一种发酵乳杆菌在制备无添加发酵乳中的应用的制作方法

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种发酵乳杆菌在制备无添加发酵乳中的应用。


背景技术：

2.现有的发酵技术中，发酵乳一般是通过利用嗜热链球菌等乳酸菌来完成牛乳的发酵。
3.目前大多数传统的发酵用乳酸菌，如保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌等，都无法耐受高酸、高渗压的胃肠液，其结果是大部分在通过人体消化道时被杀灭，只有少量菌株进入肠道，因而，对其发挥等益生功能形成了极大的障碍。
4.与上述传统的乳酸菌发酵菌株相比，发酵乳杆菌对人体消化液的耐受性能更具优势，其可在高盐、低ph环境下稳定存活，是肠道菌群重要的组成部分。更重要的是，发酵乳杆菌具有抗菌、胆固醇降解、调节免疫等多重有益人体的功能。然而，发酵乳杆菌在牛乳中几乎不生长增殖。
5.综上所述，筛选一株发酵乳杆菌，并将其作为辅助发酵剂应用于无添加发酵乳的制备工艺中是本领域技术人员亟待解决的问题。


技术实现要素：

6.基于上述技术问题，本发明提供了一种发酵乳杆菌在制备无添加发酵乳中的应用。
7.无添加是指未添加稳定剂、增稠剂等食品添加剂。
8.具体的，提供了一种发酵乳杆菌在制备无添加发酵乳中的应用，所述发酵乳杆菌为分类命名为发酵乳杆菌(lactobacillus fermentum)，保藏编号为cgmcc no.17321的发酵乳杆菌；所述应用的步骤是将发酵乳杆菌和嗜热链球菌接种于脱脂乳中进行发酵，即得。通过这种方法得到的无添加发酵乳无乳清析出，保藏期内质地和益生菌数量稳定。
9.进一步地，上述步骤中，发酵乳杆菌cgmcc no.17321的接种量为5x105～5x10
7 cfu/ml，嗜热链球菌的接种量为2.5x106～2.5x107cfu/ml。
10.进一步地，上述步骤中，脱脂乳包括脱脂乳粉、蔗糖和水，脱脂乳粉的占比为质量百分比8～12％，蔗糖的占比为质量百分比1～7％。
11.进一步地，上述步骤中，发酵的温度为30℃～。4 4
12.进一步地，上述步骤中，培养的方式为厌氧培养。
13.进一步地，上述步骤中，发酵的时间为5～15h。
14.上述发酵乳杆菌的应用，首次将发酵乳杆菌cgmcc no.17321作为辅助发酵剂，与嗜热链球菌进行共发酵来制备发酵乳，披露了发酵乳杆菌cgmccno.17321在改善发酵乳乳清析出、保藏期内发酵乳质地方面的功能及其在保藏期内优良的存活性能。本发明的应用可获得质地稳定的发酵乳，打破了无添加发酵乳生产工艺上重要的技术壁垒。
附图说明
15.图1为保藏期内不同实施例制备的无添加发酵乳中发酵乳杆菌活菌变化。
16.图2为保藏期内不同实施例制备的无添加发酵乳和对照组发酵乳的粘度变化。
具体实施方式
17.为更清楚的对本发明技术方案予以阐述，下面将结合具体实施方式对本发明的技术方案进行进一步阐述：
18.本技术提供了一种发酵乳杆菌在制备无添加发酵乳中的应用，该菌株的分类命名为发酵乳杆菌lactobacillus fermentum，保藏编号为cgmcc no.17321。该菌种于2019年3月8日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101。
19.在一个具体的实施方式中，提供了一种发酵乳杆菌在制备无添加发酵乳中的应用，包括以下步骤：将发酵乳杆菌和嗜热链球菌接种于脱脂乳中进行发酵，即得。
20.上述发酵乳杆菌的应用，首次将发酵乳杆菌cgmcc no.17321作为辅助发酵剂，与嗜热链球菌进行共发酵来制备发酵乳，披露了发酵乳杆菌cgmccno.17321在改善发酵乳乳清析出、保藏期内发酵乳质地方面的功能及其在保藏期内优良的存活性能。本发明的应用可获得质地稳定的发酵乳，打破了无添加发酵乳生产工艺上重要的技术壁垒。
21.优选的发酵乳杆菌cgmcc no.17321的接种量为5x105～5x107cfu/ml；较佳地为1x106～1x10
7 cfu/ml，更佳地为5x10
6 cfu/ml。
22.优选的嗜热链球菌的接种量为2.5x106～2.5x10
7 cfu/ml；较佳地为5x106～1.5x10
7 cfu/ml，更佳地为1x10
7 cfu/ml。
23.优选的脱脂乳为人工配制的，配制的脱脂乳包括脱脂乳粉、蔗糖和水，脱脂乳粉的占比为质量百分比8～12％，蔗糖的占比为质量百分比1～7％。制备方法可以包括以下步骤：在蒸馏水中加入脱脂乳粉、蔗糖，混匀充分溶解后，95～125℃灭菌5～20分钟，冷却即得。
24.优选的发酵温度为30℃～44℃；较佳地为34℃～41℃；更佳地为37℃。
25.优选的发酵时间为5～15h；较佳地为8～12h；更佳地为10h。
26.优选的发酵方式为厌氧培养。
27.结合实施例和对比例1亦可知，在优选发酵参数的范围之外时，所制备的无添加发酵乳的粘度显著下降。而在优选范围之内，嗜热链球菌接种量、脱脂乳浓度、发酵温度和时间相互影响，使得嗜热链球菌正常代谢生成可被发酵乳杆菌cgmcc no.17321利用的次级代谢产物，从而使后者发挥增稠增粘的效果。例如，在嗜热链球菌接种量过少或发酵时间过短或脱脂乳浓度过低时，发酵体系中积累的发酵乳杆菌可利用物质较少，使发酵乳杆菌只能少量或完全无法正常代谢，从而影响最终的体系增粘效果。又例如，当发酵温度低于优选范围值时，嗜热链球菌酶系处于低水平运作，也会导致体系中促进发酵乳杆菌增殖代谢产粘物质的积累不足，最终影响后者对发酵质地的改善效果。
28.下面通过实施例进一步说明上述具体实施方式，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。实施例中所使用的试剂若未加说明，均为分析纯试剂，购买自国药集
团。其他试验仪器、试剂、菌种，如未做特别说明，均可通过商业途径直接购得。
29.实施例1发酵乳杆菌在制备无添加发酵乳中的应用
30.1、材料与方法
31.(a)种子(发酵菌种)的制备：
32.发酵乳杆菌cgmcc no.17321：将发酵乳杆菌cgmcc no.17321的冻干粉用少量无菌蒸馏水溶解，用接种环取一环划线于mrs固体培养基(购买自merck co.，美国)，37℃厌氧培养24h取出，用接种环挑取单菌落放入10ml mrs液体培养基(购买自merck co.，美国)，运用涡旋振荡器将菌落均匀分散于液体培养基内，37℃厌氧培养24h取出，以2％(v/v)接种量接种于mrs液体培养基(购买自merck co.，美国)，37℃厌氧培养24h后，培养物15,000rpm离心10分钟，弃去上清，菌体用无菌蒸馏水洗涤2次后，用原培养体积的无菌蒸馏水悬浮，得到发酵用的种子，种子液的菌浓度为1x109cfu/ml。
33.嗜热链球菌ta 490(由丹尼斯克公司提供)：将嗜热链球菌ta 490的冻干粉用少量无菌蒸馏水溶解，用接种环取一环划线于m17固体培养基(购买自merck co.，美国)，37℃厌氧培养24h取出，用接种环挑取单菌落放入10ml m17液体培养基(购买自merck co.，美国)，运用涡旋振荡器将菌落均匀分散于液体培养基内，37℃厌氧培养24h取出，以2％(v/v)接种量接种于m17液体培养基(购买自merck co.，美国)，37℃厌氧培养24h后，培养物15,000rpm离心10分钟，弃去上清，菌体用无菌蒸馏水洗涤2次后，用原培养体积的无菌蒸馏水悬浮，得到发酵用的种子，种子液的菌浓度为5x108cfu/ml。
34.(b)脱脂乳的制备：将质量百分比为10％的脱脂乳粉，质量百分比为4％的蔗糖与蒸馏水混匀，充分溶解后，在125℃下灭菌5min，冷却至室温，即得所需脱脂乳。
35.2、无添加发酵乳的制备
36.将发酵乳杆菌cgmcc no.17321和嗜热链球菌ta 490分别以接种量0.5％和2％(v/v，种子液占发酵液的体积百分比，下同)无菌接种于含蔗糖4％(w/w，质量百分比，下同)、脱脂乳粉10％(w/w)的脱脂乳中，37℃厌氧培养10h得无添加发酵乳a。
37.实施例2发酵乳杆菌在制备无添加发酵乳中的应用
38.1、材料与方法
39.(a)种子(发酵菌种)的制备：同实施例1。
40.(b)脱脂乳的制备：将质量百分比为12％的脱脂乳粉，质量百分比为1％的蔗糖与蒸馏水混匀，充分溶解后，在95℃下灭菌20min，冷却至室温，即得脱脂乳。
41.2、无添加发酵乳的制备
42.将发酵乳杆菌cgmcc no.17321和嗜热链球菌ta 490分别以接种量0.05％和5％(v/v)无菌接种于含蔗糖1％(w/w)、脱脂乳粉12％(w/w)的脱脂乳中，30℃厌氧培养15h得无添加发酵乳b。
43.实施例3发酵乳杆菌在制备无添加发酵乳中的应用
44.1、材料与方法
45.(a)种子(发酵菌种)的制备：同实施例1。
46.(b)脱脂乳的制备：将质量百分比为8％的脱脂乳粉，质量百分比为7％的蔗糖与蒸馏水混匀，充分溶解后，在100℃下灭菌15min，冷却至室温，即得脱脂乳。
47.2、无添加发酵乳的制备
48.将发酵乳杆菌cgmcc no.17321和嗜热链球菌ta 490分别以接种量5％和0.5％(v/v)无菌接种于含蔗糖7％(w/w)、脱脂乳粉8％(w/w)的脱脂乳中，44℃厌氧培养5h得无添加发酵乳c。
49.实施例4发酵乳杆菌在制备无添加发酵乳中的应用
50.1、材料与方法
51.(a)种子(发酵菌种)的制备：同实施例1。
52.(b)脱脂乳的制备：将质量百分比为11％的脱脂乳粉、质量百分比为3％的蔗糖与蒸馏水混匀，充分溶解后，在120℃下灭菌10min，冷却至室温，即得脱脂乳。
53.2、无添加发酵乳的制备
54.将发酵乳杆菌cgmcc no.17321和嗜热链球菌ta 490分别以接种量1％和1％(v/v)无菌接种于含蔗糖3％(w/w)、脱脂乳粉11％(w/w)的脱脂乳中，41℃厌氧培养12h得无添加发酵乳d。
55.实施例5发酵乳杆菌在制备无添加发酵乳中的应用
56.1、材料与方法
57.(a)种子(发酵菌种)的制备：同实施例1。
58.(b)脱脂乳的制备：将质量百分比为9％的脱脂乳粉、质量百分比为5％的蔗糖与蒸馏水混匀，充分溶解后，在115℃下灭菌12min，冷却至室温，即得脱脂乳。
59.2、无添加发酵乳的制备
60.将发酵乳杆菌cgmcc no.17321和嗜热链球菌ta490分别以接种量0.1％和3％(v/v)无菌接种于含蔗糖5％(w/w)、脱脂乳粉9％(w/w)的脱脂乳中，34℃厌氧培养8h得无添加发酵乳e。
61.效果实施例1无添加发酵乳粘度、乳清与活菌测定
62.以实施例1为参照，不添加发酵乳杆菌cgmcc no.17321，制备得到仅由嗜热链球菌单菌发酵而来的对照组发酵乳x。
63.对上述实施例1-5所制备的无添加发酵乳a、b、c、d、e和对照组发酵乳x进行粘度、乳清析出与活菌测定，结果如表1所示。
64.表1无添加发酵乳的粘度、发酵乳酸菌活菌和乳清析出测定
[0065][0066]
如表所示，通过本发明技术方案中的方法所制得的无添加发酵乳a、b、c、d和e无乳清析出，而未添加发酵乳杆菌cgmcc no.17321的对照组发酵乳x有明显的乳清析出现象。与发酵前相比，所有无添加发酵乳中发酵乳杆菌cgmcc no.17321的活菌数都得到了一定程度的增长。在粘度方面，添加了发酵乳杆菌cgmcc no.17321的无添加发酵乳的粘度均显著高于对照组。
[0067]
结论：采用发酵乳杆菌cgmcc no.17321与嗜热链球菌共发酵所制备的无添加发酵
乳无乳清析出，粘度更高，质地更稳定。
[0068]
效果实施例2无添加发酵乳保藏过程中粘度与活菌测定
[0069]
对上述实施例1-5所制备的无添加发酵乳a、b、c、d、e和对照组发酵乳x进行4℃低温保藏，每隔2周取样测定一次发酵乳杆菌活菌和粘度，共保藏4周，结果如图1和图2所示。
[0070]
如图1所示，保藏期内不同实施例制备的无添加发酵乳中发酵乳杆菌活菌数量稳定。图2显示了保藏期内不同实施例制备的无添加发酵乳和对照组发酵乳的粘度变化，其直观地表明未添加发酵乳杆菌cgmcc no.17321的对照组发酵乳x的粘度随着保藏时间的延长而不断下降，其质地发生严重恶化，而添加了发酵乳杆菌cgmcc no.17321制备的所有无添加发酵乳在保藏期内粘度均无明显变化，其保藏前后的粘度维持在同一水平。
[0071]
结论：采用发酵乳杆菌cgmcc no.17321与嗜热链球菌共发酵所制备的无添加发酵乳在低温保藏期内，发酵乳杆菌数量稳定，并且，与对照组发酵乳相比，粘度维持效果更佳，质地的稳定性更优。
[0072]
对比例1
[0073]
将实施例1中的嗜热链球菌接种量、脱脂乳浓度，发酵温度以及发酵时间逐一进行调整，获得了以下一组不同方法制备的无添加发酵乳，各组无添加发酵乳的粘度如表2所示。
[0074]
表2不同方法制备所得无添加发酵乳的粘度测定
[0075][0076]
从表2所示的结果中可以得出，将所述无添加发酵乳的制备方法中嗜热链球菌接种量、脱脂乳浓度，发酵温度以及发酵时间调整到优选范围之外的时候，所制备的无添加发酵乳粘度显著下降，明显低于前述对照组发酵乳x(粘度值为705)，表明发酵乳杆菌cgmcc no.17321在优选以外的发酵条件下无法正常发挥改善发酵乳质地的功能。
[0077]
以上对本发明所提供的发酵乳杆菌在制备无添加发酵乳中的应用进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

技术特征：
1.一种发酵乳杆菌在制备无添加发酵乳中的应用，其特征在于，所述应用包括以下步骤：将发酵乳杆菌和嗜热链球菌接种于脱脂乳中进行发酵。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述发酵乳杆菌为保藏编号cgmcc no.17321的菌株。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，，所述发酵乳杆菌cgmccno.17321的接种量为5x105～5x10
7 cfu/ml，所述嗜热链球菌的接种量为2.5x106～2.5x10
7 cfu/ml。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述脱脂乳包括脱脂乳粉、蔗糖和水，脱脂乳粉的占比为质量百分比8～12％，蔗糖的占比为质量百分比1～7％，其余为水。5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述发酵的温度为30℃～44℃。6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述发酵的方式为厌氧培养。7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述发酵的时间为5～15h。8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所制备的无添加发酵乳无乳清析出。9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所制备的无添加发酵乳在保藏期内质地和益生菌数量稳定。

技术总结
本发明属于生物技术领域，具体公开了保藏编号为CGMCC NO.17321的发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)菌株在制备无添加发酵乳中的应用。上述发酵乳杆菌的应用，首次将发酵乳杆菌CGMCC NO.17321作为辅助发酵剂，与嗜热链球菌进行共发酵来制备发酵乳，披露了发酵乳杆菌CGMCCNO.17321在改善发酵乳乳清析出、保藏期内发酵乳质地方面的功能及其在保藏期内优良的存活性能。本发明的应用可获得质地稳定的发酵乳，打破了无添加发酵乳生产工艺上重要的技术壁垒。重要的技术壁垒。重要的技术壁垒。


技术研发人员：韩瑨 吴正钧 刘振民 王禕天
受保护的技术使用者：光明乳业股份有限公司
技术研发日：2023.06.08
技术公布日：2023/8/9