载体化抗体和其用途的制作方法

载体化抗体和其用途
1.相关申请
2.本技术要求于2020年9月9日提交的美国临时专利申请序列号63/075,898以及于2021年4月26日提交的美国临时专利申请序列号63/179,990的优先权，所述美国临时专利申请的全部公开内容通过引用特此并入本文。
3.序列表
4.本技术含有序列表，所述序列表已以ascii格式以电子方式提交并以全文引用的方式特此并入(所述ascii副本创建于2021年9月8日，命名为“404217-hmw-042wo_185407_st25.txt”并且大小为252,035个字节)。


背景技术：

5.治疗性抗体代表一类有效的药物，它们对感兴趣的靶标具有高度特异性。然而，许多抗体需要较大的个体剂量和定期施用才能达到预期的治疗效果。对于在患者的血清中发现的高浓度抗体靶标尤其如此。例如，抗补体成分5(c5)抗体用于治疗c5介导的疾病，如阵发性睡眠性血红蛋白尿症(pnh)、视神经脊髓炎谱系障碍(nmosd)和非典型溶血性尿毒症综合征(ahus)，由于血清中的c5丰度高，故需要多次大剂量的抗体。
6.病毒传递机制为传统抗体治疗提供了一种有吸引力的替代方法，特别是对于在患者的血清中发现的高浓度抗体靶标。具体来说，单次施用具有抗体重链和轻链表达盒的病毒载体有可能在受试者的血清中产生持续治疗水平的抗体，从而无需持续施用高剂量的抗体。
7.因此，本领域需要改进的病毒载体以在受试者中有效并持续地表达抗体。


技术实现要素：

8.本文提供了用于在细胞中表达抗体(例如，抗补体成分5(c5)抗体)的重组腺相关病毒(raav)组合物，以及用所述组合物治疗病症(例如，与c5活性相关的病症(例如阵发性睡眠性血红蛋白尿症))的方法。还提供了用于制备raav组合物的组合物、系统和方法。
9.因此，在一个方面，本公开提供了一种重组腺相关病毒(raav)基因组，所述raav基因组包括：
10.(a)第一表达盒，所述第一表达盒从5'到3'包括：
11.第一肝特异性转录调控元件，
12.第一编码序列，所述第一编码序列编码可操作地连接到第一信号序列的包括抗体重链的第一多肽，以及
13.第一聚腺苷酸化序列；和
14.(b)第二表达盒，所述第二表达盒从5'到3'包括：
15.第二肝特异性转录调控元件，
16.第二编码序列，所述第二编码序列编码可操作地连接到第二信号序列的包括抗体轻链的第二多肽，以及
17.第二聚腺苷酸化序列，
18.其中所述第一编码序列和所述第二编码序列的表达产生包括所述抗体重链和所述抗体轻链的抗体。
19.在某些实施例中，第一转录调控元件和/或第二转录调控元件包括选自由以下组成的组的启动子元件：人白蛋白启动子、人运甲状腺素蛋白(ttr)启动子、人甲状腺素结合球蛋白(tbg)启动子、人apoh启动子、人serpina1(haat)启动子和其肝特异性调控模块，例如人apoe/c-i肝控制区(hcr)1或2。
20.在某些实施例中，第一转录调控元件和/或第二转录调控元件包括包含与选自由seq id no:25、27、66、68、69、116和117组成的组的序列至少90％相同的核酸序列的启动子元件。
21.在某些实施例中，转录调控元件包括与seq id no:27中所示的核苷酸序列至少90％相同的核苷酸序列。在某些实施例中，转录调控元件包括seq id no:27中所示的核苷酸序列。在某些实施例中，转录调控元件的核苷酸序列由seq id no:27中所示的核苷酸序列组成。
22.在某些实施例中，转录调控元件包括与seq id no:67中所示的核苷酸序列至少90％相同的核苷酸序列。在某些实施例中，转录调控元件包括seq id no:67中所示的核苷酸序列。在某些实施例中，转录调控元件的核苷酸序列由seq id no:67中所示的核苷酸序列组成。
23.在某些实施例中，第一表达盒和/或第二表达盒还包括内含子元件，所述内含子元件相对于第一编码序列和/或第二编码序列位于5'并且相对于转录调控元件位于3'。
24.在某些实施例中，内含子元件是外源性内含子元件，任选地其中所述外源性内含子元件是sv40内含子元件或小鼠微小病毒(mvm)内含子元件。
25.在某些实施例中，sv40内含子元件包括与seq id no:29中所示的核苷酸序列至少90％相同的核苷酸序列。在某些实施例中，sv40内含子元件包括seq id no:29中所示的核苷酸序列。在某些实施例中，sv40内含子元件的核苷酸序列由seq id no:29中所示的核苷酸序列组成。
26.在某些实施例中，mvm内含子元件包括与seq id no:30中所示的核苷酸序列至少90％相同的核苷酸序列。在某些实施例中，mvm内含子元件包括seq id no:30中所示的核苷酸序列。在某些实施例中，mvm内含子元件的核苷酸序列由seq id no:30中所示的核苷酸序列组成。
27.在某些实施例中，第一转录调控元件和第二转录调控元件相同。
28.在某些实施例中，第一转录调控元件包括hcr 1元件、haat启动子和sv40内含子元件，并且第二转录调控元件包括serpina1肝特异性调控模块、ttr启动子和mvm内含子元件。
29.在某些实施例中，第一转录调控元件包括seq id no:50的核酸序列并且第二转录调控元件包括seq id no:43的核酸序列。
30.在某些实施例中，第一表达盒和/或第二表达盒还包括相对于第一编码序列和/或第二编码序列在3'的聚腺苷酸化序列。
31.在某些实施例中，聚腺苷酸化序列是外源性聚腺苷酸化序列，任选地其中外源性聚腺苷酸化序列是sv40聚腺苷酸化序列或牛生长激素(bgh)聚腺苷酸化序列。
32.在某些实施例中，sv40聚腺苷酸化序列包括与seq id no:31中所示的核苷酸序列至少90％相同的核苷酸序列。在某些实施例中，sv40聚腺苷酸化序列包括seq id no:31中所示的核苷酸序列。在某些实施例中，sv40聚腺苷酸化序列的核苷酸序列由seq id no:31中所示的核苷酸序列组成。
33.在某些实施例中，bgh聚腺苷酸化序列包括与seq id no:33中所示的核苷酸序列至少90％相同的核苷酸序列。在某些实施例中，bgh聚腺苷酸化序列包括seq id no:33中所示的核苷酸序列。在某些实施例中，bgh聚腺苷酸化序列的核苷酸序列由seq id no:33中所示的核苷酸序列组成。
34.在某些实施例中，第一表达盒和第二表达盒包括相同的聚腺苷酸化序列。
35.在某些实施例中，第一表达盒包括sv40聚腺苷酸化序列。在某些实施例中，第二表达盒包括bgh聚腺苷酸化序列。
36.在某些实施例中，第一聚腺苷酸化序列包括seq id no:31的核酸序列并且第二聚腺苷酸化序列包括seq id no:33的核酸序列。
37.在某些实施例中，第一表达盒和第二表达盒在raav基因组中处于相同的取向。在某些实施例中，第一表达盒和第二表达盒在raav基因组中呈相反的取向。
38.在某些实施例中，第一表达盒和第二表达盒呈相反的取向，其中第一聚腺苷酸化序列和第二聚腺苷酸化序列在raav基因组中位于远端。
39.在某些实施例中，raav基因组还包括插入第一转录调控元件与第二转录调控元件之间的填充序列。
40.在某些实施例中，填充序列包括β珠蛋白聚腺苷酸化序列。在某些实施例中，β珠蛋白聚腺苷酸化序列包括seq id no:51的核酸序列。
41.在某些实施例中，raav基因组从5'到3'包括：(a)包括seq id no:33的核酸序列的第一聚腺苷酸化序列；(b)第一编码序列；(c)包括seq id no:27的核酸序列的第一肝特异性转录调控元件；(d)包括seq id no:51的核酸序列的填充序列；(e)包括seq id no:67的核酸序列的第二肝特异性转录调控元件；(f)第二编码序列；(g)包括seq id no:31的核酸序列的第二转录聚腺苷酸化序列。
42.在某些实施例中，raav基因组从5'到3'包括：第一表达盒的反向补体；填充序列；和第二表达盒。
43.在某些实施例中，raav基因组包括：(a)第一表达盒，所述第一表达盒从5'到3'包括：与seq id no:27中所示的核苷酸序列至少90％相同的核苷酸序列、第一编码序列、与seq id no:33中所示的核苷酸序列至少90％相同的核苷酸序列；(b)填充序列，所述填充序列包括与seq id no:51中所示的核苷酸序列至少90％相同的核苷酸序列或其反向补体；以及(c)第二表达盒，所述第二表达盒从5'到3'包括：与seq id no:67中所示的核苷酸序列至少90％相同的核苷酸序列、第二编码序列、与seq id no:31中所示的核苷酸序列至少90％相同的核苷酸序列。
44.在某些实施例中，raav基因组包括：(a)第一表达盒，所述第一表达盒从5'到3'包括：与seq id no:67中所示的核苷酸序列至少90％相同的核苷酸序列、第一编码序列、与seq id no:31中所示的核苷酸序列至少90％相同的核苷酸序列；(b)填充序列，所述填充序列包括与seq id no:51中所示的核苷酸序列至少90％相同的核苷酸序列或其反向补体；以
id no:25中所示的核苷酸序列、seq id no:26中所示的核苷酸序列、第二编码序列、第一聚腺苷酸化序列。
51.在一个方面，本公开提供了一种raav基因组，所述raav基因组包括双顺反子表达盒，所述双顺反子表达盒从5'到3'包括：
52.(a)肝特异性转录调控元件；第一编码序列，所述第一编码序列编码可操作地连接到第一信号序列的包括抗体重链的第一多肽；核糖体跳跃序列，所述核糖体跳跃序列编码核糖体跳跃肽；第二编码序列，所述第二编码序列编码可操作地连接到第二信号序列的包括抗体轻链的第二多肽；以及聚腺苷酸化序列，或
53.(b)肝特异性转录调控元件；第二编码序列，所述第二编码序列编码可操作地连接到第二信号序列的包括抗体轻链的第二多肽；核糖体跳跃序列，所述核糖体跳跃序列编码核糖体跳跃肽；第一编码序列，所述第一编码序列编码可操作地连接到第一信号序列的包括抗体重链的第一多肽；以及聚腺苷酸化序列，
54.其中所述双顺反子表达盒的表达产生包括所述抗体重链和所述抗体轻链的抗体。
55.在某些实施例中，转录调控元件包括选自由以下组成的组的启动子元件：人白蛋白启动子、人运甲状腺素蛋白(ttr)启动子、人甲状腺素结合球蛋白(tbg)启动子、人apoh启动子、人serpina1(haat)启动子和其肝特异性调控模块，例如人apoe/c-i肝控制区(hcr)1或2。
56.在某些实施例中，转录调控元件包括启动子元件，所述启动子元件包括与选自由seq id no:25、27、66、68、69、116和117组成的组的序列至少90％相同的核酸序列。
57.在某些实施例中，转录调控元件包括与seq id no:27中所示的核苷酸序列至少90％相同的核苷酸序列。在某些实施例中，转录调控元件包括seq id no:27中所示的核苷酸序列。在某些实施例中，转录调控元件的核苷酸序列由seq id no:27中所示的核苷酸序列组成。
58.在某些实施例中，转录调控元件包括与seq id no:67中所示的核苷酸序列至少90％相同的核苷酸序列。在某些实施例中，转录调控元件包括seq id no:67中所示的核苷酸序列。在某些实施例中，转录调控元件的核苷酸序列由seq id no:67中所示的核苷酸序列组成。
59.在某些实施例中，双顺反子表达盒还包括内含子元件，所述内含子元件相对于第一编码序列和/或第二编码序列位于5'并且相对于转录调控元件位于3'。
60.在某些实施例中，内含子元件是外源性内含子元件，任选地其中所述外源性内含子元件是sv40内含子元件或小鼠微小病毒(mvm)内含子元件。
61.在某些实施例中，sv40内含子元件包括与seq id no:29中所示的核苷酸序列至少90％相同的核苷酸序列。在某些实施例中，sv40内含子元件包括seq id no:29中所示的核苷酸序列。在某些实施例中，sv40内含子元件的核苷酸序列由seq id no:29中所示的核苷酸序列组成。
62.在某些实施例中，mvm内含子元件包括与seq id no:30中所示的核苷酸序列至少90％相同的核苷酸序列。在某些实施例中，mvm内含子元件包括seq id no:30中所示的核苷酸序列。在某些实施例中，mvm内含子元件的核苷酸序列由seq id no:30中所示的核苷酸序列组成。
63.在某些实施例中，转录调控元件包括：
64.a)hcr 1元件、haat启动子和sv40内含子元件；或
65.b)serpina1肝特异性调控模块、ttr启动子和mvm内含子元件。
66.在某些实施例中，转录调控元件包括seq id no:50的核酸序列或seq id no:43的核酸序列。
67.在某些实施例中，聚腺苷酸化序列是外源性聚腺苷酸化序列，任选地其中外源性聚腺苷酸化序列是sv40聚腺苷酸化序列或牛生长激素(bgh)聚腺苷酸化序列。
68.在某些实施例中，sv40聚腺苷酸化序列包括与seq id no:31中所示的核苷酸序列至少90％相同的核苷酸序列。在某些实施例中，sv40聚腺苷酸化序列包括seq id no:31中所示的核苷酸序列。在某些实施例中，sv40聚腺苷酸化序列的核苷酸序列由seq id no:31中所示的核苷酸序列组成。
69.在某些实施例中，bgh聚腺苷酸化序列包括与seq id no:33中所示的核苷酸序列至少90％相同的核苷酸序列。在某些实施例中，bgh聚腺苷酸化序列包括seq id no:33中所示的核苷酸序列。在某些实施例中，bgh聚腺苷酸化序列的核苷酸序列由seq id no:33中所示的核苷酸序列组成。
70.在某些实施例中，第一信号序列和/或第二信号序列是天然存在的信号序列。在某些实施例中，第一信号序列和/或第二信号序列是抗体信号序列，任选地人igg2或igk信号序列。在某些实施例中，第一信号序列和/或第二信号序列是非天然存在的信号序列。在某些实施例中，第一信号序列和/或第二信号序列包括seq id no:80的氨基酸序列。在某些实施例中，第一信号序列和/或第二信号序列包括seq id no:81的氨基酸序列。在某些实施例中，第一信号序列包括seq id no:80的氨基酸序列并且第二信号序列包括seq id no:81的氨基酸序列。在某些实施例中，第一编码序列和/或第二编码序列包括seq id no:23、96、102或108中所示的核酸序列中的任一者。在某些实施例中，第一编码序列和/或所述第二编码序列包括seq id no:24、99、105、111或130中所示的核酸序列中的任一者。在某些实施例中，第一编码序列包括seq id no:23、96、102或108中所示的核酸序列中的任一者并且第二编码序列包括seq id no:24、99、105、111或130中所示的核酸序列中的任一者。
71.在某些实施例中，抗体特异性结合于补体c5。
72.在某些实施例中，抗体重链包括seq id no:64的氨基酸序列。在某些实施例中，抗体重链包括seq id no:82的氨基酸序列。在某些实施例中，抗体轻链包括seq id no:77的氨基酸序列。
73.在某些实施例中，第一编码序列和/或第二编码序列已被优化以在人细胞中表达。
74.在某些实施例中，第一编码序列包括seq id no:52、113、114或115中所示的核酸序列中的任一者。
75.在某些实施例中，第一编码序列包含seq id no:83、94、95、101或107中所示的核酸序列中的任一者。
76.在某些实施例中，第二编码序列包含seq id no:53、98、104、110或131中所示的核酸序列中的任一者。
77.在某些实施例中，第一编码序列包括选自由seq id no:52、62、83、94、95、96、97、101、102、103、107、108、109、113、114和115组成的组的核苷酸序列，并且第二编码序列包括
seq id no:53中所示的核苷酸序列。
78.在某些实施例中，第一编码序列包括选自由seq id no:52、62、83、94、95、96、97、101、102、103、107、108、109、113、114和115组成的组的核苷酸序列，并且第二编码序列包括seq id no:63中所示的核苷酸序列。
79.在某些实施例中，第一编码序列包括选自由seq id no:52、62、83、94、95、96、97、101、102、103、107、108、109、113、114和115组成的组的核苷酸序列，并且第二编码序列包括seq id no:98中所示的核苷酸序列。
80.在某些实施例中，第一编码序列包括选自由seq id no:52、62、83、94、95、96、97、101、102、103、107、108、109、113、114和115组成的组的核苷酸序列，并且第二编码序列包括seq id no:99中所示的核苷酸序列。
81.在某些实施例中，第一编码序列包括选自由seq id no:52、62、83、94、95、96、97、101、102、103、107、108、109、113、114和115组成的组的核苷酸序列，并且第二编码序列包括seq id no:100中所示的核苷酸序列。
82.在某些实施例中，第一编码序列包括选自由seq id no:52、62、83、94、95、96、97、101、102、103、107、108、109、113、114和115组成的组的核苷酸序列，并且第二编码序列包括seq id no:104中所示的核苷酸序列。
83.在某些实施例中，第一编码序列包括选自由seq id no:52、62、83、94、95、96、97、101、102、103、107、108、109、113、114和115组成的组的核苷酸序列，并且第二编码序列包括seq id no:105中所示的核苷酸序列。
84.在某些实施例中，第一编码序列包括选自由seq id no:52、62、83、94、95、96、97、101、102、103、107、108、109、113、114和115组成的组的核苷酸序列，并且第二编码序列包括seq id no:106中所示的核苷酸序列。
85.在某些实施例中，第一编码序列包括选自由seq id no:52、62、83、94、95、96、97、101、102、103、107、108、109、113、114和115组成的组的核苷酸序列，并且第二编码序列包括seq id no:110中所示的核苷酸序列。
86.在某些实施例中，第一编码序列包括选自由seq id no:52、62、83、94、95、96、97、101、102、103、107、108、109、113、114和115组成的组的核苷酸序列，并且第二编码序列包括seq id no:111中所示的核苷酸序列。
87.在某些实施例中，第一编码序列包括选自由seq id no:52、62、83、94、95、96、97、101、102、103、107、108、109、113、114和115组成的组的核苷酸序列，并且第二编码序列包括seq id no:112中所示的核苷酸序列。
88.在某些实施例中，raav基因组是单链raav基因组。
89.在某些实施例中，raav基因组是自互补raav基因组。
90.在某些实施例中，raav基因组包括seq id no:84的核酸序列。在某些实施例中，raav基因组包括seq id no:85的核酸序列。在某些实施例中，raav基因组包括seq id no:86的核酸序列。在某些实施例中，raav基因组包括seq id no:87的核酸序列。
91.在某些实施例中，raav基因组还包括相对于第一聚腺苷酸化序列在5'的5'反向末端重复(5'itr)核苷酸序列和相对于第二聚腺苷酸化序列在3'的3'反向末端重复(3'itr)核苷酸序列。
id no:16的氨基酸68相对应的氨基酸是v；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸77相对应的氨基酸是r；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸119相对应的氨基酸是l；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸151相对应的氨基酸是r；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸160相对应的氨基酸是d；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸206相对应的氨基酸是c；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸296相对应的氨基酸是h；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸312相对应的氨基酸是q；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸346相对应的氨基酸是a；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸464相对应的氨基酸是n；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸468相对应的氨基酸是s；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸501相对应的氨基酸是i；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸505相对应的氨基酸是r；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸590相对应的氨基酸是r；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸626相对应的氨基酸是g或y；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸681相对应的氨基酸是m；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸687相对应的氨基酸是r；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸690相对应的氨基酸是k；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸706相对应的氨基酸是c；或者所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸718相对应的氨基酸是g。
118.在某些实施例中，
119.(a)所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸2相对应的氨基酸是t，并且所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸312相对应的氨基酸是q；
120.(b)所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸65相对应的氨基酸是i，并且所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸626相对应的氨基酸是y；
121.(c)所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸77相对应的氨基酸是r，并且所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸690相对应的氨基酸是k；
122.(d)所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸119相对应的氨基酸是l，并且所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸468相对应的氨基酸是s；
123.(e)所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸626相对应的氨基酸是g，并且所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸718相对应的氨基酸是g；
124.(f)所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸296相对应的氨基酸是h，所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸464相对应的氨基酸是n，所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸505相对应的氨基酸是r，并且所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸681相对应的氨基酸是m；
125.(g)所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸505相对应的氨基酸是r，并且所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸687相对应的氨基酸是r；
126.(h)所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸346相对应的氨基酸是a，并且所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸505相对应的氨基酸是r；或者
127.(i)所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸501相对应的氨基酸是i，所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸505相对应的氨基酸是r，并且所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸706相对应的氨基酸是c。
128.在某些实施例中，所述衣壳蛋白包括seq id no:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16或17的氨基酸1-736的氨基酸序列。
129.在一个方面，本公开提供了一种多核苷酸，其包括seq id no:85-93中所示的核酸序列。
130.在一个方面，本公开提供了一种药物组合物，其包括上文所描述的raav或上文所描述的多核苷酸。
131.在一个方面，本公开提供了一种用于制备raav的包装系统，其中所述包装系统包括：
132.(a)第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列编码一个或多个aav rep蛋白；
133.(b)第二核苷酸序列，所述第二核苷酸序列编码如上文所描述的raav的衣壳蛋白；以及
134.(c)第三核苷酸序列，所述第三核苷酸序列包括如上文所描述的raav的raav基因组序列。
135.在某些实施例中，包装系统包括包含第一核苷酸序列和第二核苷酸序列的第一载体，以及包括第三核苷酸序列的第二载体。
136.在某些实施例中，包装系统还包括包含一个或多个辅助病毒基因的第四核苷酸序列。在某些实施例中，第四核苷酸序列包括在第三载体内。在某些实施例中，第四核苷酸序列包括来自选自由以下组成的组的病毒的一个或多个基因：腺病毒、疱疹病毒、牛痘病毒和巨细胞病毒(cmv)。
137.在某些实施例中，第一载体、第二载体和/或第三载体是质粒。
138.在一个方面，本公开提供了一种用于重组制备raav的方法，所述方法包括在借以产生raav的条件下将上文所描述的包装系统引入细胞中。
139.在另一方面，本公开提供了如本文所描述的raav、如本文所描述的药物组合物或如本文所描述的多核苷酸，其用作药物。
140.在另一方面，本公开提供了上文所描述的raav、上文所描述的药物组合物或上文所描述的多核苷酸，其用于治疗补体c5相关疾病。
141.在另一方面，本公开提供了上文所描述的raav、上文所描述的药物组合物或上文所描述的多核苷酸，其用于治疗患有补体c5相关疾病的受试者的方法中，所述方法包括向所述受试者施用有效量的raav、药物组合物或多核苷酸。
142.在一个方面，本公开提供了一种在受试者中产生抗体的方法，所述方法包括向所述受试者施用上文所描述的药物组合物。
143.在某些实施例中，药物组合物静脉内施用。
144.在一个方面，本公开提供了一种治疗有需要的受试者的补体c5相关疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的上文所描述的raav、上文所描述的药物组合物或上文所描述的多核苷酸。
145.在某些实施例中，补体c5相关疾病选自由以下组成的组：地图状萎缩(ga)、吉兰-巴雷综合征(guillain-barr
é
syndrome)、重症肌无力、系统性红斑狼疮性(sle)肾炎、增生性肾炎、哮喘、类风湿性关节炎、败血症、阵发性睡眠性血红蛋白尿症(pnh)、非典型溶血性尿毒症综合征(ahus)和年龄相关性黄斑变性(amd)。
146.在某些实施例中，raav、药物组合物或多核苷酸静脉内施用。
附图说明
147.图1描绘了raav载体c5ab01、c5ab02、c5ab03和c5ab04的表达盒的载体图。
148.图2a-图2i描绘了显示接受包装在aavhsc13、aavhsc15或aavhsc17衣壳中的抗c5抗体表达载体(c5ab02、c5ab03和c5ab04)的nod scid小鼠的血清中的抗c5抗体浓度的图。图2a描绘了显示接受1e13 vgs/kg剂量的包装在aavhsc13或aavhsc17衣壳中的载体c5ab04的小鼠的血清中的抗c5抗体浓度的图。将雄性和雌性小鼠的数据分离，并且在23周的时间段内采集多个血清样品。图2b描绘了显示图2a中的结果的图，y轴为对数标度。图2c描绘了显示接受1e13 vgs/kg剂量的包装在aavhsc17衣壳中的载体c5ab02的小鼠的血清中的抗c5抗体浓度的图。将雄性和雌性小鼠的数据分离，并且在16周的时间段内采集多个血清样品。图2d描绘了显示图2c中的结果的图，y轴为对数标度。图2e描绘了显示接受1e13 vgs/kg剂量的各自包装在aavhsc15或aavhsc17衣壳中的载体c5ab02、c5ab03或c5ab04的小鼠的血清中的抗c5抗体浓度的图。显示雄性小鼠的数据，并且在16周的时间段内采集多个血清样品。图2f显示以线图格式描绘的图2e中的结果，并且图2g显示以线图格式描绘的图2e中的结果，y轴为对数标度。图2h描绘了显示接受5e11 vgs/kg、5e12 vgs/kg、1.4e13 vgs/kg、4.4e13 vgs/kg和1.8e14 vgs/kg 5种剂量的包装在aavhsc17衣壳中的载体c5ab04的小鼠的血清中的抗c5抗体浓度的图。显示雄性小鼠的数据，并且在13周的时间段内采集多个血清样品。图2i描绘了显示图2h中的结果的图，y轴为对数标度。
149.图3a-图3c描绘了显示接受抗c5抗体表达载体的nod scid雄性小鼠的血清中的抗c5抗体浓度的图。数据来源于以上图2并且进行排序以比较包装在aavhsc13、aavhsc15或aavhsc17衣壳中的载体c5ab02、c5ab03或c5ab04。图3a描绘了显示接受1e13 vgs/kg剂量的包装在aavhsc13衣壳中的载体c5ab04的小鼠的血清中的抗c5抗体浓度的图。图3b描绘了显示接受1e13 vgs/kg剂量的包装在aavhsc15衣壳中的载体c5ab02、c5ab03或c5ab04的小鼠的血清中的抗c5抗体浓度的图。图3c描绘了显示接受1e13 vgs/kg剂量的包装在aavhsc17衣壳中的载体c5ab02、c5ab03或c5ab04的小鼠的血清中的抗c5抗体浓度的图。
150.图4a描绘了比较接受抗c5抗体依库珠单抗(eculizumab)和雷夫利珠单抗(ravulizumab)长期维持疗法的pnh患者中的预测抗c5抗体浓度与在使用aavhsc13或aavhsc17衣壳的nod scid雄性和雌性小鼠中测量的抗c5抗体浓度的图(数据来自图2b)。图4b描绘了比较接受抗c5抗体依库珠单抗和雷夫利珠单抗的pnh患者中的预测抗c5抗体浓度与在使用aavhsc17衣壳的nod scid和huliv小鼠中测量的抗c5抗体浓度的图(代表性数据来自图2a、2i和8b)。
151.图5描绘了在离体溶血测定中在各种浓度的抗c5抗体下活化绵羊红细胞(rbc)的溶血％的图。将抗c5对照抗体与从用aavhsc13包装的c5ab04和aavhsc17包装的c5ab04处理的小鼠获得的血清进行比较。
152.图6a描绘了血清抗体浓度的图并且图6b描绘了在离体溶血测定中活化绵羊rbc的溶血％的图。将阴性对照小鼠血清与在各自以1e13 vgs/kg之剂量施用后1周、3周、5周、7周和9周从用aavhsc13包装的c5ab04和aavhsc17包装的c5ab04处理的小鼠获得的血清进行比较。图6c描绘了显示图6b中的结果的图，其中溶血％由到施用后19周获得的血清样品确定并以线图呈现。图6d描绘了离体溶血测定中活化绵羊rbc的溶血％的图，所述测定使用从用aavhsc17包装的c5ab02以1e13 vgs/kg的剂量处理的小鼠获得的血清进行。图6e描绘了离
体溶血测定中活化绵羊rbc的溶血％的图，所述测定使用从用aavhsc15或aavhsc17包装的c5ab02、c5ab03或c5ab04各自以1e13 vgs/kg的剂量处理的小鼠获得的血清进行。图6f描绘了离体溶血测定中活化绵羊rbc的溶血％的图，所述测定使用从用aavhsc17包装的c5ab04以5e11 vgs/kg、5e12 vgs/kg、1.4e13 vgs/kg、4.4e13vgs/kg和1.8e14 vgs/kg的剂量处理的小鼠获得的血清进行。在图6a-6f中，分离雄性和雌性小鼠的数据，并且图6e和6f中的数据来自雄性小鼠。
153.图7a-图7b描绘了对以下进行比较的图：在c57bl/6(frgc57)或nod(frgnod)背景中frgko人源化肝脏小鼠(下文称为huliv，yecuris)的血清中的人c5水平与人血清中发现的人c5水平(图7a)；和在c57bl6或nod背景中huliv小鼠的血清中的小鼠c5水平(图7b)。frgc57_供体a代表具有来自患者供体a的肝细胞的huliv小鼠(n＝3)。frgc57_供体b代表具有来自患者供体b的肝细胞的huliv小鼠(n＝3)。nod_供体a代表来自具有来自患者供体a的肝细胞的同源nod小鼠的huliv小鼠(n＝9)。
154.图8a描绘了施用100μg抗c5抗体(生物仿制药)或1e13 vgs/kg或1e14 vgs/kg剂量的包装在aavhsc17衣壳中的c5ab04的huliv小鼠中抗c5抗体的血清抗体浓度的图，在各种情况下在施用之后0周、1周、3周和5周。在图8a中，pb指示抽血前。图8b显示图8a中描绘的数据，其中血清抗体浓度在施用之后第11周确定，以线图呈现。图8c描绘了离体溶血测定中活化绵羊rbc的溶血％的图，所述测定使用从施用100μg抗c5抗体(生物仿制药)或1e13 vgs/kg或1e14 vgs/kg剂量的包装在aavhsc17衣壳中的c5ab04的小鼠获得的血清进行。图8d描绘了显示从施用单剂量的100μg抗c5抗体(生物仿制物)或1e13 vg/kg或1e14 vg/kg剂量的包装在aavhsc17衣壳中的c5ab04的小鼠获得的血清中检测到的小鼠c5水平的图。图9a-图9b描绘了在经包装在aavhsc15或aavhsc17衣壳中的c5ab02、c5ab03或c5ab04转导的原代人类和小鼠肝细胞的培养基中人c5水平的蛋白质印迹(图9a)和人igg elisa数据(9b)。
具体实施方式
155.本文提供了用于在细胞(例如，肝细胞)中表达抗体(例如，抗c5抗体)的raav基因组和raav，以及使用所述raav基因组和raav治疗病症(例如，与c5活性相关的病症(例如阵发性睡眠性血红蛋白尿症))的方法。还提供了用于制备raav的核酸、载体、包装系统和方法。
156.i.定义
157.如本文所使用的，术语“重组腺相关病毒”或“raav”是指包括缺乏功能性rep和帽基因的基因组的aav。
158.如本文所使用的，术语“raav基因组”是指包括raav的基因组序列的核酸分子(例如，dna和/或rna)。本领域的技术人员将理解，当raav基因组包括转基因(例如，可操作地连接到转录调控元件的抗体重链或轻链编码序列)时，raav基因组可以相对于转基因转录的方向处于有义或反义定向。
159.如本文所使用的，术语“aav衣壳蛋白”是指aav vp1、vp2或vp3衣壳蛋白。
160.如本文所用，两个核苷酸序列之间或两个氨基酸序列之间的“同一性百分比”是通过将所比对的序列对之间的匹配数目乘以100并除以所比对的区域的长度(包含内部空位)来计算。同一性评分仅对完美匹配进行计数，并且不考虑氨基酸彼此之间的相似性程度。应
注意，长度中仅包含内部间隙，不包含序列末端处的间隙。
161.如本文所用，术语“编码序列”是指互补dna(cdna)的编码多肽的部分，其开始于起始密码子并且终止于终止密码子。基因可由于替代性剪接、替代性翻译起始和群体内的变化而具有一个或多个编码序列。编码序列可以是野生型的、沉默变更的或内含子插入性。示例性抗c5重链编码序列在seq id no:52和83中示出。一示例性抗c5轻链编码序列在seq id no:53中示出。编码序列可以进行密码子优化。可以进行密码子优化以增强编码序列在期望宿主细胞(例如人细胞)中的表达。示例性密码子优化抗c5重链编码序列在seq id no:94、95、101、107、113、114和115中示出。示例性密码子优化抗c5轻链编码序列在seq id no:98、104、110或131中示出。
162.在某些实施例中，两个或更多个编码序列(例如抗体重链编码序列和抗体轻链编码序列)可以被编码肽裂解序列的核苷酸序列(例如2a肽核糖体跳跃元件)分开。示例性2a肽裂解序列在seq id no:28或125(t2a肽裂解序列)或128(p2a肽裂解序列)中示出。2a肽裂解序列还可包括弗林蛋白酶裂解序列和接头。具有弗林蛋白酶裂解序列和接头的示例性2a肽裂解序列在seq id no:127或129中示出。
163.如本文所使用的，术语“聚腺苷酸化序列”是指当转录成rna时构成聚腺苷酸化信号序列的dna序列。聚腺苷酸化序列可以是天然的或外源性的。外源性聚腺苷酸化序列可以是哺乳动物或病毒聚腺苷酸化序列(例如，牛生长激素聚腺苷酸化序列或sv40聚腺苷酸化序列)。
164.如本文所使用的，术语“内含子元件”是指调节(例如，控制、增加或减少)转基因的表达的顺式作用核苷酸序列，例如，dna序列。在某些实施例中，内含子元件是经修饰的内含子，例如，合成内含子序列。在某些实施例中，内含子元件是外源性内含子元件，并且源自对其可调节的转基因是外源性的内含子。在某些实施例中，内含子元件包括经修饰的剪接受体和/或剪接供体，从而产生更稳健的剪接活性。虽然不希望受理论的束缚，但假设内含子可以增加转基因表达，例如，通过减少转录沉默和增强mrna从细胞核向细胞质的输出。技术人员将理解，可以设计合成内含子序列以通过引入本领域已知的任何共有剪接基序来介导rna剪接(例如，在sibley等人,(2016)《自然评论：遗传学》,17,407-21中，所述文献通过引用整体并入本文)。示例性内含子序列在lu等人,(2013)《分子疗法》21(5):954-63以及lu等人,(2017)《人类基因疗法》28(1):125-34中提供，所述文献通过引用整体并入本文。
165.如本文所使用的，术语“以沉默方式改变”是指在不改变由编码序列或经填充子插入的编码序列编码的多肽的氨基酸序列的情况下基因的编码序列的改变(例如通过核苷酸取代)。此类沉默变更的有利之处在于，其可提高编码序列的翻译效率，和/或在编码序列被转导到细胞中时防止与内源性基因的对应序列重组。
166.如本文所使用的，术语“转录调控元件”或“tre”是指顺式作用核苷酸序列，例如，dna序列，其通过rna聚合酶调节(例如，控制、增加或减少)可操作连接的核苷酸序列的转录以形成rna分子。tre依靠一种或多种反式作用分子，如转录因子来调接转录。因此，一个tre在其与不同的反式作用分子接触时(例如当其位于不同类型的细胞中时)可以不同方式调节转录。tre可以包括一种或多种启动子元件和/或增强子元件。所属领域的技术人员将了解，基因中的启动子和增强子元件可在位置上靠近，并且术语“启动子”可指包括启动子元件和增强子元件的序列。因此，术语“启动子”不排除序列中的增强子元件。启动子和增强子
元件无需来源于相同基因或物种，并且每个启动子或增强子元件的序列可与基因组中的对应内源性序列一致或大体上一致。
167.如本文所用，术语“可操作地连接”用于描述tre与待转录的编码序列之间的连接。通常，使基因表达处于包括一种或多种启动子和/或增强子元件的tre的控制下。如果编码序列的转录由tre控制或影响，那么编码序列“可操作地连接”于tre。tre的启动子和增强子元件可自编码序列呈任何定向和/或距离，只要获得所需转录活性即可。在某些实施例中，tre位于编码序列的上游。
168.在本公开中，相对于起始密码子的第一核苷酸，指定抗体编码序列(例如，抗体重链编码序列或抗体轻链编码序列)中的核苷酸位置。起始密码子的第一核苷酸是位置1；相对于起始密码子的第一核苷酸在5'的核苷酸具有负数；相对于起始密码子的第一核苷酸在3'的核苷酸具有正数。
169.如本文所使用的，术语“表达盒”是指从5'到3'包括转录调控元件(tre)、编码多肽的编码序列和聚腺苷酸化序列的多核苷酸序列。在某些实施例中，内含子存在于tre与编码序列之间。在某些实施例中，编码序列编码抗体重链或抗体轻链。
170.如本文所使用的，在向受试者施用aav的情形下，术语“有效量”是指达到所期望的预防或治疗效果的aav的量。
171.如本文所使用的，在提及如抗体(例如，抗体重链和抗体轻链)的表达水平等可测量值时，术语“约”或“大约”涵盖给定值或范围的
±
20％或
±
10％、
±
5％、
±
1％或
±
0.1％的变化，如执行本文所公开的方法所适合的。
172.ii.腺相关病毒组合物
173.在一个方面，本文提供了新颖raav基因组，其包括可操作地连接到抗体编码序列(例如，抗c5抗体重链编码序列和/或抗c5抗体轻链编码序列)的至少一部分的转录调控元件(tre)。本文提供的raav基因组可用于包括raav基因组的细胞中的抗体的染色体外表达。
174.raav基因组可以用于在任何哺乳动物细胞(例如，人细胞)中表达抗体。因此，tre可以在任何哺乳动物细胞(例如，人细胞)中具有活性。在某些实施例中，tre在广泛的人细胞中具有活性。此类tre可以包括组成型启动子和/或增强子元件，所述组成型启动子和/或增强子元件包含巨细胞病毒(cmv)启动子/增强子(例如，包括与seq id no:54、55或56至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核苷酸序列)、sv40启动子、鸡actb启动子(例如，包括与seq id no:47或57至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核苷酸序列)、jet启动子(例如，包括与seq id no:58至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核苷酸序列)、smcba启动子(例如，包括与seq id no:59至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核苷酸序列)、人延伸因子1α(ef1α)启动子(例如，包括与seq id no:39至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核苷酸序列)、包括转录因子结合位点的小鼠微小病毒(mvm)内含子(例如，包括与seq id no:30或61至少80％、81％、82％、83％、84％、
85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核苷酸序列)、人磷酸甘油酸激酶(pgk1)启动子、人泛素c(ubc)启动子、人β肌动蛋白启动子、人神经元特异性烯醇化酶(eno2)启动子、人β-葡萄糖醛酸酶(gusb)启动子、兔β-珠蛋白元件(例如，包括与seq id no:41至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核苷酸序列)、人钙调蛋白1(calm1)启动子(例如，包括与seq id no:44至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核苷酸序列)和/或人甲基-cpg结合蛋白2(mecp2)启动子。这些tre中的任一个可以任何顺序组合以驱动有效转录。例如，raav基因组可以包括cmv增强子、cba启动子和来自兔β-珠蛋白基因的外显子3的剪接受体，统称为cag启动子(例如，包括与seq id no:42至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核苷酸序列)。例如，raav基因组可以包括cmv增强子和cba启动子的杂合体，随后是剪接供体和剪接受体，统称为casi启动子区(例如，包括与seq id no:48或65至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核苷酸序列)。
175.可替代地，tre可以是组织特异性tre，即，其在特定组织和/或器官中是活性的。组织特异性tre包括一个或多个组织特异性启动子和/或增强子元件，和任选地一个或多个组成型启动子和/或增强子元件。所属领域的技术人员将理解，可通过所属领域中熟知的方法从组织中特异性表达的基因分离组织特异性启动子和/或增强子元件。
176.在某些实施例中，tre是肝特异性的(例如，肝细胞特异性的)。示例性肝特异性tre可以包括选自由以下组成的组的一个或多个元件：人白蛋白启动子、人运甲状腺素蛋白(ttr)启动子(例如，包括与seq id no:66至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核苷酸序列)、人apoe/c-i肝控制区(hcr)1(例如，包括与seq id no:25或68至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核苷酸序列)、人apoh启动子和人serpina1(haat)启动子(例如，包括与seq id no:26、69或70至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核苷酸序列)或其肝特异性调控模块(例如，包括与seq id no:71至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核苷酸序列)。在某些实施例中，haat启动子区包括与seq id no:72至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核苷酸序列。在某些实施例中，肝特异性tre包括如yan等人(《基因》(2016)506,289-294)中所述的tbg serpina7启动子(例如包括与seq id no:116至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核苷酸序列)。在某些实施例中，肝特异性tre包括如hayashi等人(《分子内分泌》(1993)7(8),1049-1060)中所述的tbg serpina7启动子(例如，包括与seq id no:117至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、
86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核苷酸序列)。在某些实施例中，肝特异性tre包括如hafenrichter等人(《血液》(1994)84(10),3394-3404)中所述的haat serpina1启动子(例如，包括与seq id no:118至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核苷酸序列)。在某些实施例中，肝特异性tre包括如costa等人(《分子与细胞生物学》(1988)8(1),81-90)中所述的ttr启动子(例如，包括与seq id no:119至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核苷酸序列)。在某些实施例中，肝特异性tre包括如kan等人(《核酸研究》(1999)27(4),1104-1117)中所述的apoa2启动子(例如，包括与seq id no:120至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核苷酸序列)。在某些实施例中，肝特异性tre包括如tang等人(《生物医学报告》(2017)6,627-632)中所述的白蛋白启动子(例如，包括与seq id no:121至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核苷酸序列)。在某些实施例中，肝特异性tre包括如kyostio-moore等人(《分子疗法》(2016)3,16006)中所述的修饰纤维蛋白原启动子(例如，包括与seq id no:122至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核苷酸序列)。在某些实施例中，肝特异性tre包括如dang等人(《生物化学杂志》(1995)270(38),22557-85)中所述的最小人apoe/c-i肝控制区(hcr)1启动子(例如，包括与seq id no:123至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核苷酸序列)。在某些实施例中，肝特异性tre包括如allan等人(《生物化学杂志》(1995)270(44)、26278-81)中所述的人apoe/c-i肝控制区(hcr)2启动子(例如，包括与seq id no:124至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核苷酸序列)。更多肝特异性启动子元件公开于wo 2009/130208和kramer等人,(《分子疗法》(2003)7,375-385)，所述文献通过引用整体并入本文。
177.在某些实施例中，raav基因组包括两个或更多个tre，任选地包括上文所公开的tre中的至少一种。所属领域的技术人员将理解，这些tre中的任一个可以任何顺序组合，并且组成型tre和组织特异性tre的组合可驱动有效和组织特异性转录。例如，在某些实施例中，raav基因组包括人hcr1(例如，包括与seq id no:25、68或123至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核苷酸序列)和人ef-1α启动子(例如，包括与seq id no:39至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核苷酸序列)，任选地其中所述人hcr1相对于所述人ef-1α启动子在5'。在某些实施例中，raav基因组包括与seq id no:60中所示的序列核苷酸至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核苷酸序列。
178.类似地，两种或更多种组织特异性tre的组合可以驱动有效和组织特异性转录。例
如，在某些实施例中，raav基因组包括人hcr1(例如，包括与seq id no:25、68或123至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核苷酸序列)和haat启动子(例如，包括与seq id no:26至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核苷酸序列)，任选地其中所述人hcr1相对于所述haat启动子在5'。在某些实施例中，raav基因组包括与seq id no:27中所示的核苷酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核苷酸序列。在某些实施例中，raav基因组包括人hcr1(例如，包括seq id no:25中所示的核苷酸序列)和haat启动子(例如，包括seq id no:26中所示的核苷酸序列)，任选地其中所述人hcr1相对于所述haat启动子在5'。在某些实施例中，raav基因组包括seq id no:27中所示的核苷酸序列。
179.在某些实施例中，raav基因组包括haat启动子(例如，包括与seq id no:71至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核苷酸序列)和人ttr启动子(例如，包括与seq id no:66至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核苷酸序列)的肝特异性调控模块，任选地其中所述肝特异性调节模块相对于所述人ttr启动子在5'。在某些实施例中，raav基因组包括与seq id no:67中所示的核苷酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核苷酸序列。在某些实施例中，raav基因组包括haat启动子(例如，包括seq id no:71中所示的核苷酸序列)和人ttr启动子(例如，包括seq id no:66中所示的核苷酸序列)的肝特异性调控模块，任选地其中所述肝特异性调控模块相对于所述人ttr启动子在5'。在某些实施例中，raav基因组包括seq id no:67中所示的核苷酸序列。
180.在某些实施例中，raav基因组还包括相对于抗体编码序列的至少一部分在5'的内含子元件。此类内含子元件可以增加转基因表达，例如，通过减少转录沉默和增强mrna从细胞核向细胞质的输出。在某些实施例中，raav基因组从5'到3'包括：tre、内含子元件以及抗体编码序列的至少一部分。
181.内含子元件可以包括免疫球蛋白基因的天然内含子序列的至少一部分，或者内含子元件可以是外源性内含子元件(例如，至少包括来自不同物种的内含子序列或来自相同物种的不同基因，和/或合成内含子序列)。在某些实施例中，内含子元件是包括来自不同物种的内含子序列的至少一部分的外源性内含子元件。在某些实施例中，内含子元件是包括来自相同物种的不同基因的内含子序列的至少一部分的外源性内含子元件。在某些实施例中，内含子元件是包括合成内含子序列的外源性内含子元件。在某些实施例中，内含子元件是包括至少来自不同物种的内含子序列或来自相同物种的不同基因的组合和/或合成内含子序列的外源性内含子元件。
182.技术人员将理解，可以设计内含子元件以通过引入本领域已知的任何共有剪接基序来介导rna剪接(例如，在sibley等人,(2016)《自然评论：遗传学》,17,407-21中，所述文献通过引用整体并入本文)。示例性内含子序列在lu等人,(2013)《分子疗法》21(5):954-63以及lu等人,(2017)《人类基因疗法》28(1):125-34中提供，所述文献通过引用整体并入本
文。
183.在某些实施例中，raav基因组包括外源性内含子元件。在某些实施例中，raav包括sv40内含子元件(例如，包括与seq id no:29至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核苷酸序列)、小鼠微小病毒(mvm)内含子(例如，包括与seq id no:30或61至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核苷酸序列)或合成内含子(例如，包括与seq id no:45至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核苷酸序列)。在某些实施例中，raav基因组包括sv40内含子元件(例如，包括seq id no:29中所示的核苷酸序列)或小鼠微小病毒(mvm)内含子元件(例如，包括seq id no:30和61中所示的核苷酸序列)或合成内含子(例如，包括seq id no:45中所示的核苷酸序列)。
184.在某些实施例中，raav基因组从5'到3'包括：tre和内含子元件。在某些实施例中，组合的tre和内含子元件与seq id no:43或50具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在某些实施例中，组合的tre和内含子元件包括seq id no:43或50的核苷酸序列。在某些实施例中，组合的tre和内含子元件由seq id no:43或50的核苷酸序列组成。
185.在某些实施例中，本文所公开的raav基因组还包括转录终止子(例如，聚腺苷酸化序列)。在某些实施例中，转录终止子相对于抗体编码序列的至少一部分在3'。转录终止子可以是有效终止转录的任何序列，并且本领域技术人员将理解，这类序列可以从在期望转录抗体编码序列的至少一部分的细胞中表达的任何基因中分离。在某些实施例中，转录终止子包括聚腺苷酸化序列。在某些实施例中，聚腺苷酸化序列与免疫球蛋白基因的内源性聚腺苷酸化序列相同或基本上相同。在某些实施例中，聚腺苷酸化序列是外源性聚腺苷酸化序列。在某些实施例中，聚腺苷酸化序列是sv40聚腺苷酸化序列(例如，包括与seq id no:31、34或35至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核苷酸序列，或与其互补的核苷酸序列)。在某些实施例中，聚腺苷酸化序列包括seq id no:31中所示的核苷酸序列。在某些实施例中，聚腺苷酸化序列由seq id no:31中所示的核苷酸序列组成。在某些实施例中，聚腺苷酸化序列是牛生长激素(bgh)聚腺苷酸化序列(例如，包括与seq id no:33至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核苷酸序列，或与其互补的核苷酸序列)。在某些实施例中，聚腺苷酸化序列包括seq id no:32中所示的核苷酸序列。在某些实施例中，聚腺苷酸化序列由seq id no:32中所示的核苷酸序列组成。
186.在某些实施例中，raav基因组从5'到3'包括：tre、内含子元件、抗体编码序列的至少一部分和聚腺苷酸化序列。在某些实施例中，tre与seq id no:25-27、36、39、42、44、46-49、54-60或65-72中的任一个具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性；内含子元件与seq id no:29、30或61具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同
一性；抗体编码序列的至少一部分与seq id no:52、53、62、63、83、94、95、97、98、100、101、103、104、106、107、109、110、112、113、114、115、131和132具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性；和/或聚腺苷酸化序列与seq id no:31、33、34或35中的任一个具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。
187.在某些实施例中，tre包括选自由seq id no:25-27、36、39、42、44、46-49、54-60和65-72组成的组的核苷酸序列；内含子元件包括选自由seq id no:29、30和61组成的组的核苷酸序列；抗体编码序列的至少一部分包括seq id no:52中所示的核苷酸序列；和/或聚腺苷酸化序列包括选自由seq id no:31、33、34和35组成的组的核苷酸序列。
188.在某些实施例中，tre包括选自由seq id no:25-27、36、39、42、44、46-49、54-60和65-72组成的组的核苷酸序列；内含子元件包括选自由seq id no:29、30和61组成的组的核苷酸序列；抗体编码序列的至少一部分包括seq id no:53中所示的核苷酸序列；和/或聚腺苷酸化序列包括选自由seq id no:31、33、34和35组成的组的核苷酸序列。
189.在某些实施例中，tre包括选自由seq id no:25-27、36、39、42、44、46-49、54-60和65-72组成的组的核苷酸序列；内含子元件包括选自由seq id no:29、30和61组成的组的核苷酸序列；抗体编码序列的至少一部分包括seq id no:62中所示的核苷酸序列；和/或聚腺苷酸化序列包括选自由seq id no:31、33、34和35组成的组的核苷酸序列。
190.在某些实施例中，tre包括选自由seq id no:25-27、36、39、42、44、46-49、54-60和65-72组成的组的核苷酸序列；内含子元件包括选自由seq id no:29、30和61组成的组的核苷酸序列；抗体编码序列的至少一部分包括seq id no:63中所示的核苷酸序列；和/或聚腺苷酸化序列包括选自由seq id no:31、33、34和35组成的组的核苷酸序列。
191.在某些实施例中，tre包括选自由seq id no:25-27、36、39、42、44、46-49、54-60和65-72组成的组的核苷酸序列；内含子元件包括选自由seq id no:29、30和61组成的组的核苷酸序列；抗体编码序列的至少一部分包括seq id no:83中所示的核苷酸序列；和/或聚腺苷酸化序列包括选自由seq id no:31、33、34和35组成的组的核苷酸序列。
192.在某些实施例中，tre包括seq id no:25、26或27中所示的核苷酸序列或由其组成；内含子元件包括seq id no:29中所示的核苷酸序列或由其组成；抗体编码序列的至少一部分包括seq id no:52中所示的核苷酸序列或由其组成；和/或聚腺苷酸化序列包括seq id no:33中所示的核苷酸序列或由其组成。
193.在某些实施例中，tre包括seq id no:25、26或27中所示的核苷酸序列或由其组成；内含子元件包括seq id no:29中所示的核苷酸序列或由其组成；抗体编码序列的至少一部分包括seq id no:62中所示的核苷酸序列或由其组成；和/或聚腺苷酸化序列包括seq id no:33中所示的核苷酸序列或由其组成。
194.在某些实施例中，tre包括seq id no:25、26或27中所示的核苷酸序列或由其组成；内含子元件包括seq id no:29中所示的核苷酸序列或由其组成；抗体编码序列的至少一部分包括seq id no:83中所示的核苷酸序列或由其组成；和/或聚腺苷酸化序列包括seq id no:33中所示的核苷酸序列或由其组成。
195.在某些实施例中，tre包括seq id no:66、67或71中所示的核苷酸序列或由其组
成；内含子元件包括seq id no:30或61中所示的核苷酸序列或由其组成；抗体编码序列的至少一部分包括seq id no:53中所示的核苷酸序列或由其组成；和/或聚腺苷酸化序列包括seq id no:31中所示的核苷酸序列或由其组成。
196.在某些实施例中，tre包括seq id no:66、67或71中所示的核苷酸序列或由其组成；内含子元件包括seq id no:30或61中所示的核苷酸序列或由其组成；抗体编码序列的至少一部分包括seq id no:63中所示的核苷酸序列或由其组成；和/或聚腺苷酸化序列包括seq id no:31中所示的核苷酸序列或由其组成。
197.在某些实施例中，raav基因组包括与seq id no:88、89、90或91至少80％(例如，至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％)相同的核苷酸序列。在某些实施例中，所述raav基因组包括seq id no:88、89、90或91中所示的核苷酸序列。在某些实施例中，raav基因组由seq id no:88、89、90或91中所示的核苷酸序列组成。
198.在某些实施例中，raav基因组包括与seq id no:88至少80％(例如，至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％)相同的核苷酸序列。在某些实施例中，raav基因组包括seq id no:88中所示的核苷酸序列。在某些实施例中，raav基因组由seq id no:88中所示的核苷酸序列组成。
199.在某些实施例中，raav基因组包括与seq id no:89至少80％(例如，至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％)相同的核苷酸序列。在某些实施例中，raav基因组包括seq id no:89中所示的核苷酸序列。在某些实施例中，raav基因组由seq id no:89中所示的核苷酸序列组成。
200.在某些实施例中，raav基因组包括与seq id no:90至少80％(例如，至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％)相同的核苷酸序列。在某些实施例中，raav基因组包括seq id no:90中所示的核苷酸序列。在某些实施例中，raav基因组由seq id no:90中所示的核苷酸序列组成。
201.在某些实施例中，raav基因组包括与seq id no:91至少80％(例如，至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％)相同的核苷酸序列。在某些实施例中，所述raav基因组包括seq id no:91中所示的核苷酸序列。在某些实施例中，raav基因组由seq id no:91中所示的核苷酸序列组成。
202.在某些实施例中，本文所公开的raav基因组还包括相对于tre在5'的5'反向末端重复(5'itr)核苷酸序列，以及相对于与抗体轻链编码序列缔合的聚腺苷酸化序列在3'处的3'反向末端重复(3'itr)核苷酸序列。来自任何aav血清型或其变体的itr序列可以用于本文所公开的raav基因组中。5'和3'itr可以来自相同血清型的aav或来自不同血清型的aav。用于本文所公开的raav基因组中的示例性itr在本文的seq id no:14、18、19、20、21和32中示出。
203.在某些实施例中，5'itr或3'itr来自aav2。在某些实施例中，5'itr和3'itr两者均
来自aav2。在某些实施例中，5'itr核苷酸序列与seq id no:14具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，或者3'itr核苷酸序列与seq id no:18具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在某些实施例中，5'itr核苷酸序列与seq id no:14具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，并且3'itr核苷酸序列与seq id no:18具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在某些实施例中，raav基因组包括seq id no:43中所示的核苷酸序列，5'itr核苷酸序列具有seq id no:14的序列，并且3'itr核苷酸序列具有seq id no:18的序列。
204.在某些实施例中，5'itr或3'itr来自aav5。在某些实施例中，5'itr和3'itr两者均来自aav5。在某些实施例中，5'itr核苷酸序列与seq id no:20具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，或者3'itr核苷酸序列与seq id no:21具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在某些实施例中，5'itr核苷酸序列与seq id no:20具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，并且3'itr核苷酸序列与seq id no:21具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在某些实施例中，raav基因组包括seq id no:43中的任一个所示的核苷酸序列，5'itr核苷酸序列具有seq id no:20的序列，并且3'itr核苷酸序列具有seq id no:21的序列。
205.在某些实施例中，5'itr核苷酸序列和3'itr核苷酸序列基本上彼此互补(例如，除了5'或3'itr中的1个、2个、3个、4个或5个核苷酸位置处的错配外，彼此互补)。
206.在某些实施例中，5'itr或3'itr被修饰以减少或消除被rep蛋白分解(“不可分解的itr”)。在某些实施例中，不可分解的itr包括在末端分解位点的核苷酸序列中的插入、缺失或取代。在raav基因组在受感染的细胞中复制后，此类修饰允许形成aav的自互补的双链dna基因组。示例性不可分解的itr序列是本领域中已知的(参见例如美国专利第7,790,154号和第9,783,824号中所提供的序列，所述美国专利通过引用整体并入本文)。在某些实施例中，5'itr包括与seq id no:19至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核苷酸序列。在某些实施例中，5'itr由与seq id no:19至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核苷酸序列组成。在某些实施例中，5'itr由seq id no:19中所示的核苷酸序列组成。在某些实施例中，3'itr包括与seq id no:32至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核苷酸序列。在某些实施例中，5'itr由与seq id no:32至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、
no:16的氨基酸687相对应的氨基酸是r；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸690相对应的氨基酸是k；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸706相对应的氨基酸是c；或者所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸718相对应的氨基酸是g。在某些实施例中，所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸626相对应的氨基酸是g，并且所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸718相对应的氨基酸是g。在某些实施例中，所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸296相对应的氨基酸是h，所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸464相对应的氨基酸是n，所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸505相对应的氨基酸是r，并且所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸681相对应的氨基酸是m。在某些实施例中，所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸505相对应的氨基酸是r，并且所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸687相对应的氨基酸是r。在某些实施例中，所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸346相对应的氨基酸是a，并且所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸505相对应的氨基酸是r。在某些实施例中，所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸501相对应的氨基酸是i，所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸505相对应的氨基酸是r，并且所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸706相对应的氨基酸是c。在某些实施例中，所述衣壳蛋白包括seq id no:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16或17的氨基酸203-736的氨基酸序列。
212.例如，在某些实施例中，衣壳蛋白包括与seq id no:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16或17的氨基酸138-736的氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在某些实施例中，衣壳蛋白包括与seq id no:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16或17的氨基酸138-736的氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，其中：所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸151相对应的氨基酸是r；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸160相对应的氨基酸是d；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸206相对应的氨基酸是c；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸296相对应的氨基酸是h；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸312相对应的氨基酸是q；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸346相对应的氨基酸是a；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸464相对应的氨基酸是n；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸468相对应的氨基酸是s；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸501相对应的氨基酸是i；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸505相对应的氨基酸是r；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸590相对应的氨基酸是r；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸626相对应的氨基酸是g或y；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸681相对应的氨基酸是m；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸687相对应的氨基酸是r；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸690相对应的氨基酸是k；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸706相对应的氨基酸是c；或者所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸718相对应的氨基酸是g。在某些实施例中，所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸626相对应的氨基酸是g，并且所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸718相对应的氨基酸是g。在某些实施例中，所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸296相对应的氨基酸是h，所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸464相对应的氨基酸是n，所述衣壳蛋白中与seq id no:16的
氨基酸505相对应的氨基酸是r，并且所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸681相对应的氨基酸是m。在某些实施例中，所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸505相对应的氨基酸是r，并且所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸687相对应的氨基酸是r。在某些实施例中，所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸346相对应的氨基酸是a，并且所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸505相对应的氨基酸是r。在某些实施例中，所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸501相对应的氨基酸是i，所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸505相对应的氨基酸是r，并且所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸706相对应的氨基酸是c。在某些实施例中，所述衣壳蛋白包括seq id no:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16或17的氨基酸138-736的氨基酸序列。
213.例如，在某些实施例中，衣壳蛋白包括与seq id no:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16或17的氨基酸1-736的氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在某些实施例中，衣壳蛋白包括与seq id no:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16或17的氨基酸1-736的氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，其中：所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸2相对应的氨基酸是t；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸65相对应的氨基酸是i；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸68相对应的氨基酸是v；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸77相对应的氨基酸是r；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸119相对应的氨基酸是l；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸151相对应的氨基酸是r；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸160相对应的氨基酸是d；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸206相对应的氨基酸是c；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸296相对应的氨基酸是h；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸312相对应的氨基酸是q；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸346相对应的氨基酸是a；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸464相对应的氨基酸是n；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸468相对应的氨基酸是s；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸501相对应的氨基酸是i；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸505相对应的氨基酸是r；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸590相对应的氨基酸是r；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸626相对应的氨基酸是g或y；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸681相对应的氨基酸是m；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸687相对应的氨基酸是r；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸690相对应的氨基酸是k；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸706相对应的氨基酸是c；或者所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸718相对应的氨基酸是g。在某些实施例中，所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸2相对应的氨基酸是t，并且所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸312相对应的氨基酸是q。在某些实施例中，所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸65相对应的氨基酸是i，并且所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸626相对应的氨基酸是y。在某些实施例中，所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸77相对应的氨基酸是r，并且所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸690相对应的氨基酸是k。在某些实施例中，所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸119相对应的氨基酸是l，并且所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸468相对应的氨基酸是s。在某些实施例中，所述
衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸626相对应的氨基酸是g，并且所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸718相对应的氨基酸是g。在某些实施例中，所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸296相对应的氨基酸是h，所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸464相对应的氨基酸是n，所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸505相对应的氨基酸是r，并且所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸681相对应的氨基酸是m。在某些实施例中，所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸505相对应的氨基酸是r，并且所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸687相对应的氨基酸是r。在某些实施例中，所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸346相对应的氨基酸是a，并且所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸505相对应的氨基酸是r。在某些实施例中，所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸501相对应的氨基酸是i，所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸505相对应的氨基酸是r，并且所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸706相对应的氨基酸是c。在某些实施例中，所述衣壳蛋白包括seq id no:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16或17的氨基酸1-736的氨基酸序列。
214.在某些实施例中，aav衣壳包括以下中的两种或更多种：(a)包括seq id no:1、2、3、4、6、7、10、11、12、13、15、16或17的氨基酸203-736的氨基酸序列的衣壳蛋白；(b)包括seq id no:1、2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、15、16或17的氨基酸138-736的氨基酸序列衣壳蛋白；以及(c)包括seq id no:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16或17的氨基酸1-736的氨基酸序列的衣壳蛋白。在某些实施例中，aav衣壳包括：(a)具有由seq id no:1、2、3、4、6、7、10、11、12、13、15、16或17的氨基酸203-736组成的氨基酸序列的衣壳蛋白；(b)具有由seq id no:1、2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、15、16或17的氨基酸138-736组成的氨基酸序列的衣壳蛋白；以及(c)具有由seq id no:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16或17的氨基酸1-736组成的氨基酸序列的衣壳蛋白。
215.在某些实施例中，aav衣壳包括以下中的一种或多种：(a)包括与seq id no:8的氨基酸203-736的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的衣壳蛋白；(b)包括与seq id no:8的氨基酸138-736的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的衣壳蛋白；以及(c)包括与seq id no:8的氨基酸1-736的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的衣壳蛋白。在某些实施例中，aav衣壳包括以下中的一种或多种：(a)包括seq id no:8的氨基酸203-736的氨基酸序列的衣壳蛋白；(b)包括seq id no:8的氨基酸138-736的氨基酸序列的衣壳蛋白；以及(c)包括seq id no:8的氨基酸1-736的氨基酸序列的衣壳蛋白。在某些实施例中，aav衣壳包括以下中的两种或更多种：(a)包括seq id no:8的氨基酸203-736的氨基酸序列的衣壳蛋白；(b)包括seq id no:8的氨基酸138-736的氨基酸序列的衣壳蛋白；以及(c)包括seq id no:8的氨基酸1-736的氨基酸序列的衣壳蛋白。在某些实施例中，aav衣壳包括：(a)具有由seq id no:8的氨基酸203-736组成的氨基酸序列的衣壳蛋白；(b)具有由seq id no:8的氨基酸138-736组成的氨基酸序列的衣壳蛋白；以及(c)具有由seq id no:8的氨基酸1-736组成的氨基酸序列的衣壳蛋白。
216.在某些实施例中，aav衣壳包括以下中的一种或多种：(a)包括与seq id no:11的氨基酸203-736的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的衣壳蛋白；(b)包括与seq id no:11的氨基酸138-736的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的衣壳蛋白；以及(c)包括与seq id no:11的氨基酸1-736的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的衣壳蛋白。在某些实施例中，aav衣壳包括以下中的一种或多种：(a)包括seq id no:11的氨基酸203-736的氨基酸序列的衣壳蛋白；(b)包括seq id no:11的氨基酸138-736的氨基酸序列的衣壳蛋白；以及(c)包括seq id no:11的氨基酸1-736的氨基酸序列的衣壳蛋白。在某些实施例中，aav衣壳包括以下中的两种或更多种：(a)包括seq id no:11的氨基酸203-736的氨基酸序列的衣壳蛋白；(b)包括seq id no:11的氨基酸138-736的氨基酸序列的衣壳蛋白；以及(c)包括seq id no:11的氨基酸1-736的氨基酸序列的衣壳蛋白。在某些实施例中，aav衣壳包括：(a)具有由seq id no:11的氨基酸203-736组成的氨基酸序列的衣壳蛋白；(b)具有由seq id no:11的氨基酸138-736组成的氨基酸序列的衣壳蛋白；以及(c)具有由seq id no:11的氨基酸1-736组成的氨基酸序列的衣壳蛋白。
217.在某些实施例中，aav衣壳包括以下中的一种或多种：(a)包括与seq id no:13的氨基酸203-736的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的衣壳蛋白；(b)包括与seq id no:13的氨基酸138-736的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的衣壳蛋白；以及(c)包括与seq id no:13的氨基酸1-736的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的衣壳蛋白。在某些实施例中，aav衣壳包括以下中的一种或多种：(a)包括seq id no:13的氨基酸203-736的氨基酸序列的衣壳蛋白；(b)包括seq id no:13的氨基酸138-736的氨基酸序列的衣壳蛋白；以及(c)包括seq id no:13的氨基酸1-736的氨基酸序列的衣壳蛋白。在某些实施例中，aav衣壳包括以下中的两种或更多种：(a)包括seq id no:13的氨基酸203-736的氨基酸序列的衣壳蛋白；(b)包括seq id no:13的氨基酸138-736的氨基酸序列的衣壳蛋白；以及(c)包括seq id no:13的氨基酸1-736的氨基酸序列的衣壳蛋白。在某些实施例中，aav衣壳包括：(a)具有由seq id no:13的氨基酸203-736组成的氨基酸序列的衣壳蛋白；(b)具有由seq id no:13的氨基酸138-736组成的氨基酸序列的衣壳蛋白；以及(c)具有由seq id no:13的氨基酸1-736组成的氨基酸序列的衣壳蛋白。
218.在某些实施例中，aav衣壳包括以下中的一种或多种：(a)包括与seq id no:16的氨基酸203-736的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的衣壳蛋白；(b)包括与seq id no:16的氨基酸138-736的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或
99％序列同一性的氨基酸序列的衣壳蛋白；以及(c)包括与seq id no:16的氨基酸1-736的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的衣壳蛋白。在某些实施例中，aav衣壳包括以下中的一种或多种：(a)包括seq id no:16的氨基酸203-736的氨基酸序列的衣壳蛋白；(b)包括seq id no:16的氨基酸138-736的氨基酸序列的衣壳蛋白；以及(c)包括seq id no:16的氨基酸1-736的氨基酸序列的衣壳蛋白。在某些实施例中，aav衣壳包括以下中的两种或更多种：(a)包括seq id no:16的氨基酸203-736的氨基酸序列的衣壳蛋白；(b)包括seq id no:16的氨基酸138-736的氨基酸序列的衣壳蛋白；以及(c)包括seq id no:16的氨基酸1-736的氨基酸序列的衣壳蛋白。在某些实施例中，aav衣壳包括：(a)具有由seq id no:16的氨基酸203-736组成的氨基酸序列的衣壳蛋白；(b)具有由seq id no:16的氨基酸138-736组成的氨基酸序列的衣壳蛋白；以及(c)具有由seq id no:16的氨基酸1-736组成的氨基酸序列的衣壳蛋白。
219.本公开的raav基因组可用于表达本领域已知的任何抗体重链和抗体轻链。在一个方面，本文提供了包括可操作地连接到抗体编码序列(例如，抗体重链编码序列和/或抗体轻链编码序列)的至少一部分的tre的raav基因组。抗体的非限制性实例包括抗c5抗体(例如，依库珠单抗、雷夫利珠单抗和帕泽利单抗(pozelimab))、抗因子d抗体(例如，兰帕利珠单抗(lampalizumab))、抗甘露糖结合蛋白相关丝氨酸蛋白酶2(masp-2)抗体(例如，纳索利单抗(narsoplimab))、抗胰舒血管素抗体(例如，拉那鲁单抗(lanadelumab))、抗白细胞介素1β抗体(例如，卡那单抗(canakinumab))、抗干扰素γ抗体(例如，依玛鲁单抗(emapalumab))、抗pcsk9抗体(例如，依沃苏单抗(evolocumab)和阿利库单抗(alirocumab))、抗凝血因子ix和因子x抗体(例如，双特异性抗体艾美赛珠单抗(emicizumab))和抗vegf抗体(例如，兰尼单抗(ranibizumab))。
220.在另一方面，本公开提供了药物组合物，其包括如本文所公开的aav和药学上可接受的赋形剂、佐剂、稀释剂、媒剂或载体或其组合。“药学上可接受的载体”包含任何在与组合物的活性成分组合时使所述成分保留生物活性并不引起破坏性生理学反应(如不希望的免疫反应)的材料。药学上可接受的载体包含水、磷酸盐缓冲盐水、乳液(如油/水乳液)和湿润剂。包括此类载体的组合物通过熟知的常规方法调配，如以下所示的方法：《雷明顿氏医药科学(remington's pharmaceutical sciences)》,当前版,宾夕法尼亚州伊斯顿的马克出版公司(mack publishing co.,easton pa.)18042,美国；a.gennaro(2000)“《雷明顿：药物科学与实践(remington:the science and practice of pharmacy)》”,第20版,利平科特
·
威廉斯
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威尔金斯出版社(lippincott,williams,&wilkins)；《药物剂型和药物传递系统(pharmaceutical dosage forms and drug delivery systems)》(1999)h.c.ansel等人,第7版,利平科特
·
威廉斯
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威尔金斯出版社；以及《药物赋形剂手册》(2000)a.h.kibbe等人编辑,第3版,美国药剂师协会。
221.在另一方面，本公开提供了药物组合物，其包括如本文所公开的aav和药学上可接受的赋形剂、佐剂、稀释剂、媒剂或载体或其组合。“药学上可接受的载体”包含任何在与组合物的活性成分组合时使所述成分保留生物活性并不引起破坏性生理学反应(如不希望的免疫反应)的材料。药学上可接受的载体包含水、磷酸盐缓冲盐水、乳液(如油/水乳液)和湿润剂。包括此类载体的组合物通过熟知的常规方法调配，如以下所示的方法：《雷明顿氏医
药科学(remington's pharmaceutical sciences)》,当前版,宾夕法尼亚州伊斯顿的马克出版公司(mack publishing co.,easton pa.)18042,美国；a.gennaro(2000)“《雷明顿：药物科学与实践(remington:the science and practice of pharmacy)》”,第20版,利平科特
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威廉斯
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威尔金斯出版社(lippincott,williams,&wilkins)；《药物剂型和药物传递系统(pharmaceutical dosage forms and drug delivery systems)》(1999)h.c.ansel等人,第7版,利平科特
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威廉斯
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威尔金斯出版社；以及《药物赋形剂手册》(2000)a.h.kibbe等人编辑,第3版,美国药剂师协会。
222.iii.使用方法
223.在另一方面，本公开提供了用于在细胞中表达抗体(例如抗体重链和轻链)的方法。所述方法通常包括用如本文所公开的raav转导细胞。此类方法引起抗体高水平的表达和分泌。因此，在某些实施例中，本文所公开的方法涉及用如本文所公开的raav转导细胞。
224.本文所公开的方法可以应用于期望表达抗体的任何细胞(例如，肝细胞)。因此，在某些实施例中，所述方法应用于肝中的细胞。在某些实施例中，所述方法应用于肝细胞。
225.本文所公开的方法可体外进行以用于研究目的或可离体或体内进行以用于治疗目的。
226.在某些实施例中，待转导的细胞在哺乳动物受试者中并以可有效转导受试者中的细胞的量向受试者施用aav。因此，在某些实施例中，本公开提供了一种治疗患有将受益于特异性结合治疗靶标的抗体的表达和分泌的疾病或病症的受试者的方法，所述方法通常包括向所述受试者施用有效量的如本文所公开的raav。在某些实施例中，抗体特异性结合补体c5并且疾病或病症与补体c5活性相关。受试者可以是人受试者或含有人肝细胞的啮齿动物受试者(例如，小鼠)。合适的小鼠受试者包含但不限于人肝细胞(例如，人肝细胞)已植入其中的小鼠。与补体c5活性相关的任何疾病或病症都可以使用本文所公开的方法进行治疗。合适的疾病或病症包含但不限于阵发性睡眠性血红蛋白尿症(pnh)、视神经脊髓炎谱系障碍(nmosd)、非典型溶血性尿毒症综合征(ahus)、重症肌无力、造血干细胞移植-移植相关血栓性微血管病(hsct-tma)、补体介导的血栓性微血管病(cm-tma)、吉兰-巴雷综合征(guillain-barr
é
syndrome)、肌萎缩侧索硬化(als)、原发性进展型多发性硬化(ppms)、多灶性运动神经病、抗体介导的肾排斥、c3肾小球病、年龄相关性黄斑变性(amd)、aqp4 igg阳性视神经脊髓炎、系统性红斑狼疮、牛皮癣、类风湿性关节炎(ra)、皮肌炎、特发性膜性肾小球病、脱髓鞘神经病、补体过度激活、血管病变性血栓形成、蛋白丢失性肠病(chaple)综合征、地图状萎缩(ga)、哮喘、增生性肾炎和败血症。
227.在某些实施例中，本公开提供了用于治疗患有与补体c5活性相关的疾病或病症的受试者的方法，所述方法通常包括向所述受试者施用有效量的如本文所公开的raav。受试者可以是人受试者、非人灵长类动物受试者(例如，食蟹猴)或具有异常补体c5活性的啮齿动物受试者(例如，小鼠)。与补体c5活性相关的任何疾病或病症都可以使用本文所公开的方法进行治疗。合适的疾病或病症包括但不限于pnh、nmosd、ahus、重症肌无力、hsct-tma、cm-tma、吉兰-巴雷综合征、als、ppms、多灶性运动神经病、抗体介导的肾排斥、c3肾小球病、amd、aqp4 igg阳性视神经脊髓炎、系统性红斑狼疮、牛皮癣、ra、皮肌炎、特发性膜性肾小球病、脱髓鞘神经病、chaple综合征、地图状萎缩(ga)、哮喘、增生性肾炎和败血症。
228.在某些实施例中，前述方法采用一种raav，其包括包含seq id no:16的氨基酸
203-736的氨基酸序列的aav衣壳蛋白，和5'到3'包括以下遗传元件的raav基因组：5'itr(例如，包括seq id no:14中所示的核苷酸序列的5'itr)、转录调控元件(例如，包括seq id no:60中所示的核苷酸序列的tre)、抗体重链编码序列的至少一部分(例如，包括seq id no:52、62或83中所示的核苷酸序列的抗体重链编码序列)、t2a肽裂解序列(例如，seq id no:28的t2a肽裂解序列)、抗体轻链编码序列的至少一部分(例如，包括seq id no:53或63中所示的核苷酸序列的抗体轻链编码序列)、聚腺苷酸化序列(例如，seq id no:31的sv40聚腺苷酸化序列)和3'itr(例如，包括seq id no:18中所示的核苷酸序列的3'itr)。
229.在某些实施例中，前述方法采用一种raav，其包括包含seq id no:16的氨基酸138-736的氨基酸序列的aav衣壳蛋白，和5'到3'包括以下遗传元件的raav基因组：5'itr(例如，包括seq id no:14中所示的核苷酸序列的5'itr)、转录调控元件(例如，包括seq id no:27中所示的核苷酸序列的tre)、内含子元件(例如，包括seq id no:29中所示的核苷酸序列的内含子元件)、抗体重链编码序列的至少一部分(例如，包括seq id no:52、62或83中所示的核苷酸序列的抗体重链编码序列)、t2a肽裂解序列(例如，seq id no:28的t2a肽裂解序列)、抗体轻链编码序列的至少一部分(例如，包括seq id no:53或63中所示的核苷酸序列的抗体轻链编码序列)、聚腺苷酸化序列(例如，seq id no:31的sv40聚腺苷酸化序列)和3'itr(例如，包括seq id no:18中所示的核苷酸序列的3'itr)。
230.在某些实施例中，前述方法采用一种raav，其包括包含seq id no:16的氨基酸序列的aav衣壳蛋白，和5'到3'包括以下遗传元件的raav基因组：5'itr(例如，包括seq id no:14中所示的核苷酸序列的5'itr)、转录调控元件(例如，包括seq id no:27中所示的核苷酸序列的tre)、内含子元件(例如，包括seq id no:29中所示的核苷酸序列的内含子元件)、抗体重链编码序列的至少一部分(例如，包括seq id no:52、62或83中所示的核苷酸序列的抗体重链编码序列)、聚腺苷酸化序列(例如，seq id no:33的bgh聚腺苷酸化序列)、转录调控元件(例如，包括seq id no:67中所示的核苷酸序列的tre)、内含子元件(例如，包括seq id no:30或61中所示的核苷酸序列的内含子元件)、抗体轻链编码序列的至少一部分(例如，包括seq id no:53或63中所示的核苷酸序列的抗体轻链编码序列)、聚腺苷酸化序列(例如，seq id no:31的sv40聚腺苷酸化序列)和3'itr(例如，包括seq id no:18中所示的核苷酸序列的3'itr)。
231.在某些实施例中，前述方法采用一种raav，其包括包含seq id no:16的氨基酸序列的aav衣壳蛋白，和5'到3'包括以下遗传元件的raav基因组：5'itr(例如，包括seq id no:14中所示的核苷酸序列的5'itr)、聚腺苷酸化序列(例如，seq id no:33的bgh聚腺苷酸化序列)、抗体重链编码序列的至少一部分(例如，包括seq id no:52、62或83中所示的核苷酸序列的抗体重链编码序列)、内含子元件(例如，包括seq id no:29中所示的核苷酸序列的内含子元件)、转录调控元件(例如，包括seq id no:27中所示的核苷酸序列的tre)、填充序列(例如，包括seq id no:51中所示的核苷酸序列的填充子)、转录调控元件(例如，包括seq id no:67中所示的核苷酸序列的tre)、内含子元件(例如，包括seq id no:30或61中所示的核苷酸序列的内含子元件)、抗体轻链编码序列的至少一部分(例如，包括seq id no:53或63中所示的核苷酸序列的抗体轻链编码序列)、聚腺苷酸化序列(例如，seq id no:31的sv40聚腺苷酸化序列)和3'itr(例如，包括seq id no:18中所示的核苷酸序列的3'itr)。
232.在某些实施例中，前述方法采用一种raav，其包括包含seq id no:13的氨基酸
203-736的氨基酸序列的aav衣壳蛋白，和5'到3'包括以下遗传元件的raav基因组：5'itr(例如，包括seq id no:14中所示的核苷酸序列的5'itr)、转录调控元件(例如，包括seq id no:60中所示的核苷酸序列的tre)、抗体重链编码序列的至少一部分(例如，包括seq id no:52、62或83中所示的核苷酸序列的抗体重链编码序列)、t2a肽裂解序列(例如，seq id no:28的t2a肽裂解序列)、抗体轻链编码序列的至少一部分(例如，包括seq id no:53或63中所示的核苷酸序列的抗体轻链编码序列)、聚腺苷酸化序列(例如，seq id no:31的sv40聚腺苷酸化序列)和3'itr(例如，包括seq id no:18中所示的核苷酸序列的3'itr)。
233.在某些实施例中，前述方法采用一种raav，其包括包含seq id no:13的氨基酸138-736的氨基酸序列的aav衣壳蛋白，和5'到3'包括以下遗传元件的raav基因组：5'itr(例如，包括seq id no:14中所示的核苷酸序列的5'itr)、转录调控元件(例如，包括seq id no:27中所示的核苷酸序列的tre)、内含子元件(例如，包括seq id no:29中所示的核苷酸序列的内含子元件)、抗体重链编码序列的至少一部分(例如，包括seq id no:52、62或83中所示的核苷酸序列的抗体重链编码序列)、t2a肽裂解序列(例如，seq id no:28的t2a肽裂解序列)、抗体轻链编码序列的至少一部分(例如，包括seq id no:53或63中所示的核苷酸序列的抗体轻链编码序列)、聚腺苷酸化序列(例如，seq id no:31的sv40聚腺苷酸化序列)和3'itr(例如，包括seq id no:18中所示的核苷酸序列的3'itr)。
234.在某些实施例中，前述方法采用一种raav，其包括包含白seq id no:13的氨基酸序列的aav衣壳蛋白，和5'到3'包括以下遗传元件的raav基因组：5'itr(例如，包括seq id no:14中所示的核苷酸序列的5'itr)、转录调控元件(例如，包括seq id no:27中所示的核苷酸序列的tre)、内含子元件(例如，包括seq id no:29中所示的核苷酸序列的内含子元件)、抗体重链编码序列的至少一部分(例如，包括seq id no:52、62或83中所示的核苷酸序列的抗体重链编码序列)、聚腺苷酸化序列(例如，seq id no:33的bgh聚腺苷酸化序列)、转录调控元件(例如，包括seq id no:67中所示的核苷酸序列的tre)、内含子元件(例如，包括seq id no:30或61中所示的核苷酸序列的内含子元件)、抗体轻链编码序列的至少一部分(例如，包括seq id no:53或63中所示的核苷酸序列的抗体轻链编码序列)、聚腺苷酸化序列(例如，seq id no:31的sv40聚腺苷酸化序列)和3'itr(例如，包括seq id no:18中所示的核苷酸序列的3'itr)。
235.在某些实施例中，前述方法采用一种raav，其包括包含seq id no:13的氨基酸序列的aav衣壳蛋白，和5'到3'包括以下遗传元件的raav基因组：5'itr(例如，包括seq id no:14中所示的核苷酸序列的5'itr)、聚腺苷酸化序列(例如，seq id no:33的bgh聚腺苷酸化序列)、抗体重链编码序列的至少一部分(例如，包括seq id no:52、62或83中所示的核苷酸序列的抗体重链编码序列)、内含子元件(例如，包括seq id no:29中所示的核苷酸序列的内含子元件)、转录调控元件(例如，包括seq id no:27中所示的核苷酸序列的tre)、填充序列(例如，包括seq id no:51中所示的核苷酸序列的填充子)、转录调控元件(例如，包括seq id no:67中所示的核苷酸序列的tre)、内含子元件(例如，包括seq id no:30或61中所示的核苷酸序列的内含子元件)、抗体轻链编码序列的至少一部分(例如，包括seq id no:53或63中所示的核苷酸序列的抗体轻链编码序列)、聚腺苷酸化序列(例如，seq id no:31的sv40聚腺苷酸化序列)和3'itr(例如，包括seq id no:18中所示的核苷酸序列的3'itr)。
236.本文所公开的方法特别有利，因为其能够在体内高效地表达抗体并分泌到受试者
的血清中。在某些实施例中，抗体的血清浓度为至少约100μg/ml、至少约500μg/ml、至少约1000μg/ml、至少约1500μg/ml、至少约2000μg/ml、至少约2500μg/ml、至少约3000μg/ml、至少约3500μg/ml、至少约4000μg/ml、至少约4500μg/ml、至少约5000μg/ml、至少约7500μg/ml、至少约10000μg/ml、至少约15000μg/ml、至少约20000μg/ml、至少约25000μg/ml、至少约30000μg/ml、至少约35000μg/ml、至少约40000μg/ml、至少约45000μg/ml、至少约50000μg/ml、至少约60000μg/ml、至少约70000μg/ml、至少约80000μg/ml、至少约90000μg/ml或至少约100000μg/ml。可采用测定抗体的表达水平或血清浓度的任何方法，包含但不限于elisa、蛋白质印迹法、免疫染色和质谱法。在某些实施例中，抗体的血清浓度用抗人igg elisa测定。
237.在某些实施例中，用本文中所公开的aav组合物转导细胞可如本文所提供来进行或通过所属领域中的技术人员已知的任何转导方法来进行。在某些实施例中，细胞可以以50,000；100,000；150,000；200,000；250,000；300,000；350,000；400,000；450,000；或500,000的感染复数(moi)或提供细胞的最佳转导的任何moi与aav接触。
238.可以通过任何适当的途径向受试者施用本文所公开的aav组合物，所述途径包含但不限于静脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、鼻内、局部或皮内途径。在某些实施例中，将组合物调配成用于通过静脉内注射或皮下注射施用。
239.iv.aav包装系统
240.在另一方面，本公开提供了用于重组制备本文所公开的重组腺相关病毒(raav)的包装系统。此类包装系统通常包括：编码一个或多个aav rep蛋白的第一核苷酸；编码如本文所公开的aav中的任何aav的衣壳蛋白的第二核苷酸；以及包括如本文所公开的raav基因组中的任何raav基因组的第三核苷酸序列，其中所述包装系统在细胞中是操作性的以将raav基因组围封在衣壳中以形成aav。
241.在某些实施例中，包装系统包括第一载体，其包括编码一个或多个aav rep蛋白的第一核苷酸序列和编码aav衣壳蛋白的第二核苷酸序列，以及第二载体，其包括有包括raav基因组的第三核苷酸序列。如在如本文中所描述的包装系统的上下文中所使用，“载体”是指作为用于将核酸引入到细胞中的媒剂的核酸分子(例如，质粒、病毒、粘粒、人工染色体等)。
242.任何aav rep蛋白均可用于本文中所公开的包装系统中。在包装系统的某些实施例中，rep核苷酸序列编码aav2 rep蛋白。合适的aav2 rep蛋白包含(但不限于)rep 78/68或rep 68/52。在包装系统的某些实施例中，编码aav2 rep蛋白的核苷酸序列包括编码与seq id no:22的aav2 rep氨基酸序列具有最小序列同一性百分比的蛋白质的核苷酸序列，其中跨aav2 rep蛋白的氨基酸序列长度的最小序列同一性百分比为至少70％(例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％)。在包装系统的某些实施例中，aav2 rep蛋白具有seq id no:22中所示的氨基酸序列。
243.在包装系统的某些实施例中，包装系统进一步包括第四核苷酸序列，所述第四核苷酸序列包括一个或多个辅助病毒基因。在包装系统的某些实施例中，包装系统进一步包括包含第四核苷酸序列的第三载体，例如，辅助病毒载体，所述第四核苷酸序列包括一个或多个辅助病毒基因。第三载体可为独立的第三载体、与第一载体整合在一起或与第二载体整合在一起。
244.在包装系统的某些实施例中，辅助病毒选自由以下组成的组：腺病毒、疱疹病毒(包含单纯性疱疹病毒(hsv))、痘病毒(如牛痘病毒)、巨细胞病毒(cmv)和杆状病毒。在其中辅助病毒是腺病毒的某些包装系统实施例中，腺病毒基因组包括一种或多种选自由以下组成的组的腺病毒rna基因：el、e2、e4和va。在其中辅助病毒是hsv的某些包装系统实施例中，hsv基因组包含选自由以下组成的组的hsv基因中的一个或多个：ul5/8/52、icpo、icp4、icp22和ul30/ul42。
245.在包装系统的某些实施例中，第一载体、第二载体和/或第三载体包含在一个或多个质粒内。在某些实施例中，第一载体和第三载体包含于第一质粒内。在某些实施例中，第二载体和第三载体包含于第二质粒内。
246.在包装系统的某些实施例中，第一、第二和/或第三载体包含于一种或多种重组辅助病毒内。在某些实施例中，第一载体和第三载体包含于重组辅助病毒内。在某些实施例中，第二载体和第三载体包含于重组辅助病毒内。
247.在另一方面中，本公开提供一种用于如本文中所描述的aav的重组制备的方法，其中所述方法包含在可操作以将raav基因组包裹于衣壳中以形成如本文中所描述的raav的条件下，用如本文中所描述的包装系统转染或转导细胞。用于raav的重组制备的示例性方法包含短暂转染(例如，用一种或多种含有如本文所描述的第一载体和第二载体以及任选地第三载体的转染质粒)、病毒感染(例如，用一种或多种重组辅助病毒，如腺病毒、痘病毒(如牛痘病毒)、疱疹病毒(包含hsv、巨细胞病毒或杆状病毒，其含有如本文所描述的第一载体和第二载体以及任选地第三载体)和稳定的生产细胞系转染或感染(例如，用稳定的生产细胞，如哺乳动物或昆虫细胞，其含有如本文所描述的编码一个或多个aav rep蛋白的rep核苷酸序列和/或编码一个或多个aav衣壳蛋白的cap核苷酸序列，并且其中以质粒或重组辅助病毒形式传递如本文所描述的raav基因组)。
248.因此，本公开提供了一种用于制备重组aav(raav)的包装系统，其中所述包装系统包括编码一个或多个aav rep蛋白的第一核苷酸序列；编码本文所描述的aav中的任一个aav的衣壳蛋白的第二核苷酸序列；包括本文所描述的aav中的任一个aav的raav基因组序列的第三核苷酸序列；以及任选地包括一个或多个辅助病毒基因的第四核苷酸序列。
249.v.实例
250.以下实例展示使用如本文所公开的raav载体在受试者中有效表达抗体(例如抗c5抗体)。这些实例以说明性方式而非限制性方式提供。
251.实例1：抗补体c5抗体raav载体
252.本实例提供了抗c5抗体表达载体c5ab01、c5ab02、c5ab03和c5ab04，用于在所述载体转导到的细胞(例如，人细胞或小鼠细胞)中表达抗c5抗体。
253.a)c5ab01
254.如图1中所示，抗c5抗体载体c5ab01从5'到3'包括以下遗传元件：包括ef1α启动子的转录调控元件；连接到抗c5抗体重链(hc)的编码人igg2(p1)信号序列的编码序列；编码2a核糖体跳跃肽的核酸序列；连接到抗c5抗体轻链(lc)的编码igκ(p2)信号序列的编码序列；和sv40晚期聚腺苷酸化序列(lpa)。这些元件的核酸序列在表1中示出。此载体能够在所述载体转导到的细胞(例如，人细胞或小鼠细胞)中表达抗c5抗体。
255.b)c5ab02
256.如图1中所示，抗c5抗体载体c5ab02从5'到3'包括以下遗传元件：包括肝特异性lp1启动子的转录调控元件；连接到抗c5抗体重链(hc)的编码人igg2(p1)信号序列的编码序列；编码2a核糖体跳跃肽的核酸序列；连接到抗c5抗体轻链(lc)的编码igκ(p2)信号序列的编码序列；和sv40晚期聚腺苷酸化序列(lpa)。这些元件的序列在表1中示出。此载体能够在所述载体转导到的细胞(例如，人细胞或小鼠细胞)中表达抗c5抗体。
257.c)c5ab03
258.如图1中所示，抗c5抗体载体c5ab03从5'到3'包括以下遗传元件：包括肝特异性lp1启动子的转录调控元件；连接到抗c5抗体重链(hc)的编码人igg2(p1)信号序列的编码序列；牛生长激素聚腺苷酸化信号(bghpa)；包括肝特异性dng启动子的转录调控元件；连接到抗c5抗体轻链(lc)的编码igκ(p2)信号序列的编码序列；和sv40晚期聚腺苷酸化序列(lpa)。这些元件的序列在表1中示出。此载体能够在所述载体转导到的细胞(例如，人细胞或小鼠细胞)中表达抗c5抗体。
259.d)c5ab04
260.如图1中所示，抗c5抗体载体c5ab04从5'到3'包括以下遗传元件：牛生长激素聚腺苷酸化信号(bghpa)；抗c5抗体重链编码序列；连接到人igg2(p1)信号序列的编码抗c5抗体重链(hc)的编码序列；包括肝特异性lp1启动子的转录调控元件；填充序列；包括肝特异性dng启动子的转录调控元件；连接到抗c5抗体轻链(lc)的编码igκ(p2)信号序列的编码序列；和sv40晚期聚腺苷酸化序列(lpa)。这些元件的序列在表1中示出。此载体能够在所述载体转导到的细胞(例如，人细胞或小鼠细胞)中表达抗c5抗体。
261.表1：抗c5抗体表达载体c5ab01、c5ab02、c5ab03和c5ab04中的遗传元件
[0262][0263]
本文所公开的载体可包装于aav衣壳中，包含但不限于aavhsc5、aavhsc7、aavhsc8、aavhsc13、aavhsc15或aavhsc17衣壳。
[0264]
实例2：抗c5抗体在小鼠模型中的表达
[0265]
补体成分c5的异常或过度活性与数种疾病相关联，包含阵发性睡眠性血红蛋白尿症(pnh)、视神经脊髓炎谱系障碍(nmosd)和非典型溶血性尿毒症综合征(ahus)。抗c5单克隆抗体已经显示可有效治疗这些疾病，但患者通常需要多个大剂量的抗体才能获得治疗益
处。这部分地归因于患者血清中高浓度的c5蛋白。因此，需要高水平的抗c5抗体结合和消除足够c5才能产生所需的治疗效果。如果患者能够表达其自身的抗c5抗体，那么就可以克服这些问题。
[0266]
为了研究是否可以在生物体中表达足够高水平的抗c5抗体，向nod scid小鼠施用用于从小鼠肝表达所述抗c5抗体的aav载体。进行四个单独的实验，包装于aavhsc13、aavhsc15和aavhsc17中的每一者中的测试载体c5ab02、c5ab03和c5ab04(上文所描述)。
[0267]
人igg elisa方案
[0268]
为了评估以下实验中的血清人igg浓度(μg/ml)，采用来自abcam的simplestep试剂盒。简单来说，通过在抗体稀释剂cp中稀释捕获和检测抗体来制备抗体混合物。为了制备3ml抗体混合物，将300μl的10x捕获抗体和300μl的10x检测抗体与2.4ml抗体稀释剂cp组合。随后在临用时通过连续稀释来制备标准品。试剂盒中提供的人igg蛋白用于阳性对照连续稀释。
[0269]
为了进行分析，在使用之前使所有试剂达到室温。将50μl的所有样品或标准品添加到微孔板的适当孔中。然后将50μl的抗体混合物添加到每个孔中。然后将板密封，并在设定为400rpm的板式振荡器上在室温下温育40分钟。然后用3
×
350μl的1x洗涤缓冲液pt洗涤每个孔。最后一次洗涤后，将板倒置，并用干净的纸巾吸干，以除去多余的液体。然后将100μl的tmb显影溶液添加到每个孔中，并且在设定为400rpm的板式振荡器上在黑暗中温育约5分钟。最佳温育时间可在5分钟至20分钟之间变化。向每个孔中添加100μl的终止溶液。将板在板式振荡器上振荡1分钟以混合。然后在450nm下读取光密度(od)。这是终点读数。
[0270]
结果
[0271]
在第一个实验中，小鼠接受1e13 vgs/kg剂量的包装在aavhsc13或aavhsc17衣壳中的载体c5ab04。在1周、3周、5周、7周、9周、11周、15周、19周和23周之后采集血清样品。测试血清样品的人igg浓度(μg/ml)，作为抗c5抗体水平的读取。雌性小鼠是aav介导的基因转移的不良模型，因此在雄性和雌性小鼠之间分离数据。如图2a中所示，接受包装在aavhsc13或aavhsc17衣壳中的c5ab04的小鼠显示出随时间推移抗c5抗体水平升高。图2b显示图2a中的结果，y轴为对数标度。在图2a-2b中，n＝2-3只小鼠/组。
[0272]
在第二个实验中，小鼠接受1e13 vgs/kg剂量的包装在aavhsc17衣壳中的载体c5ab02。将雄性和雌性小鼠的数据分离，并且在16周的时间段内采集多个血清样品。测试血清样品的人igg浓度(μg/ml)，作为抗c5抗体水平的读取。如图2c中所示，接受包装在aavhsc17衣壳中的载体c5ab02的小鼠显示出随时间推移抗c5抗体水平升高。图2d显示图2c中的结果，y轴为对数标度。在图2c-2d中，n＝3只小鼠/组。
[0273]
在第三个实验中，小鼠接受1e13 vgs/kg剂量的各自包装在aavhsc15或aavhsc17衣壳中的载体c5ab02、c5ab03或c5ab04。显示雄性小鼠的数据，并且在16周的时间段内采集多个血清样品。测试血清样品的人igg浓度(μg/ml)，作为抗c5抗体水平的读取。如图2e中所示，接受包装在aavhsc15或aavhsc17衣壳中的载体c5ab02、c5ab03或c5ab04中的任一者的小鼠显示出随时间推移抗c5抗体水平升高。图2f和2g(y轴为对数标度)显示图2e中的结果，以线图格式呈现。在图中2e-2g，n＝3只雄性小鼠/组。
[0274]
在第四个实验中，小鼠接受5e11 vgs/kg、5e12 vgs/kg、1.4e13 vgs/kg、4.4e13 vgs/kg和1.8e14 vgs/kg5种剂量的包装在aavhsc17衣壳中的载体c5ab04。显示雄性小鼠的
数据，并且在13周的时间段内采集多个血清样品。测试血清样品的人igg浓度(μg/ml)，作为抗c5抗体水平的读取。如图2h的剂量反应数据中所示，接受包装在aavhsc17衣壳中的载体c5ab04的小鼠显示出随时间推移抗c5抗体水平升高。此外，增加aavhsc17的剂量引起抗c5抗体的浓度相应增加，其中剂量1.4e13 vgs/kg、4.4e13 vgs/kg和1.8e14 vgs/kg实现抗体的毫克浓度。图2i显示以线图格式呈现的图2h中的结果，y轴为对数标度。在图2e-2i中，n＝3只雄性小鼠/组。
[0275]
对上述数据进行重新组织以比较包装在每个aavhsc13、aavhsc15或aavhsc17中的每种载体的功效。如图3a-3c中所示，c5ab04随时间推移一致地产生较高浓度的抗c5抗体。此外，aavhsc17衣壳随时间推移一致地产生较高浓度的抗c5抗体。包装在aavhsc17衣壳中的c5ab04的组合在传递到小鼠之后15周产生最高浓度的抗c5抗体，大约是2000μg/ml。
[0276]
上述数据还用于预测所实现的抗c5抗体浓度是否与直接施用于患者的已知的治疗性抗c5抗体(即，不从患者中的载体表达)一致。基于用于治疗pnh的c
max
、c
谷
和给药时程数据，对市售的依库珠单抗和雷夫利珠单抗的药代动力学建模。标准差范围是基于变异系数和用于这些研究的患者的数目(图4a和4b中的虚线)。此建模数据与来自第一个实验的aavhsc13和aavhsc17包装载体的上述体内小鼠实验的数据进行比对。比较显示，本文所描述的治疗方法可以实现已知的抗c5抗体雷夫利珠单抗和依库珠单抗的临床有效水平(图4a)。建模数据还与来自上述体内小鼠实验(第一个实验：“nod-scid，1e+13vg/kg”；和第四个实验：“nod-scid 1.8e+14vg/kg”)的数据以及来自以下针对包装在aavhsc17衣壳中的c5ab04的huliv小鼠实验(实例4)的数据(图4b)进行比对。
[0277]
实例3：在小鼠模型中表达的抗c5抗体的离体分析
[0278]
阵发性睡眠性血红蛋白尿症(pnh)的特征在于红细胞的破坏(溶血性贫血)、血块(血栓)和骨髓功能受损。为了确定所表达的抗c5抗体是否有效地减少溶血性贫血，进行pnh离体溶血测定。将含有人c5的人血清与从用aavhsc17包装的c5ab04处理的nod scid小鼠获得的血清和活化绵羊红细胞(rbc)混合。将溶血％与对照抗c5生物仿制抗体进行比较。如图5中所示，从用aavhsc13包装的c5ab04或aavhsc17包装的c5ab04处理的nod scid小鼠获得的血清能够比生物仿制药对照抗c5抗体抑制溶血的程度更大。
[0279]
进行类似的离体溶血测定，所述测定比较从用1e13 vg/kg剂量的aavhsc13包装的c5ab04或aavhsc17包装的c5ab04处理的nod scid小鼠获得的血清与阴性对照小鼠血清(来自图2a中的实验)。将雄性和雌性小鼠的数据分离，并且在处理后9周的时间段内采集多个血清样品。在血清样品中测量人igg浓度(μg/ml)，作为抗c5抗体水平的读取，并且在用包装在aavhsc13或aavhsc17衣壳中的c5ab04处理的小鼠中证实随时间推移抗c5抗体水平升高(图6a)。图6a中呈现的数据是图2a和2b中呈现的数据的子集。从用包装在aavhsc13或aavhsc17衣壳中的c5ab04处理的小鼠获得的血清能够抑制溶血(图6b)。图6c展示了图6b中的结果，其中溶血％由到施用后19周获得的血清样品确定并以线图呈现。在图6a-6c中，n＝3只小鼠/组。
[0280]
在第二个实验中，进行离体溶血测定，所述测定比较从用1e13 vg/kg剂量的aavhsc17包装的c5ab02处理的nod scid小鼠获得的血清与阴性对照小鼠血清(如图2c中)。将雄性和雌性小鼠的数据分离，并且在处理后16周的时间段内采集多个血清样品。如图6d中所示，从处理的nod scid小鼠获得的血清能够抑制溶血。在图6d中，n＝3只小鼠/组。
[0281]
在第三个实验中，进行离体溶血测定，所述测定比较从用1e13 vg/kg剂量的aavhsc15或aavhsc17包装的c5ab02、c5ab03或c5ab04处理的雄性nod scid小鼠获得的血清与阴性对照小鼠血清(如图2e中)。在处理后16周的时间段内采集多个血清样品。如图6e中所示，从处理的nod scid小鼠获得的血清能够抑制溶血。在图6e中，n＝3只小鼠/组。
[0282]
在第四个实验中，进行离体溶血测定，所述测定比较从用5e11 vgs/kg、5e12 vgs/kg、1.4e13 vgs/kg、4.4e13 vgs/kg或1.8e14 vgs/kg剂量的aavhsc17包装的c5ab04处理的雄性nod scid小鼠获得的血清与阴性对照小鼠血清(如图2h中)。在处理后16周的时间段内采集多个血清样品。如图6f中所示，从处理的nod scid小鼠获得的血清能够以raav剂量依赖性方式抑制溶血。在图6f中，n＝3只小鼠/组。
[0283]
溶血测定方案
[0284]
使用以下方案进行以上所提及的溶血测定。在96孔v型底板中，在每个孔中(具有和不具有edta)将明胶弗洛拿缓冲液(gelatin veronal buffer，gvbs，sigma，目录号g6514)与小鼠血清混合。然后将10％正常人血清(nhs，sigma，目录号h4522)添加到所有孔中。然后将板在37℃下温育30分钟。然后将1ml抗体敏化的绵羊红细胞(complement technology公司，目录号：b200、b201和b202)添加到每个孔中并振荡约30分钟。然后将板以1000g离心5分钟。将上清液移动到新板并在540nm和615nm下读取。然后从540nm值减去615nm值以获得最终读数。在所有报告的溶血％值中，在用100％红细胞溶解对照归一化后，报告所有样品，包括仅缓冲液制剂或aavhsc处理的样品的溶血％。
[0285]
实例4：huliv小鼠模型的产生和表征
[0286]
为了评价本文所描述的治疗方法的功能活性和耐久性，将c57bl/6背景下的通常称为敲除小鼠的fah-/-rag2-/-il2rg-/-小鼠用作肝人源化模型。小鼠是免疫缺陷的，并且缺乏酪氨酸分解代谢酶延胡索酰乙酰乙酸水解酶(fah)。通过抽取保护性药物2-(2-硝基-4-三氟甲基苯甲酰基)-1,3-环己二酮(ntbc)来诱导小鼠肝细胞的消融。然后对小鼠移植人肝细胞，并且施用表达尿激酶的腺病毒以增强人肝细胞的重建。用适当的curx
tm
尼替西农(nitisinone)(20-0026)和smx/tmp抗生素的预防性处理(20-0037)方案在动物的整个生命中维持移植。得到的huliv小鼠肝用》70％的人肝细胞重建。这些huliv小鼠在以下中进一步描述：azuma等人(《自然
·
生物技术》.25(8):903-910(2007))。
[0287]
如图7a和图7b中所示，huliv小鼠产生的人c5水平与人血清相当，同时产生较少的小鼠c5。此huliv模型允许检查体内人肝细胞对抗c5抗体的表达以及在存在人c5的情况下抗c5抗体的耐久性。
[0288]
向huliv小鼠(n＝2)施用单剂量的100μg的对照抗c5生物仿制抗体或施用1e13 vg/kg或1e14 vgs/kg剂量的包装在aavhsc17衣壳中的c5ab04。在第1周、第3周、第5周、第7周、第9周和第11周测定血清抗体浓度。如图8a中所示，对于第1周、第3周和第5周，与直接施用对照抗c5抗体相比，将包装在aavhsc17衣壳中的c5ab04施用到huliv小鼠引起基本上更高浓度的抗c5抗体。图8b展示了图8a中的结果，其中到施用后11周确定血清抗体浓度并以线图呈现，y轴为对数标度。使用与以上所描述相同的方法进行离体溶血测定，比较从用1e13 vgs/kg或1e14 vgs/kg剂量的包装在aavhsc17衣壳中的c5ab04处理的huliv小鼠获得的血清与从施用对照抗c5抗体(生物仿制药)的huliv小鼠获得的血清。在处理后11周的时间段内采集血清样品。如图8c中所示，从处理的huliv小鼠获得的血清能够抑制溶血。在离
体溶血测定中用1e13 vgs/kg或1e14 vgs/kg剂量的包装在aavhsc17衣壳中的c5ab04处理的小鼠显示出约80％保护以免溶血。高达约20％的背景残余溶血可以通过huliv小鼠中由c57bl/6肝细胞的残余群体制备的小鼠补体蛋白的存在来解释。图8d展示了经由酶联免疫吸附测定在从处理的huliv小鼠获得的血清中检测到的小鼠c5水平。
[0289]
实例5：原代肝细胞筛选测定
[0290]
为了快速测试优化的raav载体，开发了基于细胞系的测定以评估抗体的产生和分泌。选择人原代肝细胞作为与体内实验最接近的匹配。使用来自lonza的可涂铺的人肝细胞(目录号hucpg)和可涂铺的c57bl/6小鼠肝细胞(目录号mbcp01)。
[0291]
涂铺大约500,000个人肝细胞或250,000个小鼠肝细胞，随后与约300,000moi的aavhsc15或aavhsc17包装的c5ab02、c5ab03或c5ab04一起温育。然后在病毒添加后第7天收集培养基，并通过蛋白质印迹和人igg elisa进行分析。如图9a和图9b中所示，检测到大量水平的抗c5抗体。
[0292]
***
[0293]
本发明不应限于本文所描述的具体实施例的范围。实际上，根据前文的描述和附图，除了所描述的修改之外，本发明的各种修改对于所属领域技术的人员来说也将变得显而易见。此类修改旨在落入所附权利要求的范围内。
[0294]
本文所引用的全部参考文献(例如，出版物或专利或专利申请)均通过引用并且出于所有目的整体并入本文，其程度如同每个单独的参考文献(例如，出版物或专利或专利申请)出于所有目的被具体地或单独地指示通过引用整体并入一样。其它实施例处于以下权利要求内。

技术特征：
1.一种重组腺相关病毒(raav)基因组，所述raav基因组包括：(a)第一表达盒，所述第一表达盒从5'到3'包括：第一肝特异性转录调控元件，第一编码序列，所述第一编码序列编码可操作地连接到第一信号序列的包括抗体重链的第一多肽，以及第一聚腺苷酸化序列；和(b)第二表达盒，所述第二表达盒从5'到3'包括：第二肝特异性转录调控元件，第二编码序列，所述第二编码序列编码可操作地连接到第二信号序列的包括抗体轻链的第二多肽，以及第二聚腺苷酸化序列，其中所述第一编码序列和所述第二编码序列的表达产生包括所述抗体重链和所述抗体轻链的抗体。2.根据权利要求1所述的raav基因组，其中所述第一转录调控元件和/或所述第二转录调控元件包括选自由以下组成的组的启动子元件：人白蛋白启动子、人运甲状腺素蛋白(ttr)启动子、人甲状腺素结合球蛋白(tbg)启动子、人apoh启动子、人serpina1(haat)启动子和其肝特异性调控模块，例如人apoe/c-i肝控制区(hcr)1或2。3.根据权利要求1或2所述的raav基因组，其中所述第一转录调控元件和/或所述第二转录调控元件包括包含与选自由seq id no:25、27、66、68、69、116和117组成的组的序列至少90％相同的核酸序列的启动子元件。4.根据权利要求1至3中任一项所述的raav基因组，其中所述转录调控元件包括与seq id no:27中所示的核苷酸序列至少90％相同的核苷酸序列。5.根据权利要求1至4中任一项所述的raav基因组，其中所述转录调控元件包括seq id no:27中所示的核苷酸序列。6.根据权利要求1至5中任一项所述的raav基因组，其中所述转录调控元件的核苷酸序列由seq id no:27中所示的核苷酸序列组成。7.根据权利要求1至3中任一项所述的raav基因组，其中所述转录调控元件包括与seq id no:67中所示的核苷酸序列至少90％相同的核苷酸序列。8.根据权利要求1至4中任一项所述的raav基因组，其中所述转录调控元件包括seq id no:67中所示的核苷酸序列。9.根据权利要求1至5中任一项所述的raav基因组，其中所述转录调控元件的核苷酸序列由seq id no:67中所示的核苷酸序列组成。10.根据权利要求1至9中任一项所述的raav基因组，其中所述第一表达盒和/或所述第二表达盒还包括内含子元件，所述内含子元件相对于所述第一编码序列和/或所述第二编码序列位于5'并且相对于所述转录调控元件位于3'。11.根据权利要求10所述的raav基因组，其中所述内含子元件是外源性内含子元件，任选地其中所述外源性内含子元件是sv40内含子元件或小鼠微小病毒(mvm)内含子元件。12.根据权利要求11所述的raav基因组，其中所述sv40内含子元件包括与seq id no:29中所示的核苷酸序列至少90％相同的核苷酸序列。
13.根据权利要求11或12所述的raav基因组，其中所述sv40内含子元件包括seq id no:29中所示的核苷酸序列。14.根据权利要求11至13中任一项所述的raav基因组，其中所述sv40内含子元件的核苷酸序列由seq id no:29中所示的核苷酸序列组成。15.根据权利要求11至14中任一项所述的raav基因组，其中所述mvm内含子元件包括与seq id no:30中所示的核苷酸序列至少90％相同的核苷酸序列。16.根据权利要求11至14中任一项所述的raav基因组，其中所述mvm内含子元件包括seq id no:30中所示的核苷酸序列。17.根据权利要求11至16中任一项所述的raav基因组，其中所述mvm内含子元件的核苷酸序列由seq id no:30中所示的核苷酸序列组成。18.根据权利要求1至17中任一项所述的raav基因组，其中所述第一转录调控元件和所述第二转录调控元件相同。19.根据权利要求1至18中任一项所述的raav基因组，其中所述第一转录调控元件包括hcr 1元件、haat启动子和sv40内含子元件，并且所述第二转录调控元件包括serpina1肝特异性调控模块、ttr启动子和mvm内含子元件。20.根据权利要求1至19中任一项所述的raav基因组，其中所述第一转录调控元件包括seq id no:50的核酸序列并且所述第二转录调控元件包括seq id no:43的核酸序列。21.根据权利要求1至20中任一项所述的raav基因组，其中所述第一表达盒和/或所述第二表达盒还包括相对于所述第一编码序列和/或所述第二编码序列在3'的聚腺苷酸化序列。22.根据权利要求21所述的raav基因组，其中所述聚腺苷酸化序列是外源性聚腺苷酸化序列，任选地其中所述外源性聚腺苷酸化序列是sv40聚腺苷酸化序列或牛生长激素(bgh)聚腺苷酸化序列。23.根据权利要求22所述的raav基因组，其中所述sv40聚腺苷酸化序列包括与seq id no:31中所示的核苷酸序列至少90％相同的核苷酸序列。24.根据权利要求22或23所述的raav基因组，其中所述sv40聚腺苷酸化序列包括seq id no:31中所示的核苷酸序列。25.根据权利要求22至24中任一项所述的raav基因组，其中所述sv40聚腺苷酸化序列的核苷酸序列由seq id no:31中所示的核苷酸序列组成。26.根据权利要求22至25中任一项所述的raav基因组，其中所述bgh聚腺苷酸化序列包括与seq id no:33中所示的核苷酸序列至少90％相同的核苷酸序列。27.根据权利要求22至26中任一项所述的raav基因组，其中所述bgh聚腺苷酸化序列包括seq id no:33中所示的核苷酸序列。28.根据权利要求22至27中任一项所述的raav基因组，其中所述bgh聚腺苷酸化序列的核苷酸序列由seq id no:33中所示的核苷酸序列组成。29.根据权利要求21至28中任一项所述的raav基因组，其中所述第一表达盒和所述第二表达盒包括相同的聚腺苷酸化序列。30.根据权利要求21至29中任一项所述的raav基因组，其中所述第一表达盒包括所述sv40聚腺苷酸化序列。
31.根据权利要求21至30中任一项所述的raav基因组，其中所述第二表达盒包括所述bgh聚腺苷酸化序列。32.根据权利要求21至31中任一项所述的raav基因组，其中所述第一聚腺苷酸化序列包括seq id no:31的核酸序列并且所述第二聚腺苷酸化序列包括seq id no:33的核酸序列。33.根据权利要求1至32中任一项所述的raav基因组，其中所述第一表达盒和所述第二表达盒在所述raav基因组中处于相同的取向。34.根据权利要求1至32中任一项所述的raav基因组，其中所述第一表达盒和所述第二表达盒在所述raav基因组中呈相反的取向。35.根据前述权利要求中任一项所述的raav基因组，其中所述第一表达盒和所述第二表达盒呈相反的取向，所述第一聚腺苷酸化序列和所述第二聚腺苷酸化序列在所述raav基因组中位于远端。36.根据权利要求35所述的raav基因组，其中所述raav基因组还包括插入所述第一转录调控元件与所述第二转录调控元件之间的填充序列。37.根据权利要求36所述的raav基因组，其中所述填充序列包括β珠蛋白聚腺苷酸化序列。38.根据权利要求37所述的raav基因组，其中所述β珠蛋白聚腺苷酸化序列包括seq id no:51的核酸序列。39.根据权利要求35所述的raav基因组，其中所述raav基因组从5'到3'包括：(a)包括seq id no:33的核酸序列的所述第一聚腺苷酸化序列；(b)所述第一编码序列；(c)包括seq id no:27的核酸序列的所述第一肝特异性转录调控元件；(d)包括seq id no:51的核酸序列的填充序列；(e)包括seq id no:67的核酸序列的所述第二肝特异性转录调控元件；(f)所述第二编码序列；以及(g)包括seq id no:31的核酸序列的所述第二转录聚腺苷酸化序列。40.根据权利要求35所述的raav基因组，其中所述raav基因组从5'到3'包括：所述第一表达盒的反向补体；填充序列；和所述第二表达盒。41.根据权利要求40所述的raav基因组，其中：(a)所述第一表达盒从5'到3'包括：与seq id no:27中所示的核苷酸序列至少90％相同的核苷酸序列，所述第一编码序列，与seq id no:33中所示的核苷酸序列至少90％相同的核苷酸序列；(b)所述填充序列包括与seq id no:51中所示的核苷酸序列至少90％相同的核苷酸序列或其反向补体；以及(c)所述第二表达盒从5'到3'包括：与seq id no:67中所示的核苷酸序列至少90％相同的核苷酸序列，所述第二编码序列，与seq id no:31中所示的核苷酸序列至少90％相同的核苷酸序列。
42.根据权利要求40所述的raav基因组，其中：(a)所述第一表达盒从5'到3'包括：与seq id no:67中所示的核苷酸序列至少90％相同的核苷酸序列，所述第一编码序列，与seq id no:31中所示的核苷酸序列至少90％相同的核苷酸序列；(b)所述填充序列包括与seq id no:51中所示的核苷酸序列至少90％相同的核苷酸序列或其反向补体；以及(c)所述第二表达盒从5'到3'包括：与seq id no:27中所示的核苷酸序列至少90％相同的核苷酸序列，所述第二编码序列，与seq id no:33中所示的核苷酸序列至少90％相同的核苷酸序列。43.根据权利要求40所述的raav基因组，其中：(a)所述第一表达盒从5'到3'包括：与seq id no:25中所示的核苷酸序列至少90％相同的核苷酸序列，与seq id no:26中所示的核苷酸序列至少90％相同的核苷酸序列，所述第一编码序列，所述第一聚腺苷酸化序列；(b)所述填充序列包括与seq id no:51中所示的核苷酸序列至少90％相同的核苷酸序列或其反向补体；以及(c)所述第二表达盒从5'到3'包括：与seq id no:119中所示的核苷酸序列至少90％相同的核苷酸序列，与seq id no:45中所示的核苷酸序列至少90％相同的核苷酸序列，所述第二编码序列，与seq id no:31中所示的核苷酸序列至少90％相同的核苷酸序列。44.根据权利要求40所述的raav基因组，其中：(a)所述第一表达盒从5'到3'包括：与seq id no:119中所示的核苷酸序列至少90％相同的核苷酸序列，与seq id no:45中所示的核苷酸序列至少90％相同的核苷酸序列，所述第一编码序列，与seq id no:31中所示的核苷酸序列至少90％相同的核苷酸序列；(b)所述填充序列包括与seq id no:51中所示的核苷酸序列至少90％相同的核苷酸序列或其反向补体；以及(c)所述第二表达盒从5'到3'包括：与seq id no:25中所示的核苷酸序列至少90％相同的核苷酸序列，与seq id no:26中所示的核苷酸序列至少90％相同的核苷酸序列，所述第二编码序列，所述第一聚腺苷酸化序列。45.根据权利要求40所述的raav基因组，其中：(a)所述第一表达盒从5'到3'包括：
seq id no:27中所示的核苷酸序列，所述第一编码序列，seq id no:33中所示的核苷酸序列；(b)所述填充序列包括seq id no:51中所示的核苷酸序列或其反向补体；以及(c)所述第二表达盒从5'到3'包括：seq id no:67中所示的核苷酸序列，所述第二编码序列，seq id no:31中所示的核苷酸序列。46.根据权利要求40所述的raav基因组，其中：(a)所述第一表达盒从5'到3'包括：seq id no:67中所示的核苷酸序列，所述第一编码序列，seq id no:31中所示的核苷酸序列；(b)所述填充序列包括seq id no:51中所示的核苷酸序列或其反向补体；以及(c)所述第二表达盒从5'到3'包括：seq id no:27中所示的核苷酸序列，所述第二编码序列，seq id no:33中所示的核苷酸序列。47.根据权利要求40所述的raav基因组，其中：(a)所述第一表达盒从5'到3'包括：seq id no:25中所示的核苷酸序列，seq id no:26中所示的核苷酸序列，所述第一编码序列，所述第一聚腺苷酸化序列；(b)所述填充序列包括seq id no:51中所示的核苷酸序列或其反向补体；以及(c)所述第二表达盒从5'到3'包括：seq id no:119中所示的核苷酸序列，seq id no:45中所示的核苷酸序列，所述第二编码序列，seq id no:31中所示的核苷酸序列。48.根据权利要求40所述的raav基因组，其中：(a)所述第一表达盒从5'到3'包括：seq id no:119中所示的核苷酸序列，seq id no:45中所示的核苷酸序列，所述第一编码序列，seq id no:31中所示的核苷酸序列；(b)所述填充序列包括seq id no:51中所示的核苷酸序列或其反向补体；以及(c)所述第二表达盒从5'到3'包括：seq id no:25中所示的核苷酸序列，
seq id no:26中所示的核苷酸序列，所述第二编码序列，所述第一聚腺苷酸化序列。49.一种raav基因组，所述raav基因组包括双顺反子表达盒，所述双顺反子表达盒从5'到3'包括：(a)肝特异性转录调控元件；第一编码序列，所述第一编码序列编码可操作地连接到第一信号序列的包括抗体重链的第一多肽；核糖体跳跃序列，所述核糖体跳跃序列编码核糖体跳跃肽；第二编码序列，所述第二编码序列编码可操作地连接到第二信号序列的包括抗体轻链的第二多肽；以及聚腺苷酸化序列；或(b)肝特异性转录调控元件；第二编码序列，所述第二编码序列编码可操作地连接到第二信号序列的包括抗体轻链的第二多肽；核糖体跳跃序列，所述核糖体跳跃序列编码核糖体跳跃肽；第一编码序列，所述第一编码序列编码可操作地连接到第一信号序列的包括抗体重链的第一多肽；以及聚腺苷酸化序列，其中所述双顺反子表达盒的表达产生包括所述抗体重链和所述抗体轻链的抗体。50.根据权利要求49所述的raav基因组，其中转录调控元件包括选自由以下组成的组的启动子元件：人白蛋白启动子、人运甲状腺素蛋白(ttr)启动子、人甲状腺素结合球蛋白(tbg)启动子、人apoh启动子、人serpina1(haat)启动子和其肝特异性调控模块，例如人apoe/c-i肝控制区(hcr)1或2。51.根据权利要求49或50所述的raav基因组，其中所述转录调控元件包括启动子元件，所述启动子元件包括与选自由seq id no:25、27、66、68、69、116和117组成的组的序列至少90％相同的核酸序列。52.根据权利要求49至51中任一项所述的raav基因组，其中所述转录调控元件包括与seq id no:27中所示的核苷酸序列至少90％相同的核苷酸序列。53.根据权利要求49至52中任一项所述的raav基因组，其中所述转录调控元件包括seq id no:27中所示的核苷酸序列。54.根据权利要求49至53中任一项所述的raav基因组，其中所述转录调控元件的核苷酸序列由seq id no:27中所示的核苷酸序列组成。55.根据权利要求49或50所述的raav基因组，其中所述转录调控元件包括与seq id no:67中所示的核苷酸序列至少90％相同的核苷酸序列。56.根据权利要求55所述的raav基因组，其中所述转录调控元件包括seq id no:67中所示的核苷酸序列。57.根据权利要求55所述的raav基因组，其中所述转录调控元件的核苷酸序列由seq id no:67中所示的核苷酸序列组成。58.根据权利要求49至57中任一项所述的raav基因组，其中所述双顺反子表达盒还包括内含子元件，所述内含子元件相对于所述第一编码序列和/或所述第二编码序列位于5'并且相对于所述转录调控元件位于3'。59.根据权利要求58所述的raav基因组，其中所述内含子元件是外源性内含子元件，任选地其中所述外源性内含子元件是sv40内含子元件或小鼠微小病毒(mvm)内含子元件。60.根据权利要求59所述的raav基因组，其中所述sv40内含子元件包括与seq id no:
29中所示的核苷酸序列至少90％相同的核苷酸序列。61.根据权利要求59或60所述的raav基因组，其中所述sv40内含子元件包括seq id no:29中所示的核苷酸序列。62.根据权利要求59至61中任一项所述的raav基因组，其中所述sv40内含子元件的核苷酸序列由seq id no:29中所示的核苷酸序列组成。63.根据权利要求59所述的raav基因组，其中所述mvm内含子元件包括与seq id no:30中所示的核苷酸序列至少90％相同的核苷酸序列。64.根据权利要求59所述的raav基因组，其中所述mvm内含子元件包括seq id no:30中所示的核苷酸序列。65.根据权利要求59所述的raav基因组，其中所述mvm内含子元件的核苷酸序列由seq id no:30中所示的核苷酸序列组成。66.根据权利要求49至65中任一项所述的raav基因组，其中所述转录调控元件包括：(a)hcr 1元件、haat启动子和sv40内含子元件；或(b)serpina1肝特异性调控模块、ttr启动子和mvm内含子元件。67.根据权利要求49至66中任一项所述的raav基因组，其中所述转录调控元件包括seq id no:50的核酸序列或seq id no:43的核酸序列。68.根据权利要求49至67中任一项所述的raav基因组，其中所述聚腺苷酸化序列是外源性聚腺苷酸化序列，任选地其中所述外源性聚腺苷酸化序列是sv40聚腺苷酸化序列或牛生长激素(bgh)聚腺苷酸化序列。69.根据权利要求68所述的raav基因组，其中所述sv40聚腺苷酸化序列包括与seq id no:31中所示的核苷酸序列至少90％相同的核苷酸序列。70.根据权利要求68或69所述的raav基因组，其中所述sv40聚腺苷酸化序列包括seq id no:31中所示的核苷酸序列。71.根据权利要求68至70中任一项所述的raav基因组，其中所述sv40聚腺苷酸化序列的核苷酸序列由seq id no:31中所示的核苷酸序列组成。72.根据权利要求68至71中任一项所述的raav基因组，其中所述bgh聚腺苷酸化序列包括与seq id no:33中所示的核苷酸序列至少90％相同的核苷酸序列。73.根据权利要求68至72中任一项所述的raav基因组，其中所述bgh聚腺苷酸化序列包括seq id no:33中所示的核苷酸序列。74.根据权利要求68至73中任一项所述的raav基因组，其中所述bgh聚腺苷酸化序列的核苷酸序列由seq id no:33中所示的核苷酸序列组成。75.根据权利要求1至74中任一项所述的raav基因组，其中所述第一信号序列和/或所述第二信号序列是天然存在的信号序列。76.根据权利要求1至74中任一项所述的raav基因组，其中所述第一信号序列和/或所述第二信号序列是抗体信号序列，任选地人igg2或igk信号序列。77.根据权利要求1至74中任一项所述的raav基因组，其中所述第一信号序列和/或所述第二信号序列是非天然存在的信号序列。78.根据权利要求1至74中任一项所述的raav基因组，其中所述第一信号序列和/或所述第二信号序列包括seq id no:80的氨基酸序列。
79.根据权利要求1至74中任一项所述的raav基因组，其中所述第一信号序列和/或所述第二信号序列包括seq id no:81的氨基酸序列。80.根据权利要求1至79中任一项所述的raav基因组，其中所述第一信号序列包括seq id no:80的氨基酸序列，并且所述第二信号序列包括seq id no:81的氨基酸序列。81.根据权利要求1至80中任一项所述的raav基因组，其中所述第一编码序列和/或所述第二编码序列包括seq id no:23、96、102或108中所示的核酸序列中的任一者。82.根据权利要求1至80中任一项所述的raav基因组，其中所述第一编码序列和/或所述第二编码序列包括seq id no:24、99、105、111或130中所示的核酸序列中的任一者。83.根据权利要求1至82中任一项所述的raav基因组，其中所述第一编码序列包括seq id no:23、96、102或108中所示的核酸序列中的任一者并且所述第二编码序列包括seq id no:24、99、105、111或130中所示的核酸序列中的任一者。84.根据权利要求1至83中任一项所述的raav基因组，其中所述抗体特异性结合于补体c5。85.根据权利要求1至84中任一项所述的raav基因组，其中所述抗体重链包括seq id no:64的氨基酸序列。86.根据权利要求1至84中任一项所述的raav基因组，其中所述抗体重链包括seq id no:82的氨基酸序列。87.根据权利要求1至84中任一项所述的raav基因组，其中所述抗体轻链包括seq id no:77的氨基酸序列。88.根据权利要求1至84中任一项所述的raav基因组，其中所述第一编码序列和/或所述第二编码序列已被优化以在人细胞中表达。89.根据权利要求1至84中任一项所述的raav基因组，其中所述第一编码序列包括seq id no:52、113、114或115中所示的核酸序列中的任一者。90.根据权利要求1至84中任一项所述的raav基因组，其中所述第一编码序列包括seq id no:83、94、95、101或107中所示的核酸序列中的任一者。91.根据权利要求1至84中任一项所述的raav基因组，其中所述第二编码序列包括seq id no:53、98、104、110或131中所示的核酸序列中的任一者。92.根据权利要求1至91中任一项所述的raav基因组，其中所述第一编码序列包括选自由seq id no:52、62、83、94、95、96、97、101、102、103、107、108、109、113、114和115组成的组的核苷酸序列，并且所述第二编码序列包括seq id no:53中所示的核苷酸序列。93.根据权利要求1至91中任一项所述的raav基因组，其中所述第一编码序列包括选自由seq id no:52、62、83、94、95、96、97、101、102、103、107、108、109、113、114和115组成的组的核苷酸序列，并且所述第二编码序列包括seq id no:63中所示的核苷酸序列。94.根据权利要求1至91中任一项所述的raav基因组，其中所述第一编码序列包括选自由seq id no:52、62、83、94、95、96、97、101、102、103、107、108、109、113、114和115组成的组的核苷酸序列，并且所述第二编码序列包括seq id no:98中所示的核苷酸序列。95.根据权利要求1至91中任一项所述的raav基因组，其中所述第一编码序列包括选自由seq id no:52、62、83、94、95、96、97、101、102、103、107、108、109、113、114和115组成的组的核苷酸序列，并且所述第二编码序列包括seq id no:99中所示的核苷酸序列。
96.根据权利要求1至91中任一项所述的raav基因组，其中所述第一编码序列包括选自由seq id no:52、62、83、94、95、96、97、101、102、103、107、108、109、113、114和115组成的组的核苷酸序列，并且所述第二编码序列包括seq id no:100中所示的核苷酸序列。97.根据权利要求1至91中任一项所述的raav基因组，其中所述第一编码序列包括选自由seq id no:52、62、83、94、95、96、97、101、102、103、107、108、109、113、114和115组成的组的核苷酸序列，并且所述第二编码序列包括seq id no:104中所示的核苷酸序列。98.根据权利要求1至91中任一项所述的raav基因组，其中所述第一编码序列包括选自由seq id no:52、62、83、94、95、96、97、101、102、103、107、108、109、113、114和115组成的组的核苷酸序列，并且所述第二编码序列包括seq id no:105中所示的核苷酸序列。99.根据权利要求1至91中任一项所述的raav基因组，其中所述第一编码序列包括选自由seq id no:52、62、83、94、95、96、97、101、102、103、107、108、109、113、114和115组成的组的核苷酸序列，并且所述第二编码序列包括seq id no:106中所示的核苷酸序列。100.根据权利要求1至91中任一项所述的raav基因组，其中所述第一编码序列包括选自由seq id no:52、62、83、94、95、96、97、101、102、103、107、108、109、113、114和115组成的组的核苷酸序列，并且所述第二编码序列包括seq id no:110中所示的核苷酸序列。101.根据权利要求1至91中任一项所述的raav基因组，其中所述第一编码序列包括选自由seq id no:52、62、83、94、95、96、97、101、102、103、107、108、109、113、114和115组成的组的核苷酸序列，并且所述第二编码序列包括seq id no:111中所示的核苷酸序列。102.根据权利要求1至91中任一项所述的raav基因组，其中所述第一编码序列包括选自由seq id no:52、62、83、94、95、96、97、101、102、103、107、108、109、113、114和115组成的组的核苷酸序列，并且所述第二编码序列包括seq id no:112中所示的核苷酸序列。103.根据权利要求1至102中任一项所述的raav基因组，其中所述raav基因组是单链raav基因组。104.根据权利要求1至103中任一项所述的raav基因组，其中所述raav基因组是自互补raav基因组。105.根据权利要求1至104中任一项所述的raav基因组，其中所述raav基因组包括seq id no:84的核酸序列。106.根据权利要求1至104中任一项所述的raav基因组，其中所述raav基因组包括seq id no:85的核酸序列。107.根据权利要求1至104中任一项所述的raav基因组，其中所述raav基因组包括seq id no:86的核酸序列。108.根据权利要求1至104中任一项所述的raav基因组，其中所述raav基因组包括seq id no:87的核酸序列。109.根据权利要求1至108中任一项所述的raav基因组，其中所述raav基因组还包括相对于所述第一聚腺苷酸化序列在5'的5'反向末端重复(5'itr)核苷酸序列和相对于所述第二聚腺苷酸化序列在3'的3'反向末端重复(3'itr)核苷酸序列。110.根据权利要求109所述的raav基因组，其中所述5'itr核苷酸序列与seq id no:14中所示的核苷酸序列至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同，和/或所述3'itr核苷酸序列与seq id no:18中所示的
核苷酸序列至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。111.根据权利要求1至110中任一项所述的raav基因组，其中所述raav基因组包括seq id no:88的核酸序列。112.根据权利要求1至110中任一项所述的raav基因组，其中所述raav基因组包括seq id no:89的核酸序列。113.根据权利要求1至110中任一项所述的raav基因组，其中所述raav基因组包括seq id no:90的核酸序列。114.根据权利要求1至110中任一项所述的raav基因组，其中所述raav基因组包括seq id no:91的核酸序列。115.一种重组腺相关病毒(raav)，其包括：(a)aav衣壳，所示aav衣壳包括aav衣壳蛋白；和(b)根据前述权利要求中任一项所述的raav基因组。116.根据权利要求115所述的raav，其中所述衣壳蛋白选自由以下组成的组：aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8和aav9。117.根据权利要求115或116所述的raav，其中所述aav衣壳蛋白包括与seq id no:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16或17的氨基酸203-736的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列。118.根据权利要求115至117中任一项所述的raav，其中：所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸206相对应的氨基酸是c；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸296相对应的氨基酸是h；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸312相对应的氨基酸是q；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸346相对应的氨基酸是a；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸464相对应的氨基酸是n；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸468相对应的氨基酸是s；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸501相对应的氨基酸是i；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸505相对应的氨基酸是r；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸590相对应的氨基酸是r；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸626相对应的氨基酸是g或y；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸681相对应的氨基酸是m；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸687相对应的氨基酸是r；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸690相对应的氨基酸是k；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸706相对应的氨基酸是c；或者所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸718相对应的氨基酸是g。119.根据权利要求118所述的raav，其中：(a)所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸626相对应的氨基酸是g，并且所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸718相对应的氨基酸是g；(b)所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸296相对应的氨基酸是h，所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸464相对应的氨基酸是n，所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸505相对应的氨基酸是r，并且所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸681相对应的氨基酸是m；(c)所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸505相对应的氨基酸是r，并且所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸687相对应的氨基酸是r；
(d)所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸346相对应的氨基酸是a，并且所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸505相对应的氨基酸是r；或者(e)所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸501相对应的氨基酸是i，所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸505相对应的氨基酸是r，并且所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸706相对应的氨基酸是c。120.根据权利要求118所述的raav，其中所述衣壳蛋白包括seq id no:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16或17的氨基酸203-736的氨基酸序列。121.根据权利要求115至120中任一项所述的raav，其中所述aav衣壳蛋白包括与seq id no:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16或17的氨基酸138-736的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列。122.根据权利要求121所述的raav，其中：所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸151相对应的氨基酸是r；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸160相对应的氨基酸是d；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸206相对应的氨基酸是c；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸296相对应的氨基酸是h；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸312相对应的氨基酸是q；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸346相对应的氨基酸是a；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸464相对应的氨基酸是n；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸468相对应的氨基酸是s；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸501相对应的氨基酸是i；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸505相对应的氨基酸是r；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸590相对应的氨基酸是r；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸626相对应的氨基酸是g或y；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸681相对应的氨基酸是m；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸687相对应的氨基酸是r；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸690相对应的氨基酸是k；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸706相对应的氨基酸是c；或者所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸718相对应的氨基酸是g。123.根据权利要求122所述的raav，其中：(a)所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸626相对应的氨基酸是g，并且所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸718相对应的氨基酸是g；(b)所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸296相对应的氨基酸是h，所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸464相对应的氨基酸是n，所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸505相对应的氨基酸是r，并且所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸681相对应的氨基酸是m；(c)所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸505相对应的氨基酸是r，并且所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸687相对应的氨基酸是r；(d)所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸346相对应的氨基酸是a，并且所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸505相对应的氨基酸是r；或者(e)所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸501相对应的氨基酸是i，所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸505相对应的氨基酸是r，并且所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸706相对应的氨基酸是c。124.根据权利要求122所述的raav，其中所述衣壳蛋白包括seq id no:1、2、3、4、5、6、
7、9、10、11、12、13、15、16或17的氨基酸138-736的氨基酸序列。125.根据权利要求115至124中任一项所述的raav，其中所述aav衣壳蛋白包括与seq id no:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16或17的氨基酸1-736的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列。126.根据权利要求125所述的raav，其中：所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸2相对应的氨基酸是t；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸65相对应的氨基酸是i；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸68相对应的氨基酸是v；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸77相对应的氨基酸是r；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸119相对应的氨基酸是l；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸151相对应的氨基酸是r；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸160相对应的氨基酸是d；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸206相对应的氨基酸是c；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸296相对应的氨基酸是h；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸312相对应的氨基酸是q；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸346相对应的氨基酸是a；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸464相对应的氨基酸是n；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸468相对应的氨基酸是s；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸501相对应的氨基酸是i；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸505相对应的氨基酸是r；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸590相对应的氨基酸是r；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸626相对应的氨基酸是g或y；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸681相对应的氨基酸是m；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸687相对应的氨基酸是r；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸690相对应的氨基酸是k；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸706相对应的氨基酸是c；或者所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸718相对应的氨基酸是g。127.根据权利要求126所述的raav，其中：(a)所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸2相对应的氨基酸是t，并且所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸312相对应的氨基酸是q；(b)所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸65相对应的氨基酸是i，并且所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸626相对应的氨基酸是y；(c)所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸77相对应的氨基酸是r，并且所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸690相对应的氨基酸是k；(d)所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸119相对应的氨基酸是l，并且所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸468相对应的氨基酸是s；(e)所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸626相对应的氨基酸是g，并且所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸718相对应的氨基酸是g；(f)所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸296相对应的氨基酸是h，所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸464相对应的氨基酸是n，所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸505相对应的氨基酸是r，并且所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸681相对应的氨基酸是m；(g)所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸505相对应的氨基酸是r，并且所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸687相对应的氨基酸是r；(h)所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸346相对应的氨基酸是a，并且所述衣壳
蛋白中与seq id no:16的氨基酸505相对应的氨基酸是r；或者(i)所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸501相对应的氨基酸是i，所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸505相对应的氨基酸是r，并且所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸706相对应的氨基酸是c。128.根据权利要求127所述的raav，其中所述衣壳蛋白包括seq id no:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16或17的氨基酸1-736的氨基酸序列。129.一种多核苷酸，所述多核苷酸包括seq id no:85-93中所示的核酸序列。130.一种药物组合物，所述药物组合物包括根据权利要求115至128中任一项所述的raav或根据权利要求129所述的多核苷酸。131.一种用于制备raav的包装系统，其中所述包装系统包括：(a)第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列编码一个或多个aav rep蛋白；(b)第二核苷酸序列，所述第二核苷酸序列编码根据权利要求115至128中任一项所述的raav的衣壳蛋白；以及(c)第三核苷酸序列，所述第三核苷酸序列包括根据权利要求1至114中任一项所述的raav的raav基因组序列。132.根据权利要求131所述的包装系统，其中所述包装系统包括包含所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列的第一载体，以及包括所述第三核苷酸序列的第二载体。133.根据权利要求131或132所述的包装系统，所述包装系统还包括包含一个或多个辅助病毒基因的第四核苷酸序列。134.根据权利要求133所述的包装系统，其中所述第四核苷酸序列包括在第三载体内。135.根据权利要求133或134所述的包装系统，其中所述第四核苷酸序列包括来自选自由以下组成的组的病毒的一个或多个基因：腺病毒、疱疹病毒、牛痘病毒和巨细胞病毒(cmv)。136.根据权利要求131至135中任一项所述的包装系统，其中所述第一载体、所述第二载体和/或所述第三载体是质粒。137.一种用于重组制备raav的方法，所述方法包括在借以产生所述raav的条件下将根据权利要求131至135中任一项所述的包装系统引入到细胞中。138.根据权利要求115至138中任一项所述的raav、根据权利要求130所述的药物组合物或根据权利要求129所述的多核苷酸，其用作药剂。139.根据权利要求115至138中任一项所述的raav、根据权利要求130所述的药物组合物或根据权利要求129所述的多核苷酸，其用于治疗补体c5相关疾病。140.根据权利要求115至138中任一项所述的raav、根据权利要求130所述的药物组合物或根据权利要求129所述的多核苷酸，其用于治疗患有补体c5相关疾病的受试者的方法中，所述方法包括向所述受试者施用有效量的所述raav、所述药物组合物或所述多核苷酸。141.一种在受试者中产生抗体的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求130所述的药物组合物。142.根据权利要求141所述的方法，其中所述药物组合物静脉内施用。143.一种治疗有需要的受试者的补体c5相关疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求115至128中任一项所述的raav、根据权利要求130所述的药物
组合物或根据权利要求129所述的多核苷酸。144.根据权利要求143所述的方法，其中所述补体c5相关疾病选自由以下组成的组：地图状萎缩(ga)、吉兰-巴雷综合征、重症肌无力、系统性红斑狼疮性(sle)肾炎、增生性肾炎、哮喘、类风湿性关节炎、败血症、阵发性睡眠性血红蛋白尿症(pnh)、非典型溶血性尿毒症综合征(ahus)和年龄相关性黄斑变性(amd)。145.根据权利要求143或144所述的方法，其中所述raav、所述药物组合物或所述多核苷酸静脉内施用。

技术总结
提供了用于在细胞中表达抗体(例如，抗补体成分5(C5)抗体)的重组腺相关病毒(rAAV)组合物，以及用所述组合物治疗病症(例如，与C5活性相关的病症(例如阵发性睡眠性血红蛋白尿症))的方法。还提供了用于制备rAAV组合物的组合物、系统和方法。系统和方法。


技术研发人员：C
受保护的技术使用者：同源药物公司
技术研发日：2021.09.09
技术公布日：2023/8/8