戊糖片球菌SMM914在制备治疗慢性阻塞性肺病药物中应用的制作方法

戊糖片球菌smm914在制备治疗慢性阻塞性肺病药物中应用
技术领域
1.本发明涉及益生菌的应用领域，具体而言涉及戊糖片球菌smm914在制备治疗慢性阻塞性肺病药物中应用。


背景技术：

2.慢性阻塞性肺病是一种具有不可逆性气流阻塞特征的慢性支气管炎或肺气肿，且吸入空气污染物导致呼吸道慢性炎症反应增强，可进一步发展为肺源性心脏病和呼吸衰竭的常见慢性疾病。
3.氧化应激是慢性阻塞性肺病的主要驱动机制，由于香烟烟雾、pm2.5等外源性氧化剂对肺部的刺激，使其产生大量的内源性活性氧，导致气道乃至全身的氧化应激水平系统性增加。同时，氧化应激水平的上调促进了慢性炎症的进展，加速了dna损伤以及肺组织衰老，甚至引起类固醇耐药性，且当机体处于慢性阻塞性肺病的发展进程中，常常会诱发众多并发症。
4.目前临床中常用的有布地奈德、氟替卡松等类固醇类激素。除此之外，还有β2受体激动剂类药，抗胆碱药以及抗氧化剂都可用于慢性阻塞性肺病的治疗。但是，这些药物均存在一些毒副作用，长期使用影响身体的健康，给患者带来了沉重的生理和经济负担。
5.根据2014年联合国粮食及农业组织和世界卫生组织对益生菌的定义，将其认定为一种“活微生物”。当给宿主足够数量的益生菌时，会给宿主带来有益的健康影响。国际益生菌和益生元科学协会于2017年更新并扩展了益生菌的概念：一种被宿主微生物选择性地使用的底物，对健康有益。
6.采用益生菌作为膳食性药剂，对人体无毒副作用，且更为经济，但目前市场上还未出现此类药剂以提高内源性抗氧化能力从而改善慢性阻塞性肺病。


技术实现要素：

7.本发明目的在于提供戊糖片球菌smm914在制备治疗慢性阻塞性肺病药物中应用，该菌株可在慢性阻塞性肺病模型小鼠中发挥抗氧化作用并改善肠道菌群组成，克服了现有抗氧化剂无法高效的提高内源性氧化性的难题，拓宽了戊糖片球菌smm914的使用范围，开发了一种有效、新的、无毒副作用的治疗慢性阻塞性肺病的药物。
8.本发明第一方面涉及保藏编号为cgmcc:20160的戊糖片球菌smm914在制备治疗慢性阻塞性肺病药物中应用。
9.优选地，戊糖片球菌smm914通过提高内源性活性氧的水平，提高肺部抗氧化能力，并通过调控肠道益生菌，改善肠道菌群组成，为机体良好的内环境提供帮助，从而有效延缓慢性阻塞性肺病的发展进程。
10.本发明第二方面涉及一种用于治疗慢性阻塞性肺病的药物，包括保藏编号为cgmcc:20160的戊糖片球菌smm914。
11.本发明第三方面涉及一种用于治疗慢性阻塞性肺病的药物的制备方法，包括以下
步骤：
12.s1、将在-80℃冰箱保藏的戊糖片球菌smm914种放入预先置入冰块的烧杯中，缓慢融化，得到菌液；
13.s2、将s1得到的菌液用一次性涂布棒适量蘸取后，均匀涂抹至mrs固体培养板上；
14.s3、将s2得到的mrs固体培养板隔绝氧气，并于恒温培养箱中进行培养；
15.s4、在s3培养后的培养板中挑取单个菌落进行划线，隔绝氧气，并于恒温培养箱中培养，对菌落进行纯化处理，得到单克隆菌株；
16.s5、挑取部分s4得到的单克隆菌株，并转移至mrs液体培养基中振荡培养，得到处于生长平台期的戊糖片球菌液；
17.s6、当s5得到的戊糖片球菌液达到所需od值后，用pbs溶液洗涤、重悬菌体，得到所述药物。
18.优选地，所述步骤s3中，培养条件为：置于37℃培养箱中，先正置培养板30min后，倒置培养12～24h。
19.优选地，所述步骤s4中，培养条件为：置于37℃培养箱中先正置培养板30min后，倒置培养48h。
20.优选地，所述步骤s5中，用移液枪枪头挑取部分步骤s4所得单克隆菌株，转移至1ml的37℃的mrs液体培养基中，在37℃、900rpm条件下振荡培养12～18h，得到处于生长平台期的戊糖片球菌液。
21.优选地，通过以下方法，确定是否获得处于生长平台期的戊糖片球菌液：
22.在步骤s5培养的过程中，吸取500μl培养的戊糖片球菌液至比色皿中，提前用mrs液体培养基为溶剂校零后，在od
600 nm处测定用2mlmrs培养基稀释5倍后菌液的od值，当od值乘以对应的稀释倍数后为109cfu/ml，即得到处于生长平台期的戊糖片球菌液。
23.优选地，若od值乘以对应的稀释倍数没有达到109cfu/ml，则继续培养，并再次测量od值，如此循环，直至得到处于生长平台期的戊糖片球菌液。
24.优选地，所述步骤s6中，洗涤、重悬菌体的过程为：室温离心步骤s5得到的处于生长平台期的戊糖片球菌液，弃去上清液，再将得到的菌体采用pbs溶液重复室温离心洗涤2次，将洗涤完成的菌体采用pbs溶液重悬。
25.本发明的有益效果在于：
26.本发明提供了糖片球菌smm914在制备治疗慢性阻塞性肺病药物领域的新用途，通过实验，验证了戊糖片球菌smm914具有强大的抗氧化能力，提高内源性活性氧的水平，缓解由氧化应激导致的慢性炎症甚至是肺损伤。另外，此菌株利用自身特性，能够抑制多种致病菌的生长，为机体良好的内环境提供帮助，达到治疗慢性阻塞性肺病的目的。
27.本发明提供的药物克服了膳食用抗氧化剂提高内源性活性氧不足的难题，通过体内多种抗氧化途径，调节活性氧水平，能够有效延缓并治疗慢性阻塞性肺病小鼠。
28.本发明提供的药物相较与传统的化学药物，具有绿色环保，无任何毒副作用，可以作为患者预防性和治疗性药物进行长期服用，且通过mrs培养基进行选择培养，用pbs溶液清洗、重悬菌体，制备方法简单有效。
附图说明
29.图1为copd模型小鼠经治疗后肺功能检测指标ef50(呼出50％肺活量时最大呼气流量)的散点分析图，图1中，从左到右分别为对照组、戊糖片球菌实验组、对照造模组、戊糖片球菌造模组(p《0.05为*，p《0.01为**，p《0.001为***)。
30.图2为copd模型小鼠经治疗后小鼠肺功能检测指标penh(增强呼气间歇)的散点分析图。
31.图3为造模第40天处死小鼠的肺组织在100放大倍数下拍摄的倒置相差显微镜照片。
32.图4为造模第40天处死小鼠的肺组织在200放大倍数下拍摄的倒置相差显微镜照片。
33.图5为造模第70天处死小鼠的肺组织在100放大倍数下拍摄的倒置相差显微镜照片。
34.图6为造模第70天处死小鼠的肺组织在200放大倍数下拍摄的倒置相差显微镜照片。
35.图7为造模第100天处死小鼠的肺组织在100放大倍数下拍摄的倒置相差显微镜照片。
36.图8为造模第100天处死小鼠的肺组织在200放大倍数下拍摄的倒置相差显微镜照片。
37.图9为16srdna测序结果中代表微生物多样性指数的shannon图。
38.图10为不同小组处理前后小鼠粪便中的丰度为前20的细菌群落分布变化。
39.图11为造模第6个月处死猪的肺组织在100放大倍数下拍摄的倒置相差显微镜照片。
具体实施方式
40.为了更了解本发明的技术内容，特举具体实施例并配合所附图式说明如下。
41.在本公开中参照附图来描述本发明的各方面，附图中示出了许多说明的实施例。本公开的实施例不必定意在包括本发明的所有方面。应当理解，上面介绍的多种构思和实施例，以及下面更加详细地描述的那些构思和实施方式可以以很多方式中任意一种来实施。
42.乳酸菌，是发酵食品中常见的益生菌群，也是存在于人类胃肠道菌群中的一员，通常被认为是合格安全的。戊糖片球菌是乳酸菌目、乳酸菌属的一种非传统益生菌，为革兰氏阳性、厌氧菌，所生长介质为mrs培养基，最适生长温度为35～40℃，最适生长ph条件为4.5～8.0。
43.本发明提供一种糖片球菌smm914在制备治疗慢性阻塞性肺病药物领域的新用途，通过实验验证，糖片球菌smm914自身具有强大的抗氧化能力，可以提高内源性活性氧的水平，延缓慢性炎症的进展，且可以抑制肠道出血性大肠杆菌、产肠毒素大肠杆菌、克雷伯氏肺炎菌、李斯特菌、金黄色葡萄球菌等致病菌的生长，为机体良好的内环境提供帮助，辅助延缓慢性炎症的进展。
44.本发明示例性的实施例中，提供一种用于治疗慢性阻塞性肺病的药物，包括保藏
编号为cgmcc:20160的戊糖片球菌smm914。
45.本发明还提供一种用于治疗慢性阻塞性肺病的药物的制备方法，包括以下步骤：
46.s1、将在-80℃冰箱保藏的戊糖片球菌smm914种放入预先置入冰块的烧杯中，缓慢融化，得到菌液；
47.s2、将s1得到的菌液用一次性涂布棒适量蘸取后，均匀涂抹至mrs固体培养板上；
48.s3、将s2得到的mrs固体培养板隔绝氧气，并于恒温培养箱中进行培养；
49.s4、在s3培养后的培养板中挑取单个菌落进行划线，隔绝氧气，并于恒温培养箱中培养，对菌落进行纯化处理，得到单克隆菌株；
50.s5、挑取部分s4得到的单克隆菌株，并转移至mrs液体培养基中振荡培养，得到处于生长平台期的戊糖片球菌液；
51.s6、当s5得到的戊糖片球菌液达到所需od值后，用pbs溶液洗涤、重悬菌体，得到所述药物。
52.优选地，所述步骤s3中，培养条件为：置于37℃培养箱中，先正置培养板30min后，倒置培养12～24h。
53.优选地，所述步骤s4中，培养条件为：置于37℃培养箱中先正置培养板30min后，倒置培养48h。
54.优选地，所述步骤s5中，用移液枪枪头挑取部分步骤s4所得单克隆菌株，转移至1ml的37℃的mrs液体培养基中，在37℃、900rpm条件下振荡培养12～18h，得到处于生长平台期的戊糖片球菌液。
55.优选地，通过以下方法，确定是否获得处于生长平台期的戊糖片球菌液：
56.在步骤s5培养的过程中，吸取500μl培养的戊糖片球菌液至比色皿中，提前用mrs液体培养基为溶剂校零后，在od
600 nm
处测定用2ml mrs培养基稀释5倍后菌液的od值，当od值乘以对应的稀释倍数后为109cfu/ml，即得到处于生长平台期的戊糖片球菌液。
57.优选地，若od值乘以对应的稀释倍数没有达到109cfu/ml，则继续培养，并再次测量od值，如此循环，直至得到处于生长平台期的戊糖片球菌液。
58.优选地，所述步骤s6中，洗涤、重悬菌体的过程为：室温离心步骤s5得到的处于生长平台期的戊糖片球菌液，弃去上清液，再将得到的菌体采用pbs溶液重复室温离心洗涤2次，将洗涤完成的菌体采用pbs溶液重悬。
59.在其中一个示例性的实施例中，用于治疗慢性阻塞性肺病的药物的制备方法包括：
60.将用接种环从-80℃保藏的戊糖片球菌种中沾取部分融化的菌液，均匀涂布至mrs固体培养板上，在37℃的细菌培养箱中倒置后过夜培养，得到大小适当、轮廓清晰的戊糖片球菌单菌落。
61.用一次性枪头挑取3～5个单菌落进行划线，在37℃的细菌培养箱中倒置后培养48h，得到扩大培养的纯化戊糖片球单克隆菌。从培养板的第一个划线处开始小心挑取部分菌体接种至mrs液体培养基中，在合适的培养温度和振荡速度下，12h后戊糖片球菌生长至平台期，用紫外分光光度计检测菌液的od
600 nm数值，所测细菌浓度的数量级达到109cfu/ml。
62.通过高速离心将菌体与mrs培养基分离，用与培养基等量的pbs溶液两次清洗菌
体，最后用等量的pbs溶液重悬不含培养基的纯净的戊糖片球菌。
63.通过给每只患有慢性阻塞性肺病的疾病模型小鼠灌胃200μl细菌悬液，试验结果证实该细菌无法在小鼠体内长期定殖，保证了生物安全性，同时，戊糖片球菌具有强大的抗氧化能力，能够调控谷胱甘肽代谢通路以及胆汁分泌，有效提高内源性活性氧的比例，降低小鼠体内的氧化应激水平。戊糖片球菌还能够抑制多种致病菌的生长，为机体良好的内环境提供帮助。
64.下面结合具体的实施例，对本发明作进一步的说明。
65.实施例1
66.[戊糖片球菌悬液制备]
[0067]
戊糖片球菌信息：保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmcc:20160，保藏日期为2020年06月30日。
[0068]
(1)将在-80℃冰箱保藏的戊糖片球菌种放入预先置入冰块的烧杯中，缓慢融化。
[0069]
(2)将步骤(1)中融化的菌液用一次性涂布棒适量蘸取后，均匀涂抹至mrs固体培养板上。
[0070]
(3)将步骤(2)涂布的固体培养板用一次性封口膜隔绝氧气，在37℃的细菌培养箱中倒置后过夜培养，得到大小适当、轮廓清晰的戊糖片球菌单菌落。
[0071]
(4)用一次性枪头挑取步骤(3)所得培养板中5个单菌落进行划线，用一次性封口膜隔绝氧气，在37℃的细菌培养箱中倒置后培养48h，得到扩大培养的纯化戊糖片球单克隆菌。
[0072]
(5)将步骤(4)中纯化得到的单克隆菌株，从培养板的第一个划线处开始，用移液枪枪头小心挑取部分菌体接种至1ml的37℃的mrs液体培养基中，在37℃、900rpm条件下振荡培养12h，12h后用紫外分光光度计检测菌液的od
600 nm数值。
[0073]
将在液体培养基中生长至平台期的戊糖片球菌液吸取500μl至比色皿中，提前用mrs液体培养基作为溶剂校零后，在od
600 nm处测定稀释5倍后菌液的od值。当所测od值乘以对应的稀释倍数后，细菌总数的数量级达到109cfu/ml，此时达到戊糖片球菌生长至平台期。
[0074]
(6)将步骤(5)所得产物在9000rpm、2min条件下，室温离心弃去上清(mrs液体培养基)，用1ml的pbs溶液以相同的条件(9000rpm、2min)洗涤2次后，用1ml的pbs溶液重悬菌体，戊糖片球菌悬液。
[0075]
以下实施例采用的戊糖片球菌悬液均采用实施例1的方法制备。
[0076]
实施例2
[0077]
[戊糖片球菌灌胃治疗慢性阻塞性肺病小鼠的功效测试]
[0078]
模型构建：从南京医科大学实验动物中心购买40只spf级，8周龄，体重约为28～30g的icr雌鼠进行实验，净化饲养一周后随机分为4个处理组(n＝10)。分别是pbs组(不进行烟熏+pbs灌胃)，smm914(不进行烟熏+戊糖片球菌灌胃)，copd pbs(烟熏处理+pbs灌胃)，copd smm914(烟熏处理+戊糖片球菌灌胃)。
[0079]
灌胃给药：小鼠适应性饲养一周后，造模前一周进行戊糖片球菌灌胃预处理。
[0080]
四个小组分别为对照组(pbs组)(pbs溶液，200μl/只)，戊糖片球菌实验组
(smm914)(戊糖片球菌悬液，200μl/只)，对照造模组(copd pbs)(pbs溶液，200μl/只)，戊糖片球菌实验造模组(copd smm914)(戊糖片球菌悬液，200μl/只)，采用一次性无菌的1ml注射器和8号灌胃针作为工具，先用无菌的pbs溶液润洗针筒，将针头倾斜45度插入小鼠口中，抵住上颌后轻微压迫小鼠的头部，使其躯体充分后仰(小鼠胸骨与注射器呈同一平面)，继续往下推送针头，直至灌胃针前端的三分之二(期间如遇阻碍，可以左右晃动或旋转，以正确找到出口)。从小鼠10周龄开始，每隔一天灌胃一次，直至实际造模天数达到100天。
[0081]
熏烟处理：每周五次，将需要烟熏处理组别的小鼠放于熏箱中，每次点燃1根烟，按顺序总共点燃3根香烟，熏烟的总时长保持在30min左右。
[0082]
造模100天后，使用wbp全身体积描记系统仪，分别检测各组小鼠的肺功能。
[0083]
分析ep50、penh数据，验证戊糖片球菌灌胃治疗慢性阻塞性肺病小鼠的功效。结果见图1、图2。
[0084]
由图1可知，pbs小鼠ef50(呼出50％肺活量时最大呼气流量)的数据平均值为7ml/s，与烟熏组小鼠(copd pbs和copd smm914)相比具有显著差异，证实烟熏小鼠出现了较为明显的慢性阻塞性肺病的症状。同时，戊糖片球菌处理后(copd smm914组)小鼠的ef50指数略高于对照造模组小鼠，证实戊糖片球菌对小鼠的气道阻塞情况具有一定的缓解效果。
[0085]
由图2可知，copd pbs组小鼠的penh(支气管收缩程度/增强呼气间歇)数值明显高于其他三组小鼠，证实吸入气体受阻力大，符合慢性阻塞性肺病的判断。戊糖片球菌处理组(copd smm914组)与其相比，气管收缩程度较低，受阻较小，能够良好的治疗并延缓慢性阻塞性肺病的发展进程。
[0086]
实施例3
[0087]
[h&e组织染色]
[0088]
为了更好的掌握小鼠造模的实际情况，分别于造模第40、70、100天分三批处死小鼠，取肺组织并将其置于4％的福尔马林组织固定液中，室温避光固定24h，进行h&e。结果见图3-8。
[0089]
由图3、4可知，烟熏40天后以对照组h&e染色图片中肺组织在正常状况下紧密清晰连结的组织结构为参考，戊糖片球菌实验组(copd smm914组)肺泡充血变多，肺泡腔扩大，出现局部肺大泡；对照造模组(copd pbs组)的肺间质中出现少量成团的淋巴细胞并存在较为明显的区域性肺泡扩张及充血；戊糖片球菌实验造模组(copd smm914组)虽然肺泡塌陷增多，但是炎症水平较轻。h&e染色结果表明，通过给小鼠灌胃戊糖片球菌可以在copd模型初期显著延缓该疾病的进展。
[0090]
由图5、6可知，烟熏70天后以对照组(pbs组)h&e染色图片中正常的肺组织形态为参考标准，对照实验组(copd pbs)小鼠的肺支气管周围血管明显扩张，且局部的肺间质中出现炎症细胞浸润，肺泡腔轻微塌陷。戊糖片球菌实验组(copd smm914)的小鼠肺泡腔出现轻微塌陷，进一步表明该菌可以有效缓解小鼠的copd进程。
[0091]
由图7、8可知，造模100天时，将参考对照组(pbs)h&e染色图片中正常的肺组织形态作为参考标准，戊糖片球菌实验组(copd smm914)肺泡腔出现少量塌陷、扩张和充血；对照造模组(copd pbs)肺泡腔充血增多，部分肺泡腔融合，淋巴组织增生形成淋巴滤泡，在肺间质中出现轻微炎症细胞浸润，而戊糖片球菌实验造模组(copd smm914)中小鼠的部分肺泡腔出现融合，同时炎症细胞少量浸润肺间质。对照造模组小鼠(copd pbs)在烟熏100天
后，肺部特征完全符合慢性阻塞性肺病小鼠的h&e病理图像判断标准，而经戊糖片球菌处理的小鼠的肺部的病理变化以及慢阻肺呼吸测试都远远低于copd的标准。
[0092]
实施例4
[0093]
[肠道菌群测定]
[0094]
在小鼠给与戊糖片球菌和烟熏前，取粪便样本置于-80℃冰箱中保存。当copd pbs处理组出现典型的copd症状后，再次取各组小鼠粪便样本，置于-80℃冰箱保存。统一整理编号后送至公司进行16srdna测序分析。结果见图9，图10，图11。
[0095]
由图9可知，shannon指数与alpha多样性相关，shannon值越大，说明群落多样性越高。通过对比造模100天时各组小鼠的shannon指数，戊糖片球菌上调了小鼠粪便中的微生物总体多样性，对各项生命活动具有促进作用。
[0096]
由图10可知，丰度位为20的菌科分别是saccharimonadaceae、helicobacteraceae(螺杆菌)、clostridiales-vadinbb60-group、akkermensiaceae、desulforibrionaceae(脱硫弧菌)、burkholderiaceae(伯克氏菌)、deferribacteraceae(脱铁杆菌)、moraxellaceae(莫拉氏菌)、eggerthellaceae(伊格尔兹氏菌)、bifidobacteriaceae(双歧杆菌科)、erysipelotrichaceae、prevotellaceae(普雷沃氏菌)、pseudomonadaceae(假单胞菌)、marinifilaceae(嗜胆菌)、rumino coccaceae(瘤胃球菌)、bacteroidaceae(拟杆菌科)、lachnospiraceae(毛螺菌科)、rikenellaceae、muribaculaceae、lactobacillaceae(乳酸菌科)。
[0097]
通过对比不同组别间菌科水平的变化，戊糖片球菌促进了乳酸杆菌科，erysipelotrichaceae，毛螺菌科相对丰度的增加。毛螺菌科(lachnospiraceae)细菌是能够参与多种碳水化合物的分解，为肠道中一种潜在的有益菌，能够通过产生短链脂肪酸尤其是丙酸以及特定的色氨酸代谢物i3a和kyna促进造血发生、肠道损伤修复，并可能有助于抗氧化性能的提升。erysipelotrichaceae是一类能够通过膳食纤维发酵产生丁酸等短链脂肪酸使其具有肠道保护性的共生菌株。其生产的短链脂肪酸通过产生抗炎细胞因子，诱导保护性免疫反应，有助于机体抵抗体内氧化应激水平增高导致的炎症反应。同时，戊糖片球菌显著降低了造模小鼠中拟杆菌科(bacteroidaceae)、普雷沃氏菌的丰度，拟杆菌科(bacteroidaceae)作为双向菌群，能够通过增加有利的细菌的存活，淘汰对机体不利的有害细菌，调节肠道菌群整体稳态，使其更适应高氧化应激水平下的环境需求。
[0098]
因此，戊糖片球菌通过其自身的强大的抗氧化能力以及调控肠道益生菌的能力，提高了小鼠的肺部抗氧化能力，从而有效延缓了小鼠的copd进程，为可能的临床应用奠定了重要基础。
[0099]
为了进一步验证戊糖片球菌的上述作用，建立了猪的copd模型，并进行测试。
[0100]
实施例5
[0101]
[戊糖片球菌灌胃治疗慢性阻塞性肺病仔猪的h&e组织染色]
[0102]
模型构建：选用楚沩香农牧股份有限公司饲养的1月龄(公母随机)杜长大商品猪进行实验，体重为75～80kg，将仔猪随机分为4组，每组3只。造模20周，造模前4周进行戊糖片球菌灌胃预处理。分别是pbs-1组(不进行造模+pbs灌胃)，smm914-1(不进行造模+戊糖片球菌灌胃)，copd pbs-1(造模处理+pbs灌胃)，copd smm914-1(造模处理+戊糖片球菌灌胃)。
[0103]
造模处理：将1月龄仔猪麻醉后仰卧于操作台上，使其气道充分暴露，通过喉镜辅助进行气管插管，并用塑料软管一次性注入5ml的3％胰蛋白酶溶液(300u/kg)，2天后用同样的插管方式，向气管内注入木瓜蛋白酶溶液(6u/kg)。以此为一个操作循环重复20周，构建杜长大商品猪的copd模型。
[0104]
灌胃给药：四个小组分别为对照组(pbs-1组)(pbs溶液，200ml/只)，戊糖片球菌实验组(smm914-1)(戊糖片球菌悬液，200ml/只)，对照造模组(copd pbs-1)(pbs溶液，200ml/只)，戊糖片球菌实验造模组(copd smm914-1)(戊糖片球菌悬液，200ml/只)，采用一次性无菌注射器和自制塑料软管作为工具，先用无菌的pbs溶液润洗注射器和塑料软管，将仔猪下颌抬至后仰位，充分暴露气管后，将塑料软管抵住仔猪上颚，适当旋转后倾斜45度顺势插入仔猪食道中，从仔猪一月龄开始，每三天灌胃一次，直至copd造模结束。
[0105]
7月龄时统一处死实验猪，取肺组织并将其置于4％的福尔马林组织固定液中，室温避光固定24h，进行h&e染色。结果见图11。
[0106]
由图11可知，将参考对照组(pbs-1组)h&e染色图片中正常的肺组织形态作为衡量标准，戊糖片球菌实验组(smm914-1组)中肺局部出现微小出血点，对照造模组(copd pbs-1组)肺间质可见弥漫性肺泡壁增厚、出血，细支气管周围和肺间质中可见大量炎症细胞浸润，与copd的病理定义相符合；戊糖片球菌实验造模组(copd smm914-1组)肺部出现局部出血点，少量炎症细胞浸润，以及局灶肺间质的增厚，较对照造模组疾病进程明显减缓。
[0107]
小鼠、猪、人同为哺乳动物，小鼠与人的基因相似度达到90％，猪与人的基因相似度达到95％。同时，猪与人体器官体积、解剖学和生理学指标具有高度的相似性。因此，我们先以小鼠为copd动物模型，验证戊糖片球菌的抗氧化性能，用仔猪进一步证实临床使用戊糖片球菌作为膳食用抗氧化剂治疗copd的可靠性。
[0108]
结合上述试验可知，糖片球菌smm914可应用于制备治疗哺乳动物慢性阻塞性肺病药物领域，哺乳动物包括但不限于人、鼠、猪。
[0109]
戊糖片球菌通过其自身的强大的抗氧化能力以及调控肠道益生菌的能力，提高了机体的肺部抗氧化能力，从而有效延缓了动物模型的copd进程，为可能的临床应用奠定了重要基础。
[0110]
虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明。本发明所属技术领域中具有通常知识者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作各种的更动与润饰。因此，本发明的保护范围当视权利要求书所界定者为准。

技术特征：
1.保藏编号为cgmcc:20160的戊糖片球菌smm914在制备治疗慢性阻塞性肺病药物中应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，戊糖片球菌smm914通过提高内源性活性氧的水平，提高肺部抗氧化能力，并通过调控肠道益生菌，改善肠道菌群组成，为机体良好的内环境提供帮助，从而有效延缓慢性阻塞性肺病的发展进程。3.一种用于治疗慢性阻塞性肺病的药物，其特征在于，包括保藏编号为cgmcc:20160的戊糖片球菌smm914。4.一种用于治疗慢性阻塞性肺病的药物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：s1、将在-80℃冰箱保藏的戊糖片球菌smm914种放入预先置入冰块的烧杯中，缓慢融化，得到菌液；s2、将s1得到的菌液用一次性涂布棒适量蘸取后，均匀涂抹至mrs固体培养板上；s3、将s2得到的mrs固体培养板隔绝氧气，并于恒温培养箱中进行培养；s4、在s3培养后的培养板中挑取单个菌落进行划线，隔绝氧气，并于恒温培养箱中培养，对菌落进行纯化处理，得到单克隆菌株；s5、挑取部分s4得到的单克隆菌株，并转移至mrs液体培养基中振荡培养，得到处于生长平台期的戊糖片球菌液；s6、当s5得到的戊糖片球菌液达到所需od值后，用pbs溶液洗涤、重悬菌体，得到所述药物。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤s3中，培养条件为：置于37℃培养箱中，先正置培养板30min后，倒置培养12～24h。6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤s4中，培养条件为：置于37℃培养箱中先正置培养板30min后，倒置培养48h。7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤s5中，用移液枪枪头挑取部分步骤s4所得单克隆菌株，转移至1ml的37℃的mrs液体培养基中，在37℃、900rpm条件下振荡培养12～18h，得到处于生长平台期的戊糖片球菌液。8.根据权利要求4或7所述的方法，其特征在于，通过以下方法，确定是否获得处于生长平台期的戊糖片球菌液：在步骤s5培养的过程中，吸取500μl培养的戊糖片球菌液至比色皿中，提前用mrs液体培养基为溶剂校零后，在od
600nm
处测定用2mlmrs培养基稀释5倍后菌液的od值，当od值乘以对应的稀释倍数后为109cfu/ml，即得到处于生长平台期的戊糖片球菌液。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，若od值乘以对应的稀释倍数没有达到109cfu/ml，则继续培养，并再次测量od值，如此循环，直至得到处于生长平台期的戊糖片球菌液。10.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤s6中，洗涤、重悬菌体的过程为：室温离心步骤s5得到的处于生长平台期的戊糖片球菌液，弃去上清液，再将得到的菌体采用pbs溶液重复室温离心洗涤2次，将洗涤完成的菌体采用pbs溶液重悬。

技术总结
本发明提供戊糖片球菌SMM914在制备治疗慢性阻塞性肺病药物中应用，该菌株可在慢性阻塞性肺病模型小鼠中发挥抗氧化作用并改善肠道菌群组成，克服了现有抗氧化剂无法高效的提高内源性氧化性的难题，拓宽了戊糖片球菌SMM914的使用范围，开发了一种有效、新的、无毒副作用的治疗慢性阻塞性肺病的药物。副作用的治疗慢性阻塞性肺病的药物。副作用的治疗慢性阻塞性肺病的药物。


技术研发人员：张允雷 刘怡婷 冯静
受保护的技术使用者：南京市江宁医院
技术研发日：2023.04.17
技术公布日：2023/8/9