血清因子标志物在不同繁殖方式奶牛早期妊娠诊断中的应用

1.本发明涉及奶牛早期妊娠诊断技术领域，更具体的说是涉及血清因子标志物在不同繁殖方式奶牛早期妊娠诊断中的应用。


背景技术：

2.近年来，通过高产奶牛良种培育和快繁新型关键技术以推动奶牛种质资源创新和奶业健康发展大受重视。在胚胎移植(embryo transfer，et)实验中，胚胎与受体的同步与否是妊娠能否成功建立的关键。因此，在第0天以及et前一天对受体奶牛进行科学合理筛选，对提高受体牛妊娠水平，以及进一步加快建立良种奶牛核群体和提高牧场经济效益具有重要意义。目前，在畜牧业生产过程中仍是通过人工观察爬跨行为、情绪躁动、阴部黏液等表征来判定奶牛发情，缺乏一个能有效利用孕酮(progesterone，p4)检测来监测的系统性研究。
3.奶牛妊娠失败的主要因素包括胚胎死亡(0～42天)以及胎儿死亡(42～280天)，由胚胎死亡导致妊娠建立失败的居多(rabaglino et al.2020)。值得注意的是，其中配种后14～24d的母体妊娠识别期胚胎死亡损失最大。在过去的几十年中，出现了各种早期妊娠诊断方法，包括观察返情、直肠触诊，超声检查及血液中特异性抗原检测。其中前三者已成为目前我国牧场常见的临床诊断方法，通常是在奶牛配种后30-35天实施，此时奶牛已进入配种后第二个发情期。不同于前三种妊娠诊断方法，检测血液特异性抗原不用直接接触母畜，且不依赖于操作者的技术专长和实践经验，此外对体液样本还可以批量检测。这些血液检查主要包括检测血液(progesterone，p4)、妊娠相关糖蛋白(pregnancy-associated glycoprotein，pag)和早孕因子(early pregnancyfactor，epf)，然而单一的分析其中一个指标并不能准确判断母牛的妊娠状态(szenci 2021；wang et al.2020)。目前，关于孕酮、妊娠相关糖蛋白和早孕因子相关的免疫学诊断方法在应用于牧场奶牛早期妊娠诊断上有待进一步研究。
4.因此，提供一种奶牛早期妊娠诊断的有效方法是本领域技术人员亟需解决的问题。


技术实现要素：

5.鉴于此，本发明提供了血清因子p4(孕酮)、pag(妊娠相关糖蛋白)、epf(早孕因子)在不同繁殖方式奶牛早期妊娠诊断中的应用，具有灵敏度高准确性强的特点，能显著提高奶牛早期妊娠诊断的准确率。
6.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
7.一种血清因子标志物在不同繁殖方式奶牛早期妊娠诊断中的应用，所述血清因子标志物包括血清p4、血清pag和血清epf；所述不同繁殖方式包括ivf、scnt和ai。
8.本发明的另一目的是，提供上述奶牛早期妊娠诊断血清因子标志物在制备用于预测奶牛早期妊娠产品中的应用。
9.本发明的再一目的是，提供上述血清因子标志物水平分析辅助预测不同繁殖方式奶牛早期妊娠状态的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)血液标本的采集
10.采集胚胎移植牛21d、28d和人工授精牛28d的尾静脉血2ml于无抗凝剂的真空采血管内，室温静置；天数计算以奶牛经同期发情程度或出现爬跨行为的当天定义为0天；
11.(2)标本血清的收集
12.室温下静置1h，然后于4℃冰箱放置约5h，用离心机3500r/min离心5min，取上层血清置于1.5ml离心管内，在-20℃下保存至进一步分析；
13.(3)血清妊娠因子的检测
14.血清p4、pag和epf这三种因子的检测采用elisa试剂盒进行，每个样品孔用量为50μl，按照试剂盒说明书进行；
15.(4)统计分析
16.1)血清p4、pag和epf因子水平
17.使用酶标仪测定每孔的吸光度(od值)，将样品的od值代入标准曲线方程中计算样品的浓度；
18.2)根据血清p4、pag和epf水平进行奶牛早期妊娠诊断
19.对于ivf胚受体牛和scnt胚受体牛，发情后第21d奶牛血清中p4的水平或者发情后第28d奶牛血清中pag、epf的水平如果分别大于其相应的临界值即cut-off值时，判定为妊娠；同理，对于人工授精牛，发情后第28d奶牛血清中pag、epf的水平如果分别大于其相应的临界值即cut-off值时，判定为妊娠。
20.作为优选的技术方案，所述预测奶牛早期妊娠结局的标准包括：
21.(1)ivf胚受体牛第21天p4预测早期妊娠结局的临界值分别为7.93ng/ml；scnt胚受体牛第21天p4预测早期妊娠结局的临界值分别为5.27ng/ml；
22.(2)在ivf胚受体牛、scnt胚受体牛和ai牛中，第28天血清pag预测早期妊娠结局的临界值分别为5.68ng/ml、7.84ng/ml、8.96ng/ml；
23.(3)在ivf胚受体牛、scnt胚受体牛和ai牛中，第28天血清epf预测早期妊娠结局的临界值分别为33.18ng/ml、39.12ng/ml、16.74ng/ml。
24.作为优选的技术方案，所述预测奶牛早期妊娠结局的效能为：
25.a、ivf胚受体牛血清p4第21天曲线下面积为0.989，具有较高预测价值；
26.scnt胚受体牛血清p4第21天曲线下面积为0.993，具有较高预测价值；
27.b、ivf胚受体牛血清pag第28天曲线下面积为0.917，具有较高预测价值；
28.scnt胚受体牛血清pag第28天曲线下面积为0.824，具有较高预测价值；
29.ai牛血清pag第28天曲线下面积为0.844，具有较高预测价值；
30.c、ivf胚受体牛血清epf第28天曲线下面积为0.880，具有较高预测价值；
31.scnt胚受体牛血清epf第28天曲线下面积为0.746，具有较高预测价值；
32.ai牛血清epf第28天曲线下面积为0.807，具有较高预测价值。
33.经由上述的技术方案可知，本发明公开提供了血清因子p4、pag、epf在奶牛早期妊娠诊断中的应用，具有灵敏度高准确性强的特点，能显著提高奶牛早期妊娠诊断的准确率，缩短牛群空怀天数以及减少空怀导致的产犊、产奶、饲料以及人工等方面的经济损失。
附图说明
34.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
35.图1为本发明受体牛处理、超声检查和血样采集流程图；其中us是超声检查，et是胚胎移植，pd是妊娠诊断，bc是血液采集。
36.图2为本发明体外受精胚受体牛妊娠早期血清中孕酮含量(p4)结果；注：*p《0.05，**p《0.01表示妊娠牛(n＝15)与未妊娠牛(n＝12)有统计学差异。数据表示为平均值
±
标准误。
37.图3为本发明体细胞核移植胚受体牛妊娠早期血清中孕酮含量(p4)结果；*p《0.05，**p《0.01表示妊娠牛(n＝18)与未妊娠牛(n＝24)有统计学差异。数据表示为平均值
±
标准误。
38.图4为本发明血清孕酮(p4)预测体外受精胚受体牛妊娠结局的roc曲线图。
39.图5为本发明血清孕酮(p4)预测体细胞核移植胚受体牛妊娠结局的roc曲线图。
40.图6为本发明不同繁殖方式奶牛第28天血清中妊娠相关糖蛋白(pag)含量；其中ivf：妊娠12头，未妊娠16头；scnt：妊娠19头，未妊娠17头；ai：妊娠29头，未妊娠25头；*p《0.05，**p《0.01表示妊娠牛与未妊娠牛有统计学差异；数据表示为平均值
±
标准误。
41.图7为本发明血清妊娠相关糖蛋白(pag)预测不同繁殖方式奶牛妊娠结局的roc曲线图。
42.图8为本发明不同繁殖方式奶牛第28天血清中早孕因子(epf)含量；其中ivf：妊娠12头，未妊娠16头；scnt：妊娠19头，未妊娠17头；ai：妊娠29头，未妊娠25头；*p《0.05，**p《0.01表示妊娠牛与未妊娠牛有统计学差异；数据表示为平均值
±
标准误。
43.图9为本发明血清早孕因子(epf)预测不同繁殖方式奶牛妊娠结局的roc曲线图。
具体实施方式
44.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
45.本发明实施例公开了血清因子p4、pag、epf在不同繁殖方式奶牛早期妊娠诊断中的应用，本发明所用试剂均为市售可得，对其来源不做具体限定，所涉及的方法，如无特殊提及，均为常规方法，在此不再一一赘述。
46.需要说明的是，本发明以奶牛经同期发情程序或出现爬跨行为等发情表征的当天定义为0天。
47.实施例1
48.1.试验对象：受试奶牛选自宁夏回族自治区灵武市塞上牧源牧场，包括133头胚胎移植牛(55头体外受精胚受体牛+78头体细胞核移植胚受体牛)和54头人工授精牛。
49.受体奶牛纳入标准：选择牧场中的未配后备牛群或空怀经产牛群，受体奶牛应满
足下列基本要求：
①
体格发育正常，体况良好，临床检查健康；
②
遗传背景调查显示繁殖性能优良；
③
排除遗传疾病与传染病(如布鲁氏菌病、bvdv和ibr等)；
④
在胚胎移植前至少1个月完成免疫和驱虫工作；
⑤
尽量保证牛只温顺，应激反应小。
50.其中，未配后备牛还应满足下列要求：
①
月龄＞13.5月，体重＞375kg，体高＞130cm；
②
发育健康良好，生殖道和盆骨大小形状正常；
③
无长期用药和置入埋置物史。
51.2.试验分组：p4组包括27头体外受精胚受体牛和42头体细胞核移植胚受体牛；
52.pag/epf组包括28头体外受精胚受体牛、36头体细胞核移植胚受体牛和54头人工授精牛。
53.3.试验方法(流程图参见附图1)：
54.(1)血清因子水平分析
55.p4组分别采集胚胎移植牛第0、5、12、21天尾静脉血于无抗凝剂真空采血管中，标注牛号和采血日期，将收集到的血液运输至实验室，室温下静置1h，然后于4℃冰箱放置约5h，后用离心机3500r/min离心5min，取上层血清置于1.5ml离心管内，在-20℃下保存，待进一步p4分析。
56.pag/epf组采集第28天尾静脉血于无抗凝剂真空采血管中，标注牛号和采血日期，将收集到的血液运输至实验室，室温下静置1h，然后于4℃冰箱放置约5h，后用离心机3500r/min离心5min，取上层血清置于1.5ml离心管内，在-20℃下保存，待进一步pag/epf分析。
57.血清p4分析方法：
58.采用孕酮(p)测定试剂盒(酶联免疫法)(北京北方生物技术研究所有限公司)
59.准备样品：将待测血清从-20℃冰箱取出，在室温下放置30min左右，待完全融化后，漩涡震荡使其充分混匀。血清样品避免反复冻融。
60.平衡：在加样之前，将检测试剂在室温下至少平衡30min，并使用漩涡震荡器混匀。
61.配液：取20倍浓缩洗涤液，根据当批检测样品量，用蒸馏水按1：20稀释，混匀后备用。
62.加样：在96孔板上分别设置标准、试样和空白(对照)孔，记录它们的位置。每个标准品依次各设两孔，每孔加入相应的标准品50l；空白孔不加任何液体；其余各孔加入待测血清50l。样品应添加到反应孔的底部，避免接触内壁和产生气泡。
63.加酶：除空白对照孔外，每孔加入酶标抗原50l。
64.加抗体：按照上一步同样的顺序，向每孔加入50l抗体。轻轻拍打板侧，确保溶液充分混匀。
65.温育：贴上一层封板膜，防止溶液蒸发。置37℃恒温培养箱温育1h。
66.洗板：弃去孔内液体，用注射器或排枪吸取配制好的洗涤液注满各孔，静置10s左右甩干，重复该过程三次，通过填充每个井进行清洗。最后一次洗涤后，将孔板翻过来，在干净的厚吸水纸上拍干。
67.显色：在每孔中添加50l显色剂a液，然后按相同的顺序添加50l显色剂b液。充分混匀后，贴上一层新的封板膜进行密封，在37℃恒温培养箱中温育15min。
68.终止：每孔中加50l终止液，终止反应。
69.测定：使用酶标仪在450nm下测定每孔的吸光度(od值)。测定应在加终止液后
15min内进行。
70.血清pag分析方法：
71.采用牛妊娠相关糖蛋白(pag)试剂盒(elisa)(上海酶联生物科技有限公司)
72.准备样品：将血清样品从-20℃冰箱取出，在室温下静置，待完全融化后，使用漩涡震荡器使其充分混匀。
73.平衡：将检测试剂在室温下静置，使其在使用时达到室温20～25℃，并漩涡震荡使试剂充分混匀。
74.配液：将20倍洗涤缓冲液稀释，用蒸馏水按1：20稀释，即一份20
×
洗涤缓冲液加19份蒸馏水，混匀后备用。
75.加样：在96孔板(预先包被牛pag捕获抗体)上分别设置标准、试样和空白(对照)孔，记录它们的位置。每个标准品依次各设两孔，加入不同浓度的标准品50l；空白孔不加；其余各孔加入待测血清50l。样品应添加到反应孔的底部，避免接触内壁和产生气泡。
76.加酶：除空白对照孔外，标准孔和试样孔中每孔加入过氧化物酶标记的抗体100l。
77.温育：用封板膜封住反应孔，防止溶液蒸发。置37℃恒温培养箱温育60min。
78.洗板：弃去孔内液体，用注射器或排枪吸取配制好的洗涤液注满各孔(350l)，静置1min后，甩去洗涤液，在吸水纸上拍干，重复该过程5次。
79.显色：每孔加入显色剂a液50l，然后按相同的顺序添加显色剂b液50l。充分混匀后。贴上一层封板膜封，在37℃恒温培养箱中孵育15min。
80.终止：每孔添加50l终止液，终止反应。
81.测定：使用酶标仪在450nm波长处测定每孔的吸光度(od值)。测定应在加终止液后15min内进行。
82.血清epf分析方法：
83.采用牛早孕因子蛋白(epf)试剂盒(elisa)(上海酶联生物科技有限公司)，检测步骤参照血清pag分析方法。
84.(2)子宫胎检与诊断
85.第32天(相当于胚胎移植后的第26d)由孕检专业人员应用便携式兽用b超经直肠进行子宫胎检，若检查出子宫内膜增厚，并且有大小不一的黑色区域，即胚胎的图像，则受体牛受胎怀孕；若子宫角无扩张，没有胚胎的图像及其他特征，即受体牛未受胎怀孕。根据诊断结果将母牛分为妊娠组和未妊娠组。
86.(3)构建奶牛早期妊娠预测模型
87.应用excel对步骤(1)所得受体牛血清p4、pag、epf检测结果和步骤(2)子宫胎检结果进行统计。使用graphpad prism 6进行数据分析。妊娠组和未妊娠组的p4浓度、pag浓度和epf浓度应用单因素anova和独立样本t检验来识别差异。结果均表示为平均数
±
标准误(mean
±
sem)。当p＜0.05或p＜0.01时，认为差异有统计学意义。
88.为了检验血清因子p4浓度在第0、5、12、21天和血清因子pag、epf在第28天判断第32天妊娠结局的能力，进行受试者工作特征roc曲线分析，对奶牛血清p4水平在早期妊娠结局预测的性能进行评价，以真阳性率(sensitivity)为纵坐标，假阳性率(1-specificity)为横坐标绘制roc曲线，并通过约登指数确定了各时间点的最佳cut-off值，其中以第32天经超声学诊断为妊娠的奶牛为真阳性，计算敏感度、特异度与准确度。
89.使用sas 9.4软件，通过精密logistic回归分析评估各时间点cut-off值预测妊娠结局的可靠性。以cut-off值为分界将每组牛分成两组(≤cut-off值和＞cut-off值)纳入自变量x，第32天经b超诊断的妊娠结局为因变量y，妊娠＝1，未妊娠＝0，进行回归分析。计算相应的or(odds ratios)值、95％置信区间和p值。p＜0.05时，表示差异显著；0.05＜p＜0.1时，表示有不同趋势。
90.实施例2
91.1.p4组
92.(1)p4表达水平分析
93.p4组包括27头体外受精胚受体牛(ivf)和42头体细胞核移植胚受体牛(scnt)。
94.其中，ivf胚受体牛在妊娠早期妊娠组和未妊娠组p4的表达水平，结果如附图2所示，可以发现妊娠组牛p4浓度随时间呈逐渐上升的变化趋势，而未妊娠组牛孕酮浓度呈先上升后下降的变化趋势。妊娠组牛平均p4浓度在第5、12和21天高于未妊娠组，在第0天低于未妊娠组。经单因素anova检验发现第21天p4水平在妊娠组高于未妊娠组(p＜0.01)，有统计学意义。
95.scnt胚受体牛在妊娠早期妊娠组和未妊娠组p4的表达水平，结果如附图3所示，妊娠组牛p4浓度随时间逐渐上升，未妊娠组牛p4浓度随时间先上升后下降，在第12天浓度达到峰值。妊娠组平均p4浓度在第5、12和21天高于未妊娠组，在第0天低于未妊娠组。经单因素anova检验妊娠组p4水平在21天显著高于未妊娠组(p＜0.01)，有统计学意义。
96.(2)应用roc曲线评估血清p4预测妊娠结局的效能
97.对血清p4水平在早期妊娠结局预测的性能进行评价，以真阳性率(sensitivity)为纵坐标，假阳性率(1-specificity)为横坐标绘制0、5、12和21天p4水平的roc曲线。约登指数最大时所对应的p4分界点为cut-off值。
98.ivf胚受体牛p4水平预测早期妊娠解决的roc曲线，如附图4和表1所示，第0天p4水平在预测妊娠中cut-off值是1.33ng/ml，auc为0.700(p＝0.079)，灵敏度：87％，特异度：58％，准确度：74％；第5天p4水平在预测妊娠中cut-off值是4.06ng/ml，auc为0.589(p＝0.435)，灵敏度：80％，特异度：50％，准确度：67％；第12天p4水平在预测妊娠中cut-off值是10.77ng/ml，auc为0.706(p＝0.071)，灵敏度：67％，特异度：83％，准确度：74％；第21天p4水平在预测妊娠中cut-off值是7.93ng/ml，auc为0.989(p《0.001)，灵敏度：93％，特异度：100％，准确度：96％。可知，体外受精奶牛血清p4第21天曲线下面积(auc)为0.989，具有较高预测价值；第0天曲线下面积(auc)为0.700，第12天曲线下面积(auc)为0.706，具有一般预测价值；第5天曲线下面积(auc)为0.589，具有较低预测价值。
99.scnt胚受体牛p4水平预测早期妊娠解决的roc曲线，如附图5和表1所示，第0天p4水平在预测妊娠中cut-off值是0.63ng/ml，auc为0.625(p＝0.170)，灵敏度：67％，特异度：67％，准确度：67％；第5天p4水平在预测妊娠中cut-off值是1.95ng/ml，auc为0.660(p＝0.080)，灵敏度：89％，特异度：46％，准确度：64％；第12天p4水平在预测妊娠中cut-off值是7.93ng/ml，auc为0.678(p＝0.050)，灵敏度：83％，特异度：58％，准确度：69％；第21天p4水平在预测妊娠中cut-off值是5.27ng/ml，auc为0.993(p《0.001)，灵敏度：100％，特异度：92％，准确度：95％。可知，体细胞核移植奶牛血清p4第21天曲线下面积为0.993，具有较高预测价值；第0天曲线下面积为0.625，第5天曲线下面积为0.660，第12天曲线下面积为
0.678，具有一般预测价值。
100.p4预测早期妊娠结局的roc曲线分析如表1所示。
101.表1
[0102][0103]
2.pag组
[0104]
(1)pag表达水平分析
[0105]
pag组包括28头体外受精胚受体牛(ivf)、36头体细胞核移植胚受体牛(scnt)和54头人工授精牛(ai)。
[0106]
针对不同繁殖方式的奶牛，分析第28天血清pag水平与妊娠结局的关系，结果如附图6所示，在三组牛中，妊娠奶牛第28天血清中的pag含量均高于未妊娠奶牛，经单因素anova检验差异均有显著性(ivf：p＜0.01，scnt：p＜0.01，ai：p＜0.01)。
[0107]
(2)应用roc曲线评估血清pag预测妊娠结局的效能
[0108]
绘制ivf胚受体牛、scnt胚受体牛以及ai牛第28天pag水平预测第32天早其妊娠结局的roc曲线如附图7和表2所示，三条roc曲线的auc分别为0.917、0.824、0.844，其cut-off值分别为5.68ng/ml、7.84ng/ml、8.96ng/ml，灵敏度分别为100％、89％、79％，特异度分别为75％、65％、80％，准确度分别为86％、78％、80％。可知，体外受精胚受体牛血清pag第28天曲线下面积为0.917，具有较高预测价值；体细胞核移植胚受体牛血清pag第28天曲线下面积为0.824，具有较高预测价值；人工授精奶牛血清pag第28天曲线下面积为0.844，具有较高预测价值。
[0109]
表2
[0110][0111]
3.epf组
[0112]
(1)epf表达水平分析
[0113]
epf组包括28头体外受精胚受体牛(ivf)、36头体细胞核移植胚受体牛(scnt)和54头人工授精牛(ai)。
[0114]
针对不同繁殖方式的奶牛，分析第28天血清epf水平与妊娠结局的关系，结果如附
图8所示，在三组牛中，奶牛第28天血清中的epf含量在妊娠奶牛中要高于未妊娠奶牛，经单因素anova检验差异均有显著性(ivf：p＜0.01，scnt：p＜0.01，ai：p＜0.01)。
[0115]
(2)应用roc曲线评估血清epf预测妊娠结局的效能
[0116]
绘制ivf胚受体牛、scnt胚受体牛和ai牛第28天epf水平预测早期妊娠结局的roc曲线如附图9和表3所示，在ivf胚受体牛中，第28天epf水平在预测妊娠中cut-off值是33.18ng/ml，auc为0.880(p＜0.001)，灵敏度：67％，特异度：100％，准确度：86％；在scnt胚受体牛中，第28天epf水平在预测妊娠中cut-off值是39.12ng/ml，auc为0.746(p＝0.012)，灵敏度：47％，特异度：100％，准确度：72％；在ai牛中，第28天epf水平在预测妊娠中cut-off值是16.74ng/ml，auc为0.807(p＜0.001)，灵敏度：93％，特异度：56％，准确度：76％。可知，体外受精胚受体牛血清epf第28天曲线下面积为0.880，具有较高预测价值；体细胞核移植胚受体牛血清epf第28天曲线下面积为0.746，具有较高预测价值；人工授精奶牛血清epf第28天曲线下面积为0.807，具有较高预测价值。
[0117]
表3
[0118][0119]
实施例3
[0120]
根据不同繁殖方式奶牛妊娠组和未妊娠组的比较，利用精密logistic回归分析p4、pag、epf相应的cut-off值预测奶牛第32天妊娠结局的价值。以cut-off值为分界将每组牛分成两组(≤cut-off值和＞cut-off值)纳入自变量x，第32天经b超诊断的妊娠结局为因变量y，妊娠＝1，未妊娠＝0。经回归分析(表4)，p4、pag、epf在不同育种方式奶牛中的cut-off值水平与早期妊娠结局密切相关。经分析发现，在发情周期第21天，血清p4浓度高于7.93ng/ml的ivf胚受体牛，在第32天被诊断为妊娠的可能性是低于7.93ng/ml的105倍(p＜0.001)；p4浓度高于5.27ng/ml的scnt胚受体牛，在第32天被诊断为妊娠的可能性是低于5.27ng/ml的171倍(p＜0.001)。
[0121]
在奶牛妊娠的第28天，血清pag浓度高于5.68ng/ml的ivf胚受体牛，在第32天被诊断为妊娠的可能性是低于5.68ng/ml的38倍(p＜0.001)；pag浓度高于7.84ng/ml的scnt胚受体牛，在第32天被诊断为妊娠的可能性是低于7.84ng/ml的14倍(p＝0.002)；pag浓度高于8.96ng/ml的ai牛，在第32天被诊断为妊娠的可能性是低于8.96ng/ml的14倍(p＜0.001)；血清epf浓度高于33.18ng/ml的ivf胚受体牛，在第32天被诊断为妊娠的可能性是低于33.18ng/ml的33倍(p＜0.001)；epf浓度高于39.12ng/ml的scnt胚受体牛，在第32天被诊断为妊娠的可能性是低于39.12ng/ml的19倍(p＝0.002)；epf浓度高于16.74ng/ml的ai牛，在第32天被诊断为妊娠的可能性是低于16.74ng/ml的16倍(p＜0.001)。
[0122]
表4
[0123][0124]
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
[0125]
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

技术特征：
1.一种血清因子标志物在不同繁殖方式奶牛早期妊娠诊断中的应用，其特征在于：所述血清因子标志物包括血清p4、血清pag和血清epf；所述不同繁殖方式包括ivf、scnt和ai。2.权利要求1所述奶牛早期妊娠诊断血清因子标志物在制备用于预测奶牛早期妊娠产品中的应用。3.一种基于权利要求1所述血清因子标志物水平分析辅助预测不同繁殖方式奶牛早期妊娠状态的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)血液标本的采集采集胚胎移植牛第21d、28d和人工授精牛28d的尾静脉血2ml于无抗凝剂的真空采血管内，室温静置；天数计算以奶牛经同期发情程度或出现爬跨行为的当天定义为0天；(2)标本血清的收集室温下静置1h，然后于4℃冰箱放置约5h，用离心机3500r/min离心5min，取上层血清置于1.5ml离心管内，在-20℃下保存至进一步分析；(3)血清妊娠因子的检测血清p4、pag和epf这三种因子的检测采用elisa试剂盒进行，每个样品孔用量为50μl，按照试剂盒说明书进行；(4)统计分析1)血清p4、pag和epf因子水平使用酶标仪测定每孔的吸光度(od值)，将样品的od值代入标准曲线方程中计算样品的浓度；2)根据血清p4、pag和epf水平进行奶牛早期妊娠诊断对于ivf胚受体牛和scnt胚受体牛，发情后第21d奶牛血清中p4的水平或者发情后第28d奶牛血清中pag、epf的水平如果分别大于其相应的临界值即cut-off值时，判定为妊娠；同理，对于人工授精牛，发情后第28d奶牛血清中pag、epf的水平如果分别大于其相应的临界值即cut-off值时，判定为妊娠。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述预测奶牛早期妊娠结局的标准包括：(1)ivf胚受体牛第21天p4预测早期妊娠结局的临界值为7.93ng/ml；scnt胚受体牛第21天p4预测早期妊娠结局的临界值为5.27ng/ml；(2)在ivf胚受体牛、scnt胚受体牛和ai牛中，第28天血清pag预测早期妊娠结局的临界值分别为5.68ng/ml、7.84ng/ml、8.96ng/ml；(3)在ivf胚受体牛、scnt胚受体牛和ai牛中，第28天血清epf预测早期妊娠结局的临界值分别为33.18ng/ml、39.12ng/ml、16.74ng/ml。5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述预测奶牛早期妊娠结局的效能为：a、ivf胚受体牛血清p4第21天曲线下面积为0.989，具有较高预测价值；scnt胚受体牛血清p4第21天曲线下面积为0.993，具有较高预测价值；b、ivf胚受体牛血清pag第28天曲线下面积为0.917，具有较高预测价值；scnt胚受体牛血清pag第28天曲线下面积为0.824，具有较高预测价值；ai牛血清pag第28天曲线下面积为0.844，具有较高预测价值；c、ivf胚受体牛血清epf第28天曲线下面积为0.880，具有较高预测价值；scnt胚受体牛血清epf第28天曲线下面积为0.746，具有较高预测价值；
ai牛血清epf第28天曲线下面积为0.807，具有较高预测价值。

技术总结
本发明公开了一种血清因子标志物水平分析辅助预测不同繁殖方式奶牛早期妊娠状态的方法，通过检测血清因子(P4、PAG、EPF)水平来对不同繁殖方式奶牛进行妊娠诊断，涉及奶牛早期妊娠诊断技术领域，具体方法为检测胚胎移植牛第21d血清P4水平以及胚胎移植牛和人工授精牛第28d的血清PAG、EPF水平(天数计算以奶牛经同期发情程序或出现爬跨行为的当天定义为0天)，并与这三种因子在相应天数的cut-off值进行比对，以排查空怀牛和妊娠牛。本发明方法具有灵敏度高准确性强的特点，能显著提高奶牛早期妊娠诊断的准确率，缩短牛群空怀天数以及减少空怀导致的产犊、产奶、饲料以及人工等方面的经济损失。济损失。济损失。


技术研发人员：汤克琼 张云 靳亚平 杨武才 陶启兵 柳茗茗 王疌
受保护的技术使用者：西北农林科技大学
技术研发日：2023.06.21
技术公布日：2023/8/9