2013，96(1):142-146.[0122][28]林彩琴，姚波.数字pcr技术进展[j].化学进展，2012，24(12):2415-2423.[0123][29]王珊，李志娟，苗丽.微滴式数字pcr与实时荧光ocr检测羊肉制品中羊源和猪源性成分方法的比较[j].肉品安全与检测，2015，7，38-41.[0124]以上为对本发明实施例的描述，通过对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的。本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施列，而是要符合与本文所公开的原理和新颖点相一致的最宽的范围。当前第1页12当前第1页12
技术特征：
1.一种羊源性基因组dna的提取方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：（1）用手术刀切取动物组织，再将组织剁成匀浆状，之后将组织匀浆转移到离心管中；（2）加入含有蛋白酶k的50-60℃预热的裂解液，旋涡振荡使组织匀浆分散开，使组织与裂解液充分接触；之后将离心管转移至50-60℃水浴锅中直至组织匀浆全部溶解，水浴期间每隔一段时间都需重新旋涡振荡，防止组织匀浆沉底，帮助组织溶解；（3）加入抽提液，盖紧管盖，振荡使其混匀；≥12000g离心5分钟；（4）吸取步骤（3）中的上清液，转移到一个新的离心管中；（5）重复抽提步骤（3）和（4）一至两次；（6）吸取步骤（5）中的上清液，加入6ml异丙醇，盖紧管盖，使上清液和异戊醇混匀；（7）吸取步骤（6）中15ml混合液加入核酸纯化柱中，盖上管盖，≥12000g离心1分钟；（8）弃离心管中的滤液，将所述核酸纯化柱置回到离心管中，在所述核酸纯化柱中加入10ml洗脱液，盖上管盖，≥12000g离心1分钟；（9）弃离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到离心管中，在核酸纯化柱中加入15ml乙醇，盖上管盖，≥12000g离心1分钟；（10）重复步骤（10）一次；（11）弃离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到离心管中，≥12000g离心5分钟；（12）弃离心管，将核酸纯化柱置于一个新的离心管中，在核酸纯化柱中加入1-3ml 50-60℃温育的te，盖上管盖，50-60℃恒温培养箱中静置5分钟，≥12000g离心1分钟；（13）弃核酸纯化柱，洗脱的dna可立即用于后续实验；或将dna储存于-20℃备用；（14）测dna浓度和纯度；其中，所述裂解液中含有chelex-100。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述裂解液由以下组成成分构成：nacl、tris-hcl、edta, ph 8.0、sds、proteinase k、chelex-100和无菌水。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述裂解液中各组成成分的终浓度如下：nacl 100mm；tris-hcl 10mm；edta, ph 8.0 25mm；sds 0.5%；proteinase k 0.1 mg/ml和chelex-100 5%。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抽提液包含以下组成成分：苯酚、氯仿和异戊醇。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述抽提液中苯酚、氯仿和异戊醇的体积比为25：24:：1。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述裂解液的加入量为每1g动物组织加入7.5ml。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抽提液的加入量为每1g动物组织加入7.5ml。8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述洗脱液为75%乙醇。9.一种羊源性基因组dna提取试剂盒，其特征在于，所述试剂盒采用权利要求1-7任意一项权利要求所述的方法。10.权利要求1-7任意一项权利要求所述的方法和权利要求8所述的试剂盒在羊源性基因组dna提取中的应用。

技术总结
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种羊源性基因组DNA的提取方法、试剂盒和应用。本申请尝试在蛋白酶K法的基础上，向裂解液的组成成分中添加了一种化学螯合树脂Chelex-100，同时与上述几种常用的DNA提取方法进行比较，筛选得到了高质量羊源性基因组DNA的提取方法。采用本申请方法可以在进行大量提取时保证DNA质量，且提取的DNA可作为羊源性成分检测中的DNA模板，具有适宜实验的浓度和纯度。具有适宜实验的浓度和纯度。


技术研发人员：陈笑芸 余卉茹 纪艺 徐俊锋 汪小福 彭城 魏巍
受保护的技术使用者：浙江省农业科学院
技术研发日：2023.01.10
技术公布日：2023/8/5