一种成年鸡卵原干细胞的体外分离培养方法及其应用

1.本发明涉及干细胞培养技术领域，具体涉及一种成年鸡卵原干细胞的体外分离培养方法及其应用。


背景技术：

2.女性的生殖衰老与卵巢功能的丧失密切相关，卵母细胞数量和质量的减少是女性生殖衰老的标志性特征。现已有大量研究支持雌性生殖系干细胞(即为卵原干细胞(oscs))仍然具有再生潜力，其在出生后的卵巢中支持卵母细胞的更新(germline stem cells and follicular renewal in the postnatal mammalian ovary.nature；location and characterization of female germline stem cells(fgscs)in juvenile porcine ovary.cell proliferation)，这为治疗女性不孕症以及减缓卵巢老化开辟了新的有效途径。
3.生殖是一切生命体的基本特征之一，物种的延续必须依赖于生殖，而生殖细胞是直接执行该生物学功能的细胞。传统发育学观点认为，雌性动物的成年卵巢内不存在卵原干细胞(on regenerating the ovary and generating controversy.cell)。随着分子生物学发展，2009年吴际教授团队首次从新生和成年的小鼠卵巢内分离出卵原干细胞并对其生物学特性进行表征(production of offspring from a germline stem cell line derived from neonatal ovaries.nature cell biology)，从而证实在成年哺乳动物卵巢中存在卵原干细胞。并利用卵原干细胞成功构建基因修饰动物模型，后通过在小鼠卵巢内追踪移植后的卵原干细胞的发育情况，发现长期培养的卵原干细胞在移植到受体的卵巢后，仍保持了其产生功能性卵母细胞和可育后代的能力。此后，研究人员在人、猪、羊、牛和兔等的卵巢组织中，都发现了卵原干细胞的标志性基因和蛋白的表达，同时这些卵巢生殖干细胞能够在体外培养条件下形成克隆并保持正常核型(in vitro differentiation of human oocyte-like cells from oogonial stem cells:single-cell isolation and molecular characterization.human reproduction；characteristics of female germline stem cells from porcine ovaries at sexual maturity.cell transplantation；further characterization of adult sheep ovarian stem cells and their involvement in neo-oogenesis and follicle assembly.journal of ovarian research；bovine ovarian stem cells differentiate into germ cells and oocyte-like structures after culture in vitro.reproduction in domestic animals；detection,characterization,and spontaneous differentiation in vitro of very small embryoniclike putative stem cells in adult mammalian ovary.stem cells and development)。这些结果表明在哺乳动物中已经成功建立了较完善的卵原干细胞体外分离培养系统，并且可支撑其分化成为功能性的卵母细胞，为不孕不育及相关疾病诊治和生育力保存提供技术平台和理论依据，也为卵原干细胞的临床应用奠定基础。
4.按传统发育学观点，鸡出生后原始卵泡库和卵母细胞的数目也已经固定不再增加
(actions of anti-m
ü
llerian hormone on the ovarian transcriptome to inhibit primordial to primary follicle transition.reproduction)。但随着生物技术的高速发展，在物种进化中占重要地位的鸟类，畜禽中重要的经济动物鸡，是否跟以上报道的哺乳动物一样，成年卵巢中依然存在着少量卵原干细胞，以及这种细胞该如何进行分离纯化，体外扩繁和功能鉴定，目前尚无任何相关报道。


技术实现要素：

5.针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种鸡卵原干细胞的体外分离培养方法及其应用。本发明开创性的从成年鸡卵巢中体外分离培养得到鸡卵原干细胞，能够为延长鸡的产蛋周期、提高鸡的繁殖性能提供新的思路的途径。
6.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
7.本发明的第一方面，提供一种鸡卵原干细胞的体外分离培养方法，包括以下步骤：
8.(1)将成年鸡卵巢的皮质部分破碎成组织团块，用包含双抗的pbs缓冲液漂洗，静置后得到下层的组织团；用0.25％胰酶消化处理组织团，将消化处理后的组织团用磁珠活化细胞分选缓冲液进行重悬，加入一抗，孵育10-20min；然后再加入anti-mouse igm二抗磁珠，共孵育20-30min；用磁珠活化细胞分选缓冲液进行洗脱，即去除未结合磁珠的阴性细胞，洗脱步骤至少重复3次，收集包含目的细胞的洗脱液。将最后的与磁珠结合的目的细胞使用基础培养液重悬，平铺在鸡胚成纤维细胞饲养层上进行培养。
9.(2)将包含目的细胞的洗脱液依次进行原代培养、传代培养，即体外分离培养得到鸡卵原干细胞。
10.优选的，步骤(1)中，所述包含双抗的pbs缓冲液中含有的双抗为1xantibiotic-antimycotic(抗生-抗真菌剂)。
11.优选的，步骤(1)中，所述一抗为阶段特异性胚胎抗原-1(ssea-1)。
12.优选的，步骤(1)中，所述磁珠活化细胞分选缓冲液为1％(体积分数)胎牛血清和2mm edta的d-pbs缓冲液。
13.优选的，步骤(2)中，所述原代培养是以鸡胚成纤维细胞作为饲养层；以包含体积分数为2.5％鸡血清、体积分数为7.5％胎牛血清、1.2mm丙酮酸钠、1xantibiotic-antimycotic、1x glutamax、1x embryomax nucleosides、0.1mmβ-巯基乙醇、1x neaa、1x b-27supplement、6ng/ml hfgfb和25ng/ml human activin a的ko-dmem培养基为鸡卵原干细胞基础培养液。
14.优选的，步骤(2)中，原代培养的条件为：39℃、5％co2。
15.优选的，步骤(2)中，所述传代培养是将处于对数生长期的鸡卵原干细胞克隆吸出，用胰酶消化处理，分散成单细胞或若干小细胞团后接种至新的鸡胚成纤维细胞饲养层上继续培养。
16.本发明的第二方面，提供上述体外分离培养方法得到的鸡卵原干细胞。
17.本发明的第三方面，提供上述鸡卵原干细胞在如下(1)或(2)中的应用：
18.(1)延长鸡的产蛋周期；
19.(2)提高鸡的繁殖性能。
20.本发明的有益效果：
21.(1)鸡是一种重要经济动物，如何开发保护我国优秀种质遗传资源是禽类生产中的迫切问题。本发明开发了一种在体外纯化分离且稳定扩繁鸡卵原干细胞的培养系统，通过本体系培养的鸡卵原干细胞可进行传代扩繁，且保有稳定的生殖干细胞特性、增殖能力和定向迁移能力，而不丧失种系能力。保持卵母细胞样细胞的分化潜能对于鸡优秀种质资源的获得、保种和改良具有重要的意义。
22.(2)本发明提供的卵原干细胞的体外分离方法，适用于禽类动物成年卵巢的卵原干细胞的分离培养。同时，鸟类的生殖细胞(包括原始生殖细胞和卵原干细胞等)与其他物种的生殖细胞有较大区别，含有脂质和糖类成分较多，其他物种的生殖细胞培养技术流程无法在鸟类生殖细胞中应用，迫切需要开发和优化鸟类特别是鸡的卵原干细胞的分离培养标准化流程。此外，存在于成年卵巢中的卵原干细胞细胞数量占比极其少，且鸡的成年卵巢中细胞组分较为复杂，除了卵原干细胞和卵母细胞以外，还有大量的其他体细胞，如颗粒细胞，膜细胞和基底层细胞等。因此，卵原干细胞的体内生存环境决定了其分离培养条件极为困难，环境的改变也意味着胚胎生殖干细胞的分离培养条件无法用于成年鸡卵巢的卵原干细胞。本发明所介绍的细胞分离纯化培养技术，是首次高效应用在成年鸡的卵原干细胞中，分离培养的鸡卵原干细胞长期稳定培养条件下会形成典型的胚胎干细胞样细胞克隆团。
23.(3)本培养体系可显著促进鸡卵原干细胞的体外增殖效率，经长期传代实验统计平均4天左右细胞数量可扩繁一倍。同时经鉴定传代后的卵原干细胞依然保有干细胞和生殖细胞特性，其呈现ssea-1和ddx4双阳性，且保留有干性基因ssea-3、sox2和nanog表达，以及生殖标记基因prdm1和dazl等的表达，将体外长期培养的卵原干细胞重新导入发育2.5天的鸡胚血管中，卵原干细胞可以定植归巢至早期性腺中，具备生殖干细胞的迁移特性和发育为卵母细胞的潜力。
24.(4)卵原干细胞是一种极有应用前景的遗传资源，本发明提供的卵原干细胞培养方法，便于对鸡卵原干细胞进行体外深入研究，有望在畜牧生产中为深入挖掘母鸡产蛋性能和延长母鸡产蛋周期等养殖育种中的瓶颈问题服务。
附图说明
25.图1：体外分离培养条件下鸡卵原干细胞的细胞形态。培养初期细胞呈现分散生长，随着培养时间增加，尤其可见传代培养后出现大量典型的胚胎干细胞样细胞克隆团。
26.图2：体外分离培养条件下鸡卵原干细胞的传代增值细胞数量统计。鸡卵原干细胞的细胞传代时间为4
±
0.75d，培养初代细胞(即primary cell,p0)，此后passage2，passage4，passage10(即p2,p4,p10)细胞稳定增殖且细胞活性不降低，p10的鸡卵原干细胞扩增总数目可达106数量级。
27.图3：培养的鸡卵原干细胞edu-ddx4共染色鉴定图。附图标记说明：在此培养体系中，鸡卵原干细胞保有稳定的增殖能力。图3中的a图，体外培养2d的鸡卵原干细胞的明场图；图3中的b图，体外培养2d的鸡卵原干细胞中edu与ddx4染色的merge图；图3中的c图，体外培养2d的鸡卵原干细胞中dapi与edu、ddx4染色的merge图；图3中的d图，体外培养3d的鸡卵原干细胞的明场图；图3中的e图，体外培养3d的鸡卵原干细胞中edu与ddx4染色的merge图；图3中的f图，体外培养3d的鸡卵原干细胞中dapi与edu、ddx4染色的merge图；图3中的g图，传代后的鸡卵原干细胞的明场图；图3中的h图，传代后的鸡卵原干细胞中edu与ddx4染
色的merge图；图3中的i图，传代后的鸡卵原干细胞中dapi与edu、ddx4染色的merge图，比例尺＝20μm。图3中的j图，体外培养的鸡卵原干细胞增殖率的统计分析图。
28.图4：培养的鸡卵原干细胞ssea1-ddx4共染色鉴定图培养的细胞免疫荧光染色鉴定图。附图标记说明：通过磁珠吸附分离培养的鸡卵原干细胞具有生殖干性。图4中的a图，体外培养的鸡卵原干细胞的明场图；图4中的b图，ddx4免疫荧光阳性细胞；图4中的c图，ssea1免疫荧光阳性细胞；图4中的d图，dapi对细胞核的免疫荧光染色；图4中的e图，dapi与ddx4、ssea1染色的merge图。比例尺＝20μm
29.图5：卵原干细胞表达生殖干性marker基因的定量检测。附图说明：稳定传10代后的鸡卵原干细胞(osc)跟鸡胚原始生殖细胞一样，高表达多能干细胞标记基因ssea-3、sox2和nanog，以及生殖细胞标记基因ddx4、prdm1和dazl。鸡原始生殖细胞(pgc)作为可以表达多能干细胞标记物以及生殖细胞标记物的阳性对照，鸡胚胎成纤维细胞(cef)作为几乎不表达表达多能干细胞标记物以及生殖细胞标记物的阴性对照。
30.图6：培养的鸡卵原干细胞进行性腺迁移定植能力的鉴定图。附图标记说明：图6中的a图为12.5日龄受体鸡胚雌性性腺的红色荧光卵原干细胞迁移图，比例尺＝0.5mm；图6中的b图为12.5日龄受体鸡胚雄性性腺的红色荧光卵原干细胞迁移图，比例尺＝0.5mm；图6中的c图为12.5日龄受体鸡胚雌性和雄性性腺中红色荧光卵原干细胞迁移数目统计的直方图。
具体实施方式
31.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本技术提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本技术所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
32.如前所述，按传统发育生物学理论认为成年鸡中是不存在卵原干细胞的，而本发明则意外的发现，成年鸡的卵巢中含有卵原干细胞。并通过构建体外分离培养体系从成年鸡中纯化分离扩繁得到卵原干细胞。
33.众所周知，鸡卵巢内卵泡的数量和质量直接影响产蛋性能，在高等脊椎动物中，蛋鸡的卵泡是动态变化最为剧烈和频繁的一类组织，在产蛋期间几乎每24h排一个卵子。因此，本发明对成年鸡卵巢中的卵原干细胞的发现鉴定、分离培养和体外扩繁的方法建立，可为人类深入了解鸡卵泡库的动态更新机制，充分挖掘鸡卵巢中的卵泡资源奠定基础，从而为延长鸡产蛋周期和提高产蛋效率等急需解决的生产问题服务。
34.本发明所分离纯化的鸡卵原干细胞具有无限增殖和生成卵母细胞的潜力，能够补充鸡的卵泡库内卵母细胞数量，防止卵泡耗尽而引起的产蛋下降。因此，鸡的卵原干细胞的分离、培养和体外体内应用，能够为延长鸡的产蛋周期，提高鸡的繁殖性能提供新的思路和途径，同时为鸡的高效保种和育种提供技术，为地方家禽珍稀品种的基因和细胞资源保护核利用提供支撑，由此提出了本发明。
35.为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本技术的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本技术的技术方案。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或者按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。
36.实施例1：鸡卵原干细胞基础培养液的配制
37.以ko-dmem培养基为基础培养基中，向基础培养基中添加：2.5％(体积分数)鸡血清，7.5％(体积分数)胎牛血清，1.2mm丙酮酸钠(购自北京索莱宝科技有限公司)，1xantibiotic-antimycotic(抗生素-抗真菌剂，购自赛默飞世尔科技有限公司)，1x glutamax(谷氨酰胺添加剂，购自赛默飞世尔科技有限公司)，1x embryomax nucleosides(核苷酸补充剂，购自默克密理博中国有限公司)，0.1mmβ-巯基乙醇，1x neaa，1x b-27supplement，6ng/ml hfgfb(人碱性成纤维细胞生长因子，购自北京索莱宝科技有限公司)，和25ng/ml human activin a(人激活素a,购自派普泰克生物科技有限公司)，以上浓度参数均为配制的鸡卵原干细胞基础培养液中的终浓度。
38.实施例2：鸡卵原干细胞的分离培养
39.试验用的鸡品种为100-200日龄海兰灰鸡(购自湖北武汉，实施本发明不限于该品种)，将鸡卵巢剪下后用含双抗的pbs(磷酸盐缓冲液中含有1x antibiotic-antimycotic)漂洗去除表面残血，将卵巢的皮质部分剪碎用包含双抗的pbs缓冲液漂洗至少3次，静置之后得到下层的组织团；然后用0.25％胰酶消化处理组织团3次，每次5-10min，每隔5min吹打若干次使组织充分消化，等待大部分组织消化分散成为单细胞后离心弃去上清，保留细胞沉淀，进行活细胞磁珠分选。具体活细胞磁珠分选步骤如下：
40.(1)磁珠活化细胞分选缓冲液(macs)的配制：即d-pbs(不含ca
2+
或mg
2+
的磷酸盐缓冲液，购自北京索莱宝科技有限公司)中含有1％(体积分数)胎牛血清、2mm edta(购自北京索莱宝科技有限公司)。
41.(2)预洗二抗磁珠(anti-mouse igm dynabeads，11039d,购自invitrogen公司)：先将所需的磁珠(25-30μl)转移至无菌的1.5ml离心管中，加入1ml新鲜配制的磁珠活化细胞分选缓冲液(macs)重悬磁珠。将离心管置于磁力架1分钟后丢弃上清液。将离心管从磁铁上取下，将磁珠与1ml新鲜配制的缓冲液再次重悬，即重复预洗操作2-3次。
42.(3)使用500μl磁珠活化细胞分选缓冲液(macs)重悬细胞沉淀，调整细胞浓度约为5
×
106cells/ml。加入5μg anti-ssea1抗体(阶段特异性胚胎抗原-1,ssea-1,购自圣克鲁斯抗体公司,sc-21702)与细胞悬液充分混合，孵育10-20min(以上操作于无菌的1.5ml离心管中进行)。
43.(4)一抗孵育完成后，300x g离心8min，小心吸掉上清，使用500μl磁珠活化细胞分选缓冲液(macs)再次重悬细胞沉淀，重悬后细胞浓度约为5
×
106cells/ml，将细胞悬液与预洗好的二抗磁珠共孵育20-30min，期间采用旋转孵育(以上操作于无菌的1.5ml离心管中进行)。
44.(5)先将步骤(4)中的离心管置于磁力架1分钟后丢弃上清液，再使用1ml磁珠活化细胞分选缓冲液(macs)进行洗脱，离心管于磁力架静置1分钟后弃去上清，即去除未结合磁珠的阴性细胞，洗脱步骤至少重复3次。
45.将最后的与磁珠结合的目的细胞使用鸡卵原干细胞基础培养液重悬，收集平铺在鸡胚成纤维细胞饲养层上进行培养。
46.将分离得到的鸡卵原干细胞移入平铺饲养层细胞的12孔细胞培养板中，加入新鲜配制的鸡卵原干细胞基础培养液，置于39℃、含5％co2的培养箱中培养，1-2d进行半量换液，3d后开始出现典型的干细胞样克隆团(见图1)，可进行传代培养。
47.本发明通过上述分离培养条件的优化，首次从成年鸡卵巢中分离纯化得到卵原干细胞。
48.实施例3：鸡胚成纤维细胞饲养层的培养
49.(1)受精蛋孵化至7天，通过75％酒精和新洁尔灭清洗种蛋，敲开蛋壳，用眼科弯镊子小心取出胚体，用pbs浸洗3次；
50.(2)再用眼科弯镊子将胚体取出放入新的平皿中，去除掉鸡胚的头、四肢、内脏和尾，将剩余的组织用pbs浸洗3次，然后用眼科手术剪刀仔细将组织反复剪碎，直到成1mm3大小的碎块；
51.(3)将其转移至1.5ml的离心管中，加入500μl的0.25％胰酶室温消化15-20min，加入等体积含有10％胎牛血清的rpmi1640培养液(购自hyclone生物公司)终止消化；
52.(4)用40μm滤膜过滤后得到细胞悬液，1000x g离心5分钟后收集沉淀，用干细胞基础培养液重悬细胞沉淀，接种于12孔板中，将其置于39℃，5％ co2培养箱条件下培养。
53.实施例4：鸡卵原干细胞的传代培养效果检测
54.将处于对数生长期的鸡卵原干细胞克隆用枪头吸出，使用胰酶消化处理5min，分散成单细胞或者若干小细胞团后接种至新的鸡胚成纤维细胞饲养层上继续培养，加入上述基础培养液，将所述的鸡卵原干细胞在39℃、含5％co2的培养箱中继续培养。当培养时间到达7-10d时(即为传代一次后的passage2)，鸡卵原干细胞扩增总数目可达105数量级，此后每4
±
0.75d可进行一次细胞传代(见图2)，传代培养至十代的鸡卵原干细胞扩增总数目可达106数量级，传代后的细胞形态仍然呈现典型的干细胞样克隆团(见图1)，本发明提供的培养体系可以使鸡卵原干细胞在体外稳定增殖并且可以持续传代培养至十代以上(见图2)。
55.实施例5：鸡卵原干细胞的增殖检测
56.(1)12孔板中鸡卵原干细胞在培养液中加入edu(购自赛默飞世尔科技有限公司)，其终浓度为10um，在39℃、含5％co2的培养箱中孵育过夜。
57.(2)上述培养的鸡卵原干细胞用多聚甲醛溶液(4％pfa)进行甲醛固定后，以磷酸盐缓冲液(pbs)漂洗3次后用triton x-100处理10min，然后用含有tris(购自赛默飞世尔科技有限公司，am9855g)、硫酸铜、荧光叠氮化物555(购自赛默飞世尔科技有限公司，a20012)和抗坏血酸(购自赛默飞世尔科技有限公司，a4403)的染液共孵育30min。孵育完成后，细胞可以使用前面所述的常规方案进行后续免疫荧光染色。通过edu和ddx4的共免疫荧光染色来指示增殖的鸡卵原干细胞，可见在细胞培养早期，少量单个散在的卵原干细胞呈现edu-ddx4双阳性，在细胞传代培养后，edu信号主要在ddx4阳性的细胞克隆中出现(见图3a-i)。经过统计发现，随着培养时间和细胞代数的增加，卵原干细胞的增殖率呈上升趋势(见图3j)，以上结果即说明本发明提供的培养体系可以使鸡卵原干细胞在体外保持稳定的增殖能力。
58.实施例6：免疫荧光染色鉴定
59.(1)将培养的卵原干细胞用多聚甲醛溶液(4％pfa)进行固定，以磷酸盐缓冲液(pbs)漂洗3次后用triton x-100处理10min，再使用山羊血清(购自北京索莱宝科技有限公司)封闭液处理30min，后用ssea-1(购自圣克鲁斯抗体公司,sc-21702,使用体积比1:200)抗体稀释液于4℃过夜孵育，pbs漂洗3次后加入山羊抗鼠的二抗(购自赛默飞世尔科技有限
公司,使用时体积比为1:200)室温孵育1h后加入dapi避光孵育5min后在荧光显微镜下观察结果。可见分离得到的鸡卵原干细胞的细胞膜中表达ssea-1干细胞特异性标记，即呈现红色荧光，细胞核为dapi染色(见图4)。
60.(2)将培养的鸡卵原干细胞用多聚甲醛溶液(4％pfa)进行固定，用pbs缓冲液漂洗3次后用triton x-100处理10min，再使用山羊血清封闭液处理30min，后用ddx4(购自艾博抗上海有限公司,ab13840,使用时体积比为1:200)抗体稀释液于4℃过夜孵育，pbs漂洗3次后加入山羊抗兔的二抗(购自武汉赛维尔生物科技有限公司,使用时体积比为1:200)室温孵育1h，后加入dapi避光孵育5min后在荧光显微镜下观察结果。可见分离得到的鸡卵原干细胞的细胞膜中表达ddx4生殖细胞特异性标记，呈现绿色荧光，细胞核为dapi染色(见图4)。
61.采用免疫磁珠分选系统来富集ssea-1阳性细胞，对成年鸡卵巢中卵原干细胞进行纯化，以去除体细胞(如颗粒细胞，膜细胞等)。上述共免疫荧光染色结果发现，经磁珠分选后体外培养细胞中的ssea1-ddx4双阳性率可以达95％以上，即用方法能有效地去除鸡成年卵巢中的各类体细胞，得到高纯度的鸡卵原干细胞，并且细胞存活率不受影响，为下一步进行细胞移植实验奠定基础。本发明采用基于ssea-1抗体的免疫ss分选方法来实现目的细胞的分离纯化，并首次在鸡中成功地分离并富集活性及纯度高的卵原干细胞。
62.实施例7：卵原干细胞的标志基因的定量检测
63.使用picopure rna isolation kit试剂盒对培养的鸡卵原干细胞进行rna抽提，并用去dna酶的反转录试剂盒合成cdna。最后采用表1中所列的引物进行rt-qpcr检测。
64.表1：
[0065][0066]
试验结果见图5。本发明发现体外培养的鸡卵原干细胞可以表达多能干细胞标记物(ssea-3、sox2、nanog)，以及生殖细胞标记物(ddx4、prdm1、dazl)。因而鸡卵原干细胞可以在本发明提供的体外培养体系中良好地维持其生殖系细胞的基本特性。
[0067]
实施例8：鸡卵原干细胞的性腺迁移能力的鉴定
[0068]
在显微注射前用荧光染料pkh26对体外分离培养的鸡卵原干细胞进行红色荧光标记，后将细胞收集起来用于鸡胚注射。鸡胚显微注射按照如下步骤进行：取5
×
105卵原干细胞重悬于50ul的培养液中，用显微注射用玻璃针吸取1ul细胞悬液并注射到孵化2.5d鸡胚的背主动脉中。在注射后第十天(即胚胎发育12.5天)解剖鸡胚，观察性腺中荧光细胞的数目。图6显示了鸡卵原干细胞性腺迁移能力的鉴定结果，可以看出经过培养并进行红色荧光标记的卵原干细胞具有成功迁移到性腺中的能力，并且卵原干细胞可以定植于雌性和雄性性腺(见图6)，表明成年卵巢中的卵原干细胞可能仍然保持着性别分化双潜能。虽然在早期鸡胚血液的显微注射时注射了相同数量的卵原干细胞，但卵原干细胞对雌性性腺有明显的偏好。我们还观察到在雌性的左侧性腺中分布的卵原干细胞数量明显高于右侧退化性腺
(见图6)。
[0069]
综上所述，本发明能够提供一种在体外分离及培养成年鸡卵原干细胞的方法，在所述基础培养液中鸡卵原干细胞可以很好的维持其生物学特性，保持了鸡卵原干细胞的稳定增殖能力和定向迁移能力，并在细胞移植进早期鸡胚后，在早期性腺中定植并具有正常发育分化的潜能，不丧失种系能力。
[0070]
以上所述仅为本技术的优选实施例而已，并不用于限制本技术，对于本领域的技术人员来说，本技术可以有各种更改和变化。凡在本技术的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本技术的保护范围之内。

技术特征：
1.一种鸡卵原干细胞的体外分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将成年鸡卵巢的皮质部分破碎成组织团块，用包含双抗的pbs缓冲液漂洗，静置后得到下层的组织团；用胰酶消化处理组织团，将消化处理后的组织团用磁珠活化细胞分选缓冲液进行重悬，加入一抗，孵育10-20min；然后再加入anti-mouse igm二抗磁珠，共孵育20-30min；用磁珠活化细胞分选缓冲液进行洗脱，收集包含目的细胞的洗脱液；(2)将包含目的细胞的洗脱液依次进行原代培养、传代培养，即体外分离培养得到鸡卵原干细胞。2.根据权利要求1所述的体外分离培养方法，其特征在于，步骤(1)中，所述包含双抗的pbs缓冲液中含有的双抗为1x antibiotic-antimycotic(抗生素-抗真菌剂)。3.根据权利要求1所述的体外分离培养方法，其特征在于，步骤(1)中，所述一抗为阶段特异性胚胎抗原-1。4.根据权利要求1所述的体外分离培养方法，其特征在于，步骤(1)中，所述磁珠活化细胞分选缓冲液为含有1％(体积分数)胎牛血清和2mm edta的d-pbs缓冲液。5.根据权利要求1所述的体外分离培养方法，其特征在于，步骤(2)中，所述原代培养是以鸡胚成纤维细胞作为饲养层。以含有体积分数为2.5％鸡血清、体积分数为7.5％胎牛血清、1.2mm丙酮酸钠、1x antibiotic-antimycotic、1x glutamax、1x embryomax nucleosides、0.1mmβ-巯基乙醇、1x neaa、1x b-27supplement、6ng/ml hfgfb和25ng/ml human activin a的ko-dmem终浓度的培养基为培养液。6.根据权利要求1所述的体外分离培养方法，其特征在于，步骤(2)中，原代培养的条件为：39℃、5％co2。7.根据权利要求1所述的体外分离培养方法，其特征在于，步骤(2)中，所述传代培养是将处于对数生长期的鸡卵原干细胞克隆吸出，用0.25％胰酶消化处理，分散成单细胞或若干小细胞团后接种至新的鸡胚成纤维细胞饲养层上继续培养。8.由权利要求1-7任一项所述的体外分离培养方法制备的鸡卵原干细胞。9.权利要求8所述的鸡卵原干细胞在如下(1)或(2)中的应用：(1)延长鸡的产蛋周期；(2)提高鸡的繁殖性能。

技术总结
本发明公开了一种成年鸡卵原干细胞的体外分离培养方法及其应用，属于干细胞培养技术领域。本发明的鸡卵原干细胞的体外分离培养方法包括以下步骤：将成年鸡卵巢的皮质部分破碎成组织团块，用包含双抗的PBS缓冲液漂洗，静置后得到下层的组织团；用胰酶消化处理组织团，用磁珠活化细胞分选缓冲液进行重悬，加入一抗，孵育10-20min；然后再加入二抗磁珠，共孵育20-30min；用磁珠活化细胞分选缓冲液进行洗脱，收集包含目的细胞的洗脱液；将包含目的细胞的洗脱液依次进行原代培养、传代培养。本发明开创性的从成年鸡卵巢中体外分离培养得到鸡卵原干细胞，能够为延长鸡的产蛋周期、提高鸡的繁殖性能提供新的思路的途径。鸡的繁殖性能提供新的思路的途径。鸡的繁殖性能提供新的思路的途径。


技术研发人员：朱桂玉 孟璐 马玉晓 张允 王续钊 姜运良 李显耀 王恒
受保护的技术使用者：山东农业大学
技术研发日：2022.09.09
技术公布日：2023/8/9