一种人参抗病基因L1LTP及编码蛋白、其应用及提高植物抗锈病的方法

一种人参抗病基因l1ltp及编码蛋白、其应用及提高植物抗锈病的方法
技术领域
1.本发明属于分子植物病理学技术领域，具体涉及一种人参抗病基因l1ltp及编码蛋白、其应用及提高植物抗锈病的方法。


背景技术：

2.人参为五加科草本植物，常用中草药之一，具有“百草之王”的美誉，东北三宝之首。通过几千年的实践证明，人参具有诸多重要临床功效，是人们长期以来广泛研究和利用的药中珍宝。但因人参生长周期较长，致使人参在长期的生长发育过程中，容易遭受病原微生物等的侵袭，从而引发一系列的病害。针对这些病害，目前主要以化学防治为主，如使用波尔多液、多菌灵等农药，但此类农药在土壤中难以降解，易产生抗药性、效果不稳定、破坏土壤微生物环境等弊端。同时，大量农药的使用迫使人参产品农药残留超标，严重影响了人参的质量。因此，亟需寻找安全有效的解决人参病害的方法。通过挖掘人参的抗病基因优质资源，并利用这些基因来提高植物的抗病能力，这对人参增产至关重要。
3.主要的人参病害有两种：一种是侵染性病害，另一种是非侵染性病害。其中侵染性病害主要有黑斑病、灰霉病、立枯病、菌核病、疫病、锈腐病、碎倒病、根腐病、炭疽病、褐斑病、枯萎病、斑点病、斑枯病、白粉病、细菌性软腐病、根结线虫病等，非侵染性病害主要有红皮病、日灼病、冻害、根裂等。田间管理不当会造成大片人参出现染病与死亡的情况，极易造成严重的产量下降与经济损失。人参锈腐病是由人参锈腐菌cylindrocarpon destructans侵染所致，侵染初期参根表皮出现锈色斑点，随后从中心开始由浅入深逐步扩大。根部发病后部分叶子变黄色或红色或者不变色，但叶子皱褶不平植株生长明显矮小。埋于土中的茎基部发病时也常呈现褐色病斑严重的整个地上部萎蔫、倒伏、死亡，此病常发生于参苗地、新栽参地，在连作参地中则尤其严重，一般可造成绝产。一直以来，研究者都在努力寻找一种有效防治人参锈病的方法，以缓解人参锈病菌对人参的侵害，同时保障人参的质量产量。生产上对于人参锈病的防治主要以化学防治为主，常见的为五氯硝基苯粉剂、托布津等等可湿性粉剂。但病害对化学农药的抗药性的增强和农药所带来的污染问题的日趋严重。近年来随着人们对“绿色食品”需求的日益增加，以及对环境保护的日益关注，人们将控制植物病害的方法转向了生物防治。目前国内外对辣椒、葡萄、等植物生物防治的研究已经取得了较大的进展，但是针对人参病毒害的生物防治报道较少。


技术实现要素：

4.为了解决上述问题，克服现有技术的缺点与不足，本发明一方面提供一种人参抗病基因l1ltp的编码蛋白，其氨基酸序列如seq id no:2所示。
5.本发明一方面提供了一种编码以上人参抗病基因l1ltp编码蛋白的人参抗病基因l1ltp。
6.其中，人参抗病基因l1ltp核苷酸序列如seq id no:1所示。
7.另一方面，还提供了人参抗病基因l1ltp在提高植物抗病性方面的应用，即通过过表达人参抗病基因l1ltp，提高植物对锈病的抗性；
8.所述的植物为人参或拟南芥；
9.所述的锈病为人参锈病。
10.另一方面，本发明还提供了人参抗病基因l1ltp在培育抗病植物中的应用，其特征在于，通过过表达人参抗病基因l1ltp，提高植物对锈病的抗性；
11.其中，所述的植物为人参或拟南芥；
12.所述的锈病为人参锈病。
13.另一方面，本发明还提供了一种提高人参或拟南芥抗锈病的方法，即在人参或拟南芥中过量表达核苷酸序列如seq id no:1所示l1ltp基因。
14.最后，本发明还提供了一种培育抗锈病植物的方法，该方法是编码人参转运蛋白的基因导入植物组织活细胞，得到抗锈病的植物，其中，所述人参转运蛋白的氨基酸序列如seq id no:2所示。
15.其中，植物宿主为人参或拟南芥。
16.本发明相对于现有技术具有如下的优点及有益效果：
17.(1)本发明的人参抗病相关基因l1ltp是从人参中分离得到的，该基因全长363bp，该基因编码的蛋白是一个全长由120个氨基酸组成的脂质转移蛋白，通过转录模式分析和植物表达分析发现，l1ltp基因可提高植物对锈病的抗性，因此，该人参抗病相关基因l1ltp可应用于植物中用于抗锈病，如应用于人参或拟南芥中，是一个应用价值很高的抗病材料；
18.(2)本发明通过将人参ltp基因转入拟南芥，在拟南芥中进行ltp基因功能分析，转基因株系中的pr1、pr3、pr4、pr5、pr8等拟南芥体内相关prs基因的表达水平在抗病后均高于野生型拟南芥植株，验证了ltp基因能提高植株抗病性；
19.(3)本发明将野生型拟南芥和转基因拟南芥离体叶片接种人参锈病孢子，接种1天后，均无明显发病症状；2天后发现野生型拟南芥叶片轻微发黄，而转基因拟南芥叶片接种部位无明显症状；3天后发现人参锈病菌对非转基因植株的叶片表现致病性，整个叶片萎蔫发黄，尤其是尖端部分而转基因植株叶片轻度萎蔫，说明转基因拟南芥叶片对人参锈病病原菌有一定的抗性作用。
附图说明
20.图1.人参总rna核酸电泳图；其中，1表示dl 10000tmdna marker；2表示人参总rna；
21.图2.ltp基因的克隆；其中，1表示dl 1000tmdna maker；2表示ltp基因扩增片段；
22.图3.酶切鉴定电泳图；其中，从左至右分别是1表示dl 5000tmdna maker；2表示重组质粒；3表示重组质粒单酶切；4表示重组质粒双酶切；
23.图4.ta克隆测序比对；
24.图5.菌液pcr鉴定结果：1表示dl 1000tmdna maker；2表示ltp基因扩增片段；
25.图6.pcambia1303-ltp测序比对；
26.图7.菌液pcr鉴定结果；1表示dl 15000tmdna maker；2表示ltp基因扩增片段；
27.图8a.转基因拟南芥植株抗性平板筛选；其中，
↑
箭头所指为阳性植株右上角为放
大后植株；
28.图8b.转基因拟南芥植株gfp荧光蛋白检测；1表示col-0野生型拟南芥；2表示转基因拟南芥；
29.图9.转基因拟南芥pcr检测；其中，1表示dl 1000tmdna maker；2表示转基因拟南芥；3表示col-0野生型拟南芥；4表示阳性质粒；
30.图10.转基因拟南芥rt-pcr检测；其中，1表示dl 1000tmdna marker；2表示转基因拟南芥；3表示col-0野生型拟南芥；4表示阳性质粒；
31.图11a.抗性株系内参基因westhern blot检测结果；1表示预染marker；2表示col-0野生型拟南芥；3表示转基因拟南芥；
32.图11b.抗性株系目的基因westhern blot检测结果；其中，1表示预染marker；2表示col-0野生型拟南芥；3表示转基因拟南芥；
33.图12.转ltp基因及野生型拟南芥接种锈病孢子表型检测；其中，1表示col-0野生型拟南芥；2表示转基因拟南芥；
34.图13.胁迫前后抗性株系叶片抑菌检测；1表示col-0野生型拟南芥；2表示转基因拟南芥；
35.图14.胁迫后抗性株系叶片过氧化氢检测；其中，1表示col-0野生型拟南芥；2表示转基因拟南芥；
36.图15.蛋白提取液对锈病孢子抗性检测结果；其中，1表示col-0野生型拟南芥蛋白；2表示转基因型拟南芥蛋白；
37.图16.菌胁迫前后抗性株系real time pcr检测结果；其中，**：prs基因的表达量在阳性植株与野生型植株存在极显著性差异(p《0.01)。
具体实施方式
38.下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。
39.实施例1人参总rna提取及rt-pcr扩增
40.1改良trizol法提取人参总rna
41.(1)称取0.1g人参组织，置于预冷研钵中迅速研磨至粉状；
42.(2)加入1.0mltrizol溶液，待粉末溶化后再研磨10min，取1.0ml混合液于ep管中，依次加入120μl无水乙醇和200μl氯仿，涡旋混匀，冰浴5min；
43.(3)12000rpm离心10min，取上清液，加入适量的氯仿后振荡混匀，冰浴2min；12000rpm离心15min，重复萃取2～3次，直至中间层消失，取上清液并加入相等体积的异丙醇和1/5体积的naac(ph5.8)并充分混匀，-20℃放置2h；
44.(4)12000rpm离心10min，弃上清，加入75％乙醇1ml，洗涤沉淀；12000rpm离心5min，弃上清，倒置20min，待乙醇挥发后加入20μl depc水(1％)，使其充分溶解；
45.(5)1％琼脂糖凝胶电泳检测rna质量。
46.2biospec-nano微量紫外可见分光光度计检测
47.(1)运行“nucleicacid-rna”模式；
48.(2)用1μlddh20水清洗检测孔，重复3次；
49.(3)用1μldepc水(1％)进行空白测定；
50.(4)取rna样品1μl进行测定，可得到浓度(ng/μl)、纯度包括od260/od280和od260/od230等相关信息。
51.结果：经核酸电泳检测，28s和18s条带清晰可见，其中28s浓度大约是18s的2倍(图1)，经检测后得出浓度约为3000(ng/μl)、纯度：od260/od280比值为2.19，od260/od230比值为1.68。故所提取的总rna纯度较高、完整性好，可为后续实验所用。
52.3ltp基因的rt-pcr扩增
53.3.1反转录反应：
54.(1)按表1配制反转录反应液
55.表1反转录反应液
56.试剂名称加样体积mgcl220.0μl10
×
rt buffer10.0μlrnase free dh2o37.5μldntp mixture(各10mm)10.0μlrnase inhibitor2.5μlamv reverse transcriptase5.0μloligo dt-adaptor primer5.0μl总rna10.0μl总体积100.0μl
57.(2)按下列反转录条件进行反应
[0058][0059]
3.2pcr反应
[0060]
(1)引物设计通过primer 5.0软件，由华大基因有限公司合成，合成序列如下所示：
[0061]
l1f：5
’‑
catgccatggctagttcagctgga-3’[0062]
l1r：5
’‑
ccctcgagctgcacccttggagcagt-3’[0063]
(2)按表2配制pcr反应液
[0064]
表2pcr反应液
[0065]
试剂名称加样体积5
×
pcr buffer16.0μlddh2o69.5μltakara ex taq hs0.5μl
cdna10.0μl上游引物l1f2.0μl下游引物l1r2.0μl总体积100.0μl
[0066]
(3)按下列条件进行pcr反应
[0067][0068]
(4)pcr反应后，琼脂糖凝胶电泳检测pcr反应产物，目的片段的碱基长度为300～400bp。
[0069]
结果：以人参cdna为模板扩增ltp基因，pcr扩增产物经电泳检测，如图2所示，扩增产物片段大小在300～400bp。测序结果如seq id no:2所示，全长363个碱基，编码120个氨基酸。
[0070]
3.3琼脂糖凝胶电泳
[0071]
(1)配置2％凝胶：称取琼脂糖0.7g，加入tae电极缓冲液35ml，转移至微波炉中间断加热至充分溶解(约1min)。室温放至50℃左右，加入1.75μleb，快速充分混匀，然后迅速倒入胶槽中(确保胶面水平且无气泡)，静置20min后，待凝胶凝固备用；
[0072]
(2)样品处理：取4μl样品，与1μl10
×
上样缓冲液，混匀；(3)上样：垂直拔下梳子，将胶片转移至电泳槽中，固定，向电泳槽中缓慢地倒入电极缓冲液，没过胶片1mm为宜(电极缓冲液不要超过水位标记)，缓慢的将样品垂直加入到点样孔中，调节电压和时间(135v，15min)。电泳结束后，将胶片转移至凝胶成像仪中进行分析。
[0073]
3.4pcr产物回收
[0074]
(1)将目的基因dna条带从琼脂糖凝胶中切下放入干净的离心管中，称取重量。向胶块中加入等倍体积溶液pn(凝胶为0.1g，其体积可视为100μl，则加入100μlpn溶液)，
[0075]
50℃水浴放置，其间不断温和的上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解；
[0076]
(2)向吸附柱ca2(吸附柱放于收集管中)加入500μl平衡液bl，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；
[0077]
(3)凝胶融化后加入吸附柱中，室温静置2min，12000rpm离心60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；
[0078]
(4)向吸附柱中加入600μl漂洗液，12000rpm离心60s，弃去废液，重复两次；
[0079]
(5)将吸附柱放入新收集管中，12000rpm离心2min，除净漂洗液，室温放置10min，彻底晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验；
[0080]
(6)将吸附柱放入干净ep管中，向吸附膜中间位置悬空滴加30μl洗脱液eb，室温放置2min。12000rpm离心2min，收集dna溶液。
[0081]
实施例2目的基因的连接
[0082]
用1％琼脂糖凝胶电泳检测回收后dna溶液的纯度与浓度，配置ta克隆连接反应
液，solution为5μl，pcr产物4μl，pmd18-tvector 1μl轻轻混匀，16℃水浴2h。
[0083]
实施例3目的基因的转化
[0084]
1大肠杆菌dh5感受态的制备
[0085]
(1)取大肠杆菌dh5α菌液1μl，加入199μl不含抗生素的lb(-)培养液中稀释，均匀涂布在固体lb(-)培养基上，液体被吸收后，将培养皿倒置放入培养箱中，37℃培养12-16h。
[0086]
(2)挑取一个单菌落，转移到5mllb(-)培养液中，在37℃，200rpm条件下培养12h。培养液浑浊后，以1:100的比例将菌液转移至100mllb(-)培养液中，在相同条件下继续培养至od600到0.6左右。
[0087]
(3)将菌液转移至两个无菌、冰预冷的50ml冻干管中，冰浴15min。4200rpm离心15min，倒掉上清，倒置冻干管尽量使残留的培养液流尽。
[0088]
(4)分别加入30ml冰预冷的0.1mol/lcacl2-mgcl2溶液重悬菌体沉淀。同样条件离心15min，弃去上清。
[0089]
(5)分别加入2ml冰预冷的0.1mol/lcacl2溶液重悬菌沉淀，加入终浓度为20％的甘油，混匀，取200μl分装于1.5ml的离心管中，-80℃冰箱保存备用。
[0090]
2pmd18-t-ltp的转化
[0091]
(1)取10μl的ta克隆连接液，加到200μl的dh5α感受态中，冰浴30min，42℃热激45s，立即取出置于冰上2min。
[0092]
(2)加入800μllb培养液，180rpm，37℃培养1h，4,200rpm离心2min，弃去部分上清800μl，剩余培养液重悬菌沉淀。
[0093]
(3)用涂菌棒将重悬后的菌液均匀涂布于lb培养基(amp+)上，静置待液体吸干后，倒置放入培养箱中，37℃倒置培养12-16h。
[0094]
实施例4双酶切鉴定
[0095]
1质粒提取
[0096]
(1)挑取生长状态良好的单个菌落，分别接种于5mllb培养液中，在37℃，200rpm条件下培养12h；
[0097]
(2)将菌液12,000rpm离心1min，多次重复离心，富集沉淀；(3)向cp3吸附柱中加入500μl平衡液bl，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。向离心后的菌体沉淀中加入p1溶液250μl，用移液器彻底悬浮起细菌沉淀，加入p2溶液250μl，上下轻柔颠倒4～6次，反应时间不应超过5min，之后加入p3溶液350μl，上下轻柔颠倒4～6次，12,000rpm离心10min；
[0098]
(4)将离心管中的液体转移至吸附柱cp3中，12,000rpm离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放于收集管中；
[0099]
(5)向吸附柱中加入pw漂洗液600μl，12,000rpm离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放于收集管中，重复一次；
[0100]
(6)12,000rpm离心2min，尽可能除去漂洗液。将cp3柱放于干净的ep管中，向膜中间部位悬空滴加入50～100μl洗脱缓冲液eb。-20℃保存。
[0101]
2双酶切鉴定
[0102]
按表3配制双酶切反应液
[0103]
表3pmd18-t-ltp质粒双酶切反应液
[0104][0105][0106]
将反应液于37℃反应2h，取4μl酶切产物进行1％琼脂糖电泳检测，将检测合格的pmd18-t-ltp质粒进行测序。
[0107]
结果：ltp基因与pmdtm18-t载体连接后转化到大肠杆菌dh5α感受态细胞中，提取质粒进行酶切鉴定，用2％琼脂糖凝胶核酸电泳检测，结果显示，经bamhi单酶切后在2000-4000bp处出现单一条带，经bamhi与xbai双酶切后在2000-4000bp之间和300-400bp处各出现单一条带(如图3)，分别为pmdtm18-t载体与ltp基因片段。将双酶切成功的菌液进行测序，利用dnaman软件将测序序列与ltp基因序列进行比对，结果如图4所示，表明ltp与克隆载体pmdtm18-t成功连接。
[0108]
实施例5表达载体的构建
[0109]
(1)将测序正确的质粒用bamhi和xbai进行双酶切，回收目的基因ltp；
[0110]
(2)按照pcambia1303载体说明书配制连接反应液，混匀后于16℃水浴12h，将目的基因ltp与表达载体pcambia1303连接；
[0111]
(3)将25μl连接反应液加入到dh5α感受态中，轻柔混匀，冰浴30min；
[0112]
(4)按如前所述方法进行转化；
[0113]
(5)取10μlpcambia1303空质粒转化到dh5α感受态细胞中，作为阴性对照。
[0114]
实施例6双酶切鉴定
[0115]
按如实施例4所述方法进行双酶切鉴定，对检测合格的质粒进行测序。
[0116]
结果：用限制性内切酶同时酶切pmdtm18t-ltp克隆载体和pcambia1303表达载体，琼脂糖凝胶电泳分离后回收小片段ltp基因和大片段pcambia1303，胶回收后琼脂糖凝胶电泳检测，经t4dna连接酶连接后转化大肠杆菌dh5α感受态细胞中，菌液pcr鉴定结果如图5所示，pcr产物在300～400bp处有明显条带，测序，利用dnaman软件将测序序列与ltp基因序列进行比对，结果如图6所示。
[0117]
实施例7农杆菌agl0感受态的制备
[0118]
(1)将农杆菌agl0菌液1μl，加入到99μl不含抗生素的yeb(-)培养液中，采用“平板划线法”涂布于yeb(rif+)培养基上，28℃恒温培养48h；
[0119]
(2)挑取单一菌落，转移到4ml yeb(rif+)培养液中，于28℃，180rpm震荡培养24h；
[0120]
(3)培养液浑浊后，将菌液转移至100ml yeb(rif+)培养液中，相同条件下继续培养15h；
[0121]
(4)将菌液分装于两个无菌50ml冻干管中，冰浴30min，5000rpm离心15min，弃上清液；
[0122]
(5)分别加入冰预冷灭菌后的0.15m nacl溶液30ml，轻柔混匀沉淀菌体。相同条件
下离心，弃去上清；
[0123]
(6)分别加入冰预冷灭菌后的20mm cacl2溶液1ml重悬菌沉淀，分装于无菌ep管中加入终浓度为20％的甘油，轻轻颠倒混匀，分装于离心管中，-80℃冰箱备用。
[0124]
实施例8农杆菌的转化
[0125]
(1)将10μl质粒pcambia1303-ltp加入到农杆菌感受态中，轻弹混匀，冰浴30min，液氮速冷冻1min，37℃水浴2min，加入800ul yeb(-)培养液中，180rpm震荡培养4h；
[0126]
(2)4200rpm离心5min，弃700μl上清培养液，重悬剩余菌沉淀；
[0127]
(3)将菌液用无菌“l”型玻璃棒均匀涂布在yeb(kan+、rif+)固体培养基，28℃倒置培养48h；
[0128]
(4)将空质粒pcambia1303转化到农杆菌感受态中，作为阴性对照。
[0129]
实施例9pcr鉴定
[0130]
(1)配制菌液pcr反应液，反应体系为：master mix 10μl，菌液1μl，上下游引物各1μl，ddh2o水补至20μl；
[0131]
(2)将配制好的20μl pcr反应液加入1μl菌液中，轻柔混匀，pcr反应条件：94℃预变性5min,94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min,32个循环后72℃延伸5min；
[0132]
(3)取5μl pcr产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。
[0133]
结果：将pcambia1303-ltp质粒转入农杆菌agl0中，并进行菌液pcr鉴定，在300～400bp处有明显条带(图7)。说明ltp基因表达载体构建成功，获得重组植物表达载体pcambia1303-ltp。
[0134]
实施例10拟南芥的转化
[0135]
(1)选取抽苔期生长状态良好的拟南芥，植株高约10cm时用剪刀切去莲座叶以上主花轴，以促进次生花轴抽苔；
[0136]
(2)待植株再次高约10～15cm可用作转化实验，转化实验前一天晚上浇水一次，剪去新生荚果以及已开放的花序；
[0137]
(3)将鉴定无误的含有重组质粒(pcambia1303-ltp)的农杆菌菌种100μl接种于100ml yeb液体培养基中(kan+、rif+)，200rpm，28℃振荡培养48h；
[0138]
(4)于4500rpm，4℃离心15min，收集菌沉淀，然后将菌体悬浮于转化渗透缓冲液中(od600＝0.5～0.6)。将拟南芥花序浸入转化缓冲液(加入5％蔗糖，终浓度为0.02％silwetl-77)中浸泡5min；
[0139]
(5)将拟南芥平放，保鲜膜包裹花序，置于28℃恒温培养箱，避光培养24h，2d后拟南芥直立，去掉保鲜膜，正常生长，一周后重新浸染一次，剪下成熟夹角，收获种子，室温干燥后4℃保存。
[0140]
实施例11拟南芥阳性筛选
[0141]
1潮霉素筛选
[0142]
筛选时将被侵染后的种子进行消毒(75％乙醇漂洗5min，无菌水冲洗2遍，2％次氯酸钠漂洗5min，无菌水冲洗3～5遍)，并用无菌牙签播于含潮霉素抗性的ms选择培养基中，每个培养皿约60粒种子。密封后转移至人工培养箱中(16h光照/8h黑暗，21～23℃)，挑选抗性株系转移至营养土中，抗性株系和野生型对照植株均于相同条件下培养。
[0143]
2荧光筛选
[0144]
对转基因拟南芥进行筛选，利用表达载体上的gfp荧光蛋白标签，同时取野生型拟南芥及抗性拟南芥幼苗的叶片，放于载玻片上，在显微镜下观察荧光信号的强弱。
[0145]
农杆菌侵染后收获早期成熟的拟南芥种子，4℃春化24～48h，干燥消毒后播种于含有30μg/ml潮霉素的ms培养基上进行平板上筛选，得阳性幼苗，阳性幼苗在培养基上生长9d左右，幼苗呈现正常的绿色，并且产生一条约1～2cm的白色主根；而不抗潮霉素的幼苗叶片萎蔫发黄，且幼苗矮小，不会形成正常的较长的白色主根，并逐渐死亡(图8a)，将获得的阳性幼苗与野生型幼苗叶片同时放在倒置荧光显微镜下观察，可见在白炽灯下阳性幼苗与野生型拟南芥幼苗叶片没有明显区别，而在特定波长下阳性幼苗叶片发出强烈的绿色，而野生型幼苗叶片则无(图8b)，说明重组质粒已经成功导入拟南芥中。
[0146]
实施例12拟南芥的dna提取及pcr鉴定
[0147]
1dna提取
[0148]
采用ctab法提取拟南芥dna，提取生长28天的野生型拟南芥和筛选出的转基因拟南芥植株，提取步骤如下：
[0149]
(1)取0.5g拟南芥组织放入已用液氮预冷过的研钵中，在液氮中快速研磨至奶粉末状；
[0150]
(2)将粉末放进65℃已预热600μlctab提取液中(确定已加入β-巯基乙醇)，剧烈震荡后，立即放回水浴锅中同温度继续预热5min，取出，剧烈震荡后再放回水浴锅中同温度继续反应5min；
[0151]
(3)加入等体积的氯仿，剧烈震荡后冰浴约7～10min，12000rpm，离心10min，将上层无色水相转移至干净的离心管中，重复一次，操作时切勿吸到中间层蛋白杂质；
[0152]
(4)加入等体积异丙醇，上下颠倒混匀后，4℃静止1～2h后12000rpm，离心10min，弃上清；
[0153]
(5)加入75％乙醇清洗沉淀，在4℃条件下，12,000rpm，离心7min，空气中干燥10～15min，加入20～40μlte溶解基因组dna。
[0154]
2pcr鉴定
[0155]
以基因组dna为模板，l1f，l1r为特异性引物，pcambia1303-ltp重组质粒为阳性对照、野生型拟南芥为阴性对照进行pcr扩增(过程详见实施例3)，检测ltp基因是否成功复制。
[0156]
结果：将筛选获得的阳性株移于腐殖土中进行培养，待幼苗生长28天，提取野生型拟南芥和筛选出的阳性拟南芥基因组dna，以其为模板进行pcr扩增，如图9所示，对扩增产物在琼脂糖凝胶电泳上显示的位置与阳性对照进行比对，发现转基因植株扩增出与阳性对照一致的特异条带，而野生型拟南芥未扩增出相应的特异条带。说明重组质粒已经整合进抗性株的基因组dna中，鉴定出的抗性植株为转基因植株。
[0157]
实施例13拟南芥的rna提取及rt-pcr鉴定
[0158]
1采用ctab法提取野生型和转化株拟南芥的rna
[0159]
(1)～(3)同上述dna提取方法；
[0160]
(4)加入等体积4m licl，混匀后，置于4℃冰箱，静止4～6h；(5)12,000rpm，离心10min，弃上清液。洗沉淀用75％乙醇，12,000rpm，离心5min，弃上清，自然干燥15～20min，加入20～40μl灭菌的depc水溶解总rna；
[0161]
(6)取1～2μl用biospec-nano微量紫外可见分光光度计测定rna浓度和纯度，其余一部分采用反转录反应，另一部分加入1ml的乙醇后放液氮中保存。采用takara rna pcr kit(amv)ver.3.0试剂盒进行反转录，具体操作步骤详见实施例3。
[0162]
2pcr扩增
[0163]
以拟南芥cdna为模板，l1f和l1r特异性引物进行pcr扩增，检测ltp基因是否成功转录。
[0164]
结果：本实验对pcr杂交为阳性的植株进行rt-pcr检测，采用ctab法提取拟南芥植物的总rna，进行rt-pcr扩增，对扩增产物在琼脂糖凝胶电泳上显示的位置与阳性对照进行比对，发现转基因植株扩增出与阳性对照一致的特异条带，而野生型拟南芥未扩增出相应的特异条带(图10)，rt-pcr结果表明，整合到拟南芥基因组中的ltp基因已被camv35s启动子启动，转录为完整的mrna，在转录水平上检测了ltp基因的表达,荧光定量pcr结果显示，转基因ltp拟南芥与野生型植株相比ltp基因mrna转录水平显著升高(p《0.01)。
[0165]
实施例14拟南芥的蛋白提取、浓度测定及western blot鉴定
[0166]
1蛋白含量测定
[0167]
a绘制标准曲线
[0168]
按表4配制牛血清白蛋白(bsa)标准曲线反应液。
[0169]
表4bsa标准曲线反应体系
[0170]
编号1234567bsa(μl)0123456pbs(μl)1514131211109考马斯亮(μl)280280280280280280280
[0171]
加完反应液后，立刻计时，震荡混匀，5～6min后检测各孔bsa蛋白od
595
值，并绘制标准曲线。
[0172]
b蛋白提取及浓度测定
[0173]
(1)将拟南芥组织在液氮状态下研磨成奶粉状，加入蛋白提取液后剧烈斡旋混匀，冰浴10min，12000rpm离心10min吸出上清液，冰浴5min，12000rpm离心10min；
[0174]
(2)取15μl蛋白样品(col-0，ltp)，加入考马斯亮蓝280μl反应6min，检测od595值。将吸光度值带入标准曲线，即得相应蛋白浓度并将蛋白提取液调节至相同的浓度。
[0175]
2western blot鉴定
[0176]
(1)按表5配置蛋白电泳分离胶及浓缩胶，直至凝胶；
[0177]
(2)样品处理：取10μl样品加入10μl上样缓冲液，混匀后沸水加热5min，离心，待上样；
[0178]
(3)每孔上样量为10～20μl，待电泳完毕后，把分离胶放在电转溶液中待用；。
[0179]
(4)用半干转仪将总蛋白转至pvdf膜，放置顺序为滤纸，胶片，pvdf膜，滤纸(从上往下)，电转条件为电流300ma，电压15v，18min；
[0180]
(5)电转过后将pvdf膜用5％脱脂牛奶封闭1h，pbst洗脱5min,重复三次；
[0181]
(6)目的蛋白一抗(多克隆兔抗)由人参ltp蛋白部分肽段(saattrsdrqvac))免疫家兔获得，内参抗体为购买的鼠抗，抗体使用前用含有3％脱脂奶粉的磷酸盐缓冲溶液稀释，一抗37℃孵育2h后pbst洗脱三次。目的蛋白二抗为hrp标记的羊抗兔igg，内参蛋白为
hrp标记的羊抗鼠igg，使用前用含有3％脱脂奶粉的磷酸盐缓冲溶液稀释抗体，二抗室温孵育1h，pbst洗脱三次；
[0182]
(7)将荧光凝胶成像系统提前打开，降温预冷；
[0183]
(8)将ecl试剂盒中的显色液a、b,1:1等体积混合均匀，均匀滴于pvdf膜，对该膜进行避光显色，约1min后，放于成像仪中检测蛋白的表达情况。
[0184]
表5sds-page电泳胶配制表
[0185]
试剂名称分离胶浓缩胶(ml)30％acr3.06——10％acr——0.75蒸馏水0.250.5150％甘油1.20.53m tris(ph8.0)1.5——0.5m tris(ph6.8)——0.62510％sds0.060.02510％ap0.040.015temed0.0040.012
[0186]
结果：相同浓度的蛋白经一抗、二抗孵育，ecl显色后发现，内参基因表达完整(图11a)，目的基因检测结果为阳性植株有明显条带，与ltp抗体有特异性结合，而野生型并未结合(图11b)。westernblot结果说明导入的ltp基因能够成功的进行蛋白表达。
[0187]
实施例15转基因植株抗锈病鉴定及荧光定量pcr分析
[0188]
1孢子悬浮液制备
[0189]
(1)配置pdb液体培养基，将去皮切成均匀块状的马铃薯放入蒸馏水中煮沸至玻璃棒可以插动马铃薯块为止，8层纱布过滤后用蒸馏水补足至相应体积，加入葡萄糖，充分溶解后于115℃灭菌20min。
[0190]
(2)锈病真菌菌丝块在pdb培养基中150rpm条件下于25℃避光培养3～4天后用八层无菌纱布过滤，灭菌水进行稀释，血球计数板计数，浓度为每毫升1.9
×
106个。
[0191]
2植株侵染及荧光定量pcr检测目的基因表达
[0192]
(1)转基因和野生型拟南芥种子用无菌牙签播种至装有1/4ms培养基玻璃瓶(20
×
110mm)中，人工气候箱中正常条件培养28天；
[0193]
(2)向生长28天的植物根部滴加1ml孢子悬浮液，封口，置于湿度为95％，温度22℃的黑暗条件下培养24h后移至正常生长条件下培养，每天观察长势，染病情况并拍照；
[0194]
(3)在野生型和转基因型拟南芥染病情况有明显区别时提取各个植株(col-0，ltp)rna，反转录反应同实施例3；
[0195]
(4)以ltp基因特异性引物l2f、l2r，内参基因β-actin，引物序列为f：ggcgatgaagctcaatccaaacgr:ggtcacgaccagcaagatcaagacg进行ltp基因表达分析。
[0196]
结果：拟南芥感染人参锈病包子悬浮液6天后，观察到阴性对照组出现莲座严重萎蔫枯黄，茎部叶部严重腐烂的现象，枯黄叶片占整株叶片的50％左右，转基因ltp植株的生长状态明显优于野生型，生长状态良好，几乎未见枯黄萎蔫现象，茎部叶部并未出现腐烂现象(图12)，说明将ltp基因转入拟南芥中能显著提高对人参锈病菌的抵抗与胁迫能力。
[0197]
3qpcr反应
[0198]
(1)qpcr反应体系为10μl，sybr5μl，灭菌水3.8μl，l2f、l2r各0.2μl，0.8μlcdna；
[0199]
(2)qpcr反应条件为：95℃预变性30sec，60℃反应34sec，反应经39个循环后，60℃反应1min，95℃反应15sec；
[0200]
(3)以公式2-δδct
计算野生型以及转基因型植株的ltp表达量，植株侵染前后的荧光定量pcr重复检测3次；
[0201]
结果：野生型拟南芥和转基因拟南芥离体叶片接种人参锈病孢子，接种1天后，均无明显发病症状；2天后发现野生型拟南芥叶片轻微发黄，而转基因拟南芥叶片接种部位无明显症状；3天后发现人参锈病菌对非转基因植株的叶片表现致病性，整个叶片萎蔫发黄，尤其是尖端部分而转基因植株叶片轻度萎蔫(图13)，说明转基因拟南芥叶片对人参锈病病原菌有一定的抗性作用。
[0202]
实施例16离体叶片抑菌实验及活性氧检测
[0203]
(1)取生长4周的野生型和转基因型拟南芥叶片，叶轴部位用蘸有灭菌水的纱布包裹用于叶片保湿，放于培养皿中(底部铺有已用灭菌水润湿的干净滤纸)同时放入培养皿中；
[0204]
(2)在叶脉部位滴加1μl孢子悬浮液，封口，置于黑暗的恒温培养箱中，恒温22℃，湿度为100％，24h后将其移入正常植物培养箱中，持续观察其染病的情况并拍照；
[0205]
(3)将孢子侵染前后的植物叶片，分别置于12孔板中，浸泡于1.5ml的dab显色液中，避光震荡100rpm，4h后换成脱色液乙醇:乙酸:丙三醇＝3:1:1，沸水浴5min，后放于乙醇:丙三醇＝4:1储存液中，拍照分析。
[0206]
结果：将侵染后的离体野生型拟南芥叶片和转基因拟南芥叶片分别进行dab染色，dab可与被过氧化物酶分解过氧化氢所产生的氧所氧化，形成有色多聚体沉淀，为黄色至棕色。如图14所示，野生型叶片呈现出深棕色，而转基因型叶片为浅黄色，转基因型拟南芥过氧化物积累较少，受伤害的程度较小，说明转入ltp基因的拟南芥对人参的锈病病原菌具有一定的抵抗能力。
[0207]
实施例17孢子抑菌实验
[0208]
(1)制备孢子悬浮液同上，调节其浓度为每毫升1.8
×
105个；
[0209]
(2)用蛋白提取液提取野生型和转基因型拟南芥总蛋白，12000rpm离心10min吸上清，过膜；
[0210]
(3)bradford蛋白定量试剂盒测其浓度并调节为相同浓度，0.22μm滤膜过滤，冰浴待用。
[0211]
(4)向微孔板中分别加入野生型和转基因型拟南芥总蛋白20μg和80μl孢子悬浮液，混匀后，用封口膜封住缝隙，于25℃100rpm摇床震荡培养24h，在40倍显微镜下观察孢子长势，bar＝100μm。
[0212]
结果：40倍显微镜下观察发现加野生型拟南芥总蛋白的孢子繁殖较多，而加阳性拟南芥总蛋白后孢子繁殖较慢(图15)，说明人参脂质转移蛋白能抑制锈病孢子萌发。
[0213]
实施例18转基因拟南芥的rt-pcr
[0214]
选择pr1 nm_127025.2、pr3 m38240.1、pr4 nm_111344.5、pr8 m34107.1、pr5 nm_106161.2基因，根据这些基因设计引物(表6)，进行rt-pcr扩增，分析转入的ltp基因对这些
基因的影响。
[0215]
表6抗病相关基因及其rt-pcr引物设计
[0216][0217]
统计分析
[0218]
利用spss 19.0软件进行数据处理，计量数据采用(x
±
s)表示，方差齐时利用单因素方差分析(one-way anova)差异显著性检验，用lsd法进行差异显著性比较。
[0219]
结果：利用qpcr技术分析转基因植株与野生型植株在菌胁迫前后病程相关基因的表达水平，菌胁迫后转基因拟南芥中ltp表达量明显高野生型，约为野生型拟南芥中ltp基因表达量的20倍，该结果与上述侵染植株表型观测相一致，说明ltp表达量的上调与菌侵胁迫密切相关。方差分析结果表明胁迫前后转基因植株中ltp基因表达量高于野生型拟南芥具有极显著性(p《0.01)，见图16。在本研究中菌胁迫前转基因植株的表达量与野生型植株相比pr1、pr3、pr4等prs基因的表达无明显差异。菌胁迫后pr1、pr3、pr4等prs基因的表达水平均明显升高，在转基因植株中的表达量极显著高于野生型(p《0.01)(图16)。菌胁迫后转基因拟南芥pr1、pr4、pr5表达量显著高于野生型，pr1、pr4、pr5具有抗真菌功能，说明ltp与prs基因在抑制病菌的作用上可能是协同作用，增强了拟南芥植株的抗病性。有研究发现pr1是系统获得性抗性的标志，说明ltp参与了植物系统获得性抗性的抗病反应。pr4是茉莉酸(ja)信号转导途径的标志基因，在菌胁迫后转基因拟南芥pr4表达量明显高于野生型拟南芥，说明ltp介导的抗病反应依赖于ja介导的信号转导途径。pr8是水杨酸(sa)信号转导途径的标志基因，在菌胁迫后转基因拟南芥pr8表达量明显高于野生型拟南芥，说明ltp介导的抗病反应依赖于sa介导的信号转导途径。通过以上结果我们可以推测出过表达ltp转基因植株对锈病病原菌的抗性可能是通过sa和ja共同依赖的信号转导途径来实现的。
[0220]
以上实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

技术特征：
1.一种人参抗病基因l1ltp的编码蛋白，其特征在于，氨基酸序列如seq id no:2所示。2.编码权利要求1所述的人参抗病基因l1ltp编码蛋白的人参抗病基因l1ltp。3.根据权利要求2所述的人参抗病基因l1ltp，其特征在于，所述人参抗病基因l1ltp核苷酸序列如seq id no:1所示。4.权利要求2或权利要求3所述的人参抗病基因l1ltp在提高植物抗病性方面的应用，其特征在于，通过过表达人参抗病基因l1ltp，提高植物对锈病的抗性；所述的植物为人参或拟南芥；所述的锈病为人参锈病。5.根据权利要求2或3所述的人参抗病基因l1ltp在培育抗病植物中的应用，其特征在于，通过过表达人参抗病基因l1ltp，提高植物对锈病的抗性；所述的植物为人参或拟南芥；所述的锈病为人参锈病。6.一种提高人参或拟南芥抗锈病的方法，其特征在于，在人参或拟南芥中过量表达核苷酸序列如seq id no:1所示l1ltp基因。7.一种培育抗锈病植物的方法，其特征在于，所述方法是编码人参转运蛋白的基因导入植物组织活细胞，得到抗锈病的植物，其中，所述人参转运蛋白的氨基酸序列如seq id no:2所示。8.根据权利要求7所述的培育抗锈病植物的方法，其特征在于，所述植物宿主为人参或拟南芥。

技术总结
本发明提供了一种人参抗病基因L1LTP及编码蛋白、其应用及提高植物抗锈病的方法。本发明从人参中分离得到一个人参抗病相关基因L1LTP，该基因全长363bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1；该基因编码的蛋白是一个全长由120个氨基酸组成的脂质转移蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明通过转录模式分析和植物表达分析发现，L1LTP基因可提高植物对锈病的抗性，因此，该人参抗病基因L1LTP可应用于提高植物抗锈病的性能。提高植物抗锈病的性能。提高植物抗锈病的性能。


技术研发人员：孙天霞 秦华聪 杨晓峰 段启栋 王云汉 卢佳宏
受保护的技术使用者：长春中医药大学
技术研发日：2023.06.21
技术公布日：2023/8/9