一种解淀粉芽孢杆菌及其培养方法和应用与流程

amyloliquefaciens)007菌剂的培养方法，包括如下步骤：
11.(1)将解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)007菌株活化后，用接种针接种至种子液中，放入摇床上进行振荡培养后取出，得到种子菌液；所述种子液含有液体pda100ml、氯化钠0.5g、k2hpo40.1g和caco30.02g；
12.(2)将种子菌液用移液枪吸取2ml加到发酵液中，再放入摇床上培养，即得解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)007菌剂，所述发酵液含有蒸馏水100ml、糖蜜6ml、玉米浆0.5ml、mgso40.5g和mncl20.01g，然后用koh调节发酵液ph值7.2～7.5后，再加0.3g轻质caco3。
13.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
14.1、本发明提供的解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)007相比于化学防治而言，具有对植物病害的专一性，能够对症下药，对植物本身和周围环境没有污染，具有很好的防治效果。
15.2、本发明提供的解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)007菌剂中，含有大量有益菌群，它产生的活性物质，能阻碍有害病菌的繁殖，能增强作物的免疫能力，使植株健壮生长，同时，还具有促根的效果，尤其搭配生根水溶肥一起使用，能提高地温，促进作物萌发新根、老根健壮，进而促进根系生长。
附图说明
16.图1为本发明的解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)007镜检图。
具体实施方式
17.为了使本技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本技术，并不用于限定本技术。本技术中未详细单独说明的试剂均为常规试剂，均可从商业途径获得；未详细特别说明的方法均为常规实验方法，可从现有技术中获知。
18.需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序，也不对其后的技术特征起到实质的限定作用。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
19.本发明实施例提供了一种解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)，所述解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)007保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏地址是中国.武汉.武汉大学；保藏日期：2022年12月23日；保藏编号：cctcc no:m 20222025，
20.其中，本发明中，所述解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)007的16s rrna序列为：
21.tgcaagtcgagcggacagatgggagcttgctccctgatgttagcggcggacgggtgagtaacacgtgg
gtaacctgcctgtaagactgggataactccgggaaaccggggctaataccggatggttgtctgaaccgcatggttcagacataaaaggtggcttcggctaccacttacagatggacccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcgacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaagctctgttgttagggaagaacaagtgccgttcaaatagggcggcaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagggctcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccccggctcaaccggggagggtcattggaaactggggaacttgagtgcagaagaggagagtggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgactctctggtctgtaactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagggggtttccgccccttagtgctgcagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctctgacaatcctagagataggacgtccccttcgggggcagagtgacag；如seq id no.1所示，镜检图如图1所示。
22.本发明实施例还提供了一种如上所述的解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)007在防治植物病虫害中的应用。
23.作为本发明的优选实施例，所述植物病虫害为草莓红中柱病害。
24.本发明实施例还提供了一种含有如上所述的解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)007的菌剂。
25.本发明实施例还提供了一种如上所述的解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)007菌剂的筛选培养方法，包括如下步骤：
26.(1)将解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)007菌株活化后，用接种针接种至种子液中，放入摇床上进行振荡培养后取出，得到种子菌液；所述种子液含有液体pda100ml、氯化钠0.5g、k2hpo40.1g和caco30.02g；
27.(2)将种子菌液用移液枪吸取2ml加到发酵液中，再放入摇床上培养，即得解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)007菌剂，所述发酵液含有蒸馏水100ml、糖蜜6ml、玉米浆0.5ml、mgso40.5g和mncl20.01g，然后用koh调节发酵液ph值7.2～7.5后，再加0.3g轻质caco3。
28.在一些实施例中，所述解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)007采用稀释涂布平板法从草莓红中柱病原菌病发地附近土壤分离，包括如下方法：
29.(11)采集草莓红中柱病原菌病发地附近土壤，采用稀释涂布平板法，鉴定出所述土壤里含有如权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)007，并分离含有所述解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)007的待检测菌株粉剂，然后称取适量待检测菌株粉剂，加入到含有无菌水的带玻璃珠的三角瓶中，在摇床上振荡培养一段时间，得到菌液；
30.(12)用无菌水分别配置体积分数为0.01％、0.001％和0.0001％的菌液，作为菌种筛选液；
31.(13)将菌种筛选液加到na平板培养基中，每个浓度重复3次，然后涂匀，放入30℃培养箱中培养；
32.(14)在na平板培养基中找到单菌落，用接种针挑取菌落接种到斜面培养基上，放
入30℃培养箱中培养，待培养好后用革兰氏染色法挑取菌落在显微镜上观察，确保无杂菌后再进行转接到另一斜面培养基上；
33.(15)用40％甘油管进行低温保藏。
34.在一些实施例中，步骤(11)中，称取1g菌株粉剂加入到100ml无菌水中。
35.在一些实施例中，步骤(13)中，na平板培养基包括以下成分：蛋白胨10g；氯化钠10g；酵母浸粉5g；牛肉膏5g；琼脂粉18g；无菌水1000ml；步骤(14)中，斜面培养基包括以下成分：蛋白胨5g；氯化钠5g；酵母浸粉2.5g；牛肉膏2.5g；琼脂粉9g；无菌水500ml，取7ml培养基作为斜面培养基。
36.在一些实施例中，所述摇床温度为30℃，振荡频率为220r/min。下面结合对本发明的应用原理做进一步详细说明。
37.实施例1：解淀粉芽孢杆菌的筛选培养方法
38.本发明主要采用稀释涂布平板法。
39.实验材料：无菌水、高温灭菌的试管、三角涂棒，装有100ml无菌水带有玻璃珠的三角瓶。
40.实验培养基：
41.na平板培养基(蛋白胨10g，氯化钠10g，酵母浸粉5g，牛肉膏5g,琼脂粉18g,无菌水1000ml)；
42.斜面培养基：蛋白胨5g,氯化钠5g，酵母浸粉2.5g,牛肉膏2.5g,琼脂粉9g,无菌水500ml,每根试管取7ml培养基作为斜面培养基。
43.筛选方法：采集草莓红中柱病原菌病发地附近土壤，采用稀释涂布平板法，鉴定出上述土壤里含有本发明的解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)007(土壤里含有多种菌株)，然后从土壤里分离出含有该解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)007的待检测菌株粉剂，然后将待检测的菌株粉剂在称量天平上称取1g加到装有100ml无菌水带有玻璃珠的三角瓶中，然后放在28℃、200r的摇床上振荡30分钟后取出，然后在6根试管中分别用移液枪吸取9ml无菌水，6根试管依次放在试管架上，然后在第一根试管中加入摇好的菌液1ml，在振荡器上充分摇匀，然后用移液枪吸取第一根试管的菌液1ml加到第二根试管中，这样依次重复以上步骤，到最后一根试管。这样就有6个稀释浓度的试管，取后面3个稀释浓度试管作为菌种筛选，将这3个浓度的菌液分别吸取0.1ml加到na平板培养基中，每个浓度重复三次，然后用三角涂棒涂匀，放入30℃培养箱中培养12h。然后在平板中找到单菌落，用接种针挑取菌落接种到斜面培养基上，放入30℃培养箱中培养，待培养好后用革兰氏染色法挑取菌落在显微镜上观察，确保无杂菌后再进行转接到另一斜面培养基上，最后用40％甘油管进行低温保藏。
44.培养方法：将分离出的解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)007菌株活化后，用接种针接种至种子液中，在30℃、220r/min摇床上进行振荡培养7h后取出，然后将每个种子菌液用移液枪吸2ml加到发酵液中，再放入摇床上培养32h取出，待检测使用。
45.其中，所述种子液含有液体pda100ml、氯化钠0.5g、k2hpo40.1g和caco30.02g；
46.所述发酵液含有蒸馏水100ml、糖蜜6ml、玉米浆0.5ml、mgso40.5g和mncl20.01g，然后用koh调节发酵液ph值7.2～7.5后，再加0.3g轻质caco3。
47.实施例2：防治草莓红中柱病害的方法
48.1、材料及培养基配制：
49.供检测的草莓红中柱致病菌来自草莓采集地及草莓根系土壤。实验采用两种培养基，一种为pda培养基，配方为200g土豆、20g蔗糖、18g琼脂粉和1000ml蒸馏水。另一种为lb培养基,配方为胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，nacl10g，琼脂10g，蒸馏水1000ml。
50.2、土壤细菌的分离纯化与拮抗细菌的筛选：
51.(1)平板稀释法。称取采集的土样每份10g，放入含有100ml无菌水的250ml三角瓶中，于摇床上振荡30min。用无菌水将土壤溶液逐步稀释，取3个浓度梯度10-3
、10-4
和10-5
的稀释液各100ul，在lb培养基上涂板，平板置于37℃培养箱中培养。待菌落长出后，根据其培养特征的不同，挑取平板中占优势的单菌落，通过划线法进行分离、纯化。将所得的致病菌株保存在－80℃冰箱中(甘油密封)。
52.(2)拮抗细菌的筛选。采用牛津杯抑菌法进行拮抗细菌的筛选，将分离纯化所得致病菌株制成液体培养液，准备6个倒好平板的pda培养基，然后每个取100ul培养液在pda培养基上涂板，其中一个作为对照(不加拮抗细菌)。然后在其中四个里面分别放入一个牛津杯，然后将准备好的四种芽孢杆菌液体发酵液：多粘芽孢杆菌(paenibacillus polymyxa)(003保藏编号为cctccno:m 20222023)、韦氏芽孢杆菌(bacillus-weihenstephanensis)004(保藏编号为cctccno:m 20222024)、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)016(保藏编号为cctcc no:m20222026)、本发明的解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)007、海洋芽孢杆菌(由武汉惠和世纪从浙江桐庐生物科技有限公司生产的海洋原药样品中分离获得的已知菌株)，分别取250ul加到每个平板中，然后在剩下一个pda培养基中放入四个牛津杯，将四种芽孢发酵液分别加入四个牛津杯中，平板置于30℃培养箱中培养，培养12h后观察。
53.通过四种不同芽孢发酵液对土壤细菌拮抗产生的抑菌圈可以得出解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)007对草莓红中柱病害有明显抑制作用。
54.3、防治草莓红中柱病害的方法：
55.使用前一般将土壤深翻25-35厘米左右，然后再将由本发明的解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)007配置的微生物菌剂(1000公斤水溶解1.5kg解淀粉芽孢杆菌)、三元复合肥(50公斤)、微量元素水溶肥(20公斤)掺混在一起，最后将其均匀地施于土壤里。当植物发病后，将解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)007用水稀释800倍后以灌根的方式施入土壤中，菌剂施肥间隔时间为2～3天。
56.草莓感染红中柱病害后，真菌从根的顶部侵入后，像根心发展，使中心柱变为红褐色，地上部先由基部叶的边缘开始变为红褐色，再逐渐向上凋萎枯死。草莓种植成活后，每7～10天根部淋施一次800倍解淀粉芽孢杆菌水溶液，发病后连续淋施2～3次，能促进草莓根部发育以及增加花柱数、提早果实成熟和增加果实数量，同时还能促进草莓植株矮壮、叶片肥大、产量提高。
57.以上所述，仅为本技术较佳的具体实施方式，但本技术的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本技术揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本技术的保护范围之内。

技术特征：
1.一种解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)，其特征在于：所述解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)007保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏地址是中国.武汉.武汉大学；保藏日期：2022年12月23日；保藏编号：cctccno:m20222025。2.根据权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)，其特征在于：所述解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)007的16srrna序列如seq id no.1所示。3.如权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)007在防治植物病虫害中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述植物病虫害为草莓红中柱病害。5.一种含有权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)007的菌剂。6.如权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)007菌剂的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)007菌株活化后，用接种针接种至种子液中，放入摇床上进行振荡培养后取出，得到种子菌液；所述种子液含有液体pda100ml、氯化钠0.5g、k2hpo40.1g和caco30.02g；(2)将种子菌液用移液枪吸取2ml加到发酵液中，再放入摇床上培养，即得解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)007菌剂，所述发酵液含有蒸馏水100ml、糖蜜6ml、玉米浆0.5ml、mgso40.5g和mncl20.01g，然后用koh调节发酵液ph值7.2～7.5后，再加0.3g轻质caco3。7.根据权利要求6所述的解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)007菌剂的培养方法，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌采用稀释涂布平板法从草莓红中柱病原菌病发地附近土壤分离，包括如下方法：(11)采集草莓红中柱病原菌病发地附近土壤，采用稀释涂布平板法，鉴定出所述土壤里含有如权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)007，并分离含有所述解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)007的待检测菌株粉剂，然后称取适量待检测菌株粉剂，加入到含有无菌水的带玻璃珠的三角瓶中，在摇床上振荡培养一段时间，得到菌液；(12)用无菌水分别配置体积分数为0.01％、0.001％和0.0001％的菌液，作为菌种筛选液；(13)将菌种筛选液加到na平板培养基中，每个浓度重复3次，然后涂匀，放入30℃培养箱中培养；(14)在na平板培养基中找到单菌落，用接种针挑取菌落接种到斜面培养基上，放入30℃培养箱中培养，待培养好后用革兰氏染色法挑取菌落在显微镜上观察，确保无杂菌后再进行转接到另一斜面培养基上；(15)用40％甘油管进行低温保藏。8.根据权利要求7所述的解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)007的培养方法，其特征在于，步骤(11)中，称取1g菌株粉剂加入到100ml无菌水中。9.根据权利要求7所述的解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)007的培养方
法，其特征在于，步骤(13)中，na平板培养基包括以下成分：蛋白胨10g；氯化钠10g；酵母浸粉5g；牛肉膏5g；琼脂粉18g；无菌水1000ml；步骤(14)中，斜面培养基包括以下成分：蛋白胨5g；氯化钠5g；酵母浸粉2.5g；牛肉膏2.5g；琼脂粉9g；无菌水500ml，取7ml培养基作为斜面培养基。10.根据权利要求6所述的解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)007的培养方法，其特征在于，所述摇床温度为30℃，振荡频率为220r/min。

技术总结
本发明公开了一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)及其培养方法和应用，涉及生物工程技术领域。所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)007保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是中国.武汉.武汉大学；保藏日期：2022年12月23日；保藏编号：CCTCCNo:M20222025。本发明提供的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)007相比于化学防治而言，具有对植物病害的专一性，能够对症下药，对植物本身和周围环境没有污染，具有很好的防治效果，且解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)007菌剂中，含有大量有益菌群，它产生的活性物质，能阻碍有害病菌的繁殖，能增强作物的免疫能力，使植株健壮生长，同时，还具有促根的效果，尤其搭配生根水溶肥一起使用，能提高地温，促进作物萌发新根、老根健壮，进而促进根系生长。长。长。


技术研发人员：王正和 刘保军 谭新国
受保护的技术使用者：武汉吾尔利生物工程有限公司
技术研发日：2023.04.20
技术公布日：2023/8/9