猫冠状病毒单克隆抗体的制备方法及其应用

1.本公开涉及单克隆抗体制备的技术领域，尤其涉及一种猫冠状病毒单克隆抗体的制备方法及其应用。


背景技术：

2.猫冠状病毒(feline coronavirus，fcov)是一种正链rna病毒，属于冠状病毒科和甲型冠状病毒属，常见于猫中。fcov表现出两种致病形式：一种引起亚临床或轻度肠道感染；另一种引起致命的猫传染性腹膜炎(feline infectious peritonitis，fip)。低毒力形式称为猫肠道冠状病毒(feline enteric coronavirus，fecv)，而高毒力形式称为fipv。fipv以纤维蛋白性或肉芽肿性浆膜炎为特征，是一种致死性免疫介导性疾病，猫受感染后致死率很高，并在短时间内死亡。目前，针对fip无法进行准确、可靠的诊断，通常是基于疾病既往史调查，血液学实验及其他诊断方法共同辅助确诊。
3.与其他冠状病毒类似，fcov基因组有11个开放阅读框(open reading frame，orf)，编码4个结构蛋白：突刺蛋白(spike，s)、包膜(envelope，e)、膜蛋白(membrane，m)和核蛋白(nuceoprotein，n))和7个非结构蛋白：辅助蛋白3a、3b、3c、7a和7b以及复制酶1a和1b。s蛋白作为病毒表面最大的结构蛋白，是病毒进入宿主细胞的主要调节因子。s蛋白介导了病毒在入侵过程中通过其受体和膜融合与宿主细胞结合。研究表明，在病毒粒子与细胞表面受体结合后，s蛋白在通过膜融合入侵宿主细胞的过程中起着至关重要的生物学作用。此外，s蛋白含有抗原表位，在被感染的宿主体内调节抗体的产生并在抗原识别中发挥重要作用。
4.本技术人实验室前期成功构建出fcov-s蛋白片段重组表达质粒，获得fcov-s重组蛋白。本研究以纯化的fcov-s重组蛋白免疫balb/c小鼠，通过杂交瘤技术最终制备其单克隆抗体以及胶体金试纸条，可为fcov的诊断起到重要作用。有鉴于此，本发明人研究和设计出了一种猫冠状病毒单克隆抗体的制备方法及其应用。


技术实现要素：

5.本公开提供了了一种猫冠状病毒单克隆抗体的制备方法，通过本技术人前期首次发现的特异性抗原s重组蛋白为包被抗原，通过间接elisa方法筛选稳定分泌抗体的阳性杂交瘤细胞，并通过制备腹水，制得猫冠状病毒单克隆抗体。本公开还提供了一种猫冠状病毒单克隆抗体胶体金试纸条及其制备方法，可快速地进行fcov诊断。
6.根据本公开的一个方面，一种猫冠状病毒单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
7.步骤一、小鼠免疫
8.以fcov-s重组蛋白为包被抗原，取6周龄的balb/c小鼠采用皮下多点注射的免疫方式进行小鼠免疫，每只免疫100μg，每两周免疫一次；首次免疫与等体积的弗氏完全佐剂乳化均匀后免疫，此后的免疫与等体积的弗氏不完全佐剂乳化均匀后免疫，第三次免疫后，在融合细胞前的第三天加强免疫小鼠；第四次免疫7d后，小鼠尾尖静脉采血，采用间接
elisa法进行血清抗体效价测定；
9.步骤二、细胞融合及杂交瘤细胞的筛选
10.在细胞融合前1d，取balb/c小鼠的腹腔巨噬细胞，铺于96孔板中，作为饲养层细胞；取免疫小鼠脾细胞与sp2/0细胞以8∶1混合均匀，以质量体积分数为50％的peg3350作为融合剂，接种于含有饲养细胞的96孔培养板中,在融合后第3天和第6天换液用hat培养液，第9天和第12天换液改用ht培养液，第15天后用普通的完全培养液；采用间接elisa方法检测杂交瘤细胞培养孔上清液,使用有限稀释法进行克隆纯化，直到筛出能够稳定分泌抗体的阳性杂交瘤细胞株；
11.步骤三、腹水制备及纯化
12.将0.5ml石蜡油腹腔注射balb/c小鼠，7d后腹腔注射1
×
10 5
个阳性杂交瘤细胞；待小鼠腹腔隆起膨大后采集腹水，12000r/min离心10min；吸取中间层澄清透明的液体，通过proteing层析柱纯化抗体，使用binding/wash buffer洗涤，1/10洗脱液体积，收集洗脱液，加入中和buffer，调节ph到7.4，制得猫冠状病毒单克隆抗体；使用并通过间接elisa方法测定抗体效价，－70℃保存备用。
13.根据本公开的至少一个实施方式，所述步骤一中，所述间接elisa法进行血清抗体效价测定的方法为：以fcov-s重组蛋白为包被抗原，用包被缓冲液稀释至5μg/ml，包被于96孔酶标板，每孔100μl，37℃孵育2h；pbst洗涤3次；加入质量体积分数为5％的脱脂奶粉37℃孵育2h，pbst洗涤3次；加入稀释后的小鼠血清作为一抗，同时以空白小鼠血清作为阴性对照，37℃孵育1h，pbst洗涤3次，各孔加入山羊抗鼠igg，1∶8000稀释，37℃孵育2h，pbst洗涤3次，最后加入tmb显色液，充分显色后加入终止液，最后将酶标板放入酶标仪中，测定450nm处的吸光值。
14.根据本公开的至少一个实施方式，所述的制备方法还包括采用western blot法检测步骤三制得的猫冠状病毒单克隆抗体：使用fcov-s重组蛋白与loading buffer混合均匀，经sds-page并转印至硝酸纤维素膜，分别以待测的猫冠状病毒单克隆抗体为一抗，1:5000稀释；以山羊抗小鼠igg作为二抗，1∶20000稀释；dab显色液显色，以鉴定猫冠状病毒单克隆抗体是否特异性的识别fcov-s重组蛋白。
15.根据本公开的至少一个实施方式，所述的制备方法还包括猫冠状病毒单克隆抗体亚型的鉴定：用单克隆抗体亚型鉴定试剂盒鉴定进行亚型鉴定，以od450值判定不同亚型，得到猫冠状病毒单克隆抗体亚型为igg2b亚型。
16.根据本公开的至少一个实施方式，所述步骤三中，通过间接elisa方法测定抗体效价，抗体效价达1：256000。
17.根据本公开的一个方面，一种猫冠状病毒单克隆抗体胶体金试纸条，所述胶体金试纸条至少包括胶体金标记的猫冠状病毒单克隆抗体。
18.根据本公开的至少一个实施方式，所述胶体金粒径大小为20nm。
19.目前普通方法烧制的颗粒是在40nm左右，本技术人通过控制烧制时间20～25min以及还原法中加入柠檬酸三钠2.5～3.0ml，可以实现效果为粒径大小20nm粒径均匀，性质稳定，亲和力强，生物相容性好，易于生物分子固定修饰。胶金呈液体状，无胶状粘稠感，结合效率明显倍数提高。
20.根据本公开的一个方面，本一种猫冠状病毒单克隆抗体胶体金试纸条的制备方
法，包括以下步骤：
21.采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒溶液，标记量为6μg/ml胶体金溶液的单克隆抗体，搅拌30min，加入终浓度质量体积分数为0.4％的bsa溶液，以及终浓度质量体积分数为0.2％的peg-20000稳定未结合的胶体金颗粒，以2500r/min 4℃离心20min，再将上清转移到另一新的离心管中，8000r/min、4℃离心1h后，弃上清，再用含有质量体积分数为1％的bsa、质量体积分数为2％的蔗糖的tris-hcl溶液进行重悬，最终沉淀用重悬液稀释至原体积的10％；将标记好的胶体金溶液均匀涂布于金标垫上，37℃烘干30min备用；选用了1％bsa、2％蔗糖的tris-hcl溶液做为金标蛋白重悬液，保证了金标物液态稳定、干燥过程中稳定，以及干燥后的稳定并且最终充分释放；
22.将羊抗小鼠igg二抗和猫冠状病毒单克隆抗体分别以1mg/ml、0.32mg/ml浓度包被硝酸纤维素膜作为质控线c线和检测线t线，封闭液封闭1h后37℃烘干30min备用；将准备好的硝酸纤维素膜、样品垫、金标垫和吸水纸按顺序各部分重叠2mm粘贴到背衬板上，切条机切割成4mm条，组装成检测试纸条。
23.根据本公开的至少一个实施方式，所述样品垫、所述金标垫、所述吸水垫分别采用cb06、dl42及sx18。
24.本技术人通过不同型号膜在该产品的应用比较，选出比爬速和灵敏度最高的材料。样品垫、结合垫、吸水垫分别采用cb06、dl42、sx18，最早可在5min以内判读结果。
25.根据本公开的至少一个实施方式，所述封闭液为质量体积分数为含3％的bsa、质量体积分数为4％的蔗糖的tris-hcl溶液。
26.本技术人经过不同封闭液测试筛选，最终选出含3％bsa、4％蔗糖的tris-hcl溶液做为封闭液，将nc膜未结合蛋白的位点封闭，封闭完全，效果好。
27.根据本公开的一个方面，一种猫冠状病毒单克隆抗体胶体金试剂盒，所述试剂盒包括如前所述的试纸条，还包括样品稀释液，所述样品稀释液为含1％(单位为g/ml)的tween-20的tris缓冲液，该tris缓冲液0.01m，ph8.5
±
0.2。
28.采用上述技术方案之后，本公开具有以下有益效果：
29.本发明人以前期首次发现的特异性抗原s重组蛋白为包被抗原，通过间接elisa方法首次筛选出了稳定分泌猫冠状病毒抗体的阳性杂交瘤细胞，并通过制备腹水，首次制得了猫冠状病毒单克隆抗体，并以此猫冠状病毒单克隆抗体进行胶体金标记，制得了猫冠状病毒单克隆抗体胶体金试纸条，具有良好的敏感性、特异性，可为猫冠状病毒的临床快速诊断提供有效的检测方法。
附图说明
30.附图示出了本公开的示例性实施方式，并与其说明一起用于解释本公开的原理，其中包括了这些附图以提供对本公开的进一步理解，并且附图包括在本说明书中并构成本说明书的一部分。
31.图1是本公开的猫冠状病毒单克隆抗体的效价测定；
32.图2是本公开的小鼠免疫后血清抗体效价测定；
33.图3是本公开fcov-s重组蛋白的western blot鉴定结果；其中：m：蛋白质marker；1：fcov-s重组蛋白；
34.图4是本公开胶体金试纸条特异性检测结果；其中：1：pbs；2:fcov；3:猫瘟病毒；4：猫疱疹病毒；5：猫杯状病毒；
35.图5是本公开胶体金试纸条敏感性性检测结果；其中：1：稀释液；2：10稀释；3:10-2
稀释；4:10-3
稀释；5:10-4
稀释；6:10-5
稀释；7:10-6
稀释；8：10-7
稀释；9:10-8
稀释。
具体实施方式
36.下面结合附图和实施方式对本公开作进一步的详细说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于解释相关内容，而非对本公开的限定。另外还需要说明的是，为了便于描述，附图中仅示出了与本公开相关的部分。
37.需要说明的是，在不冲突的情况下，本公开中的实施方式及实施方式中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施方式来详细说明本公开。
38.实验材料
39.6周龄的balb/c雌性小鼠，购自上海吴氏动物实验室；proteing购于金斯瑞生物公司；fcov-s重组蛋白、sp2/0骨髓瘤细胞，由龙岩学院生命科学院小动物疾病研究室保存；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、hat、ht，购于sigma；抗体亚型检测试剂盒，购于southern biotech公司；tween-20、羊抗鼠抗体、rpmi-1640不完全细胞培养基，购于上海生工生物工程有限公司；tmb溶液、pbs、elution buffer、无菌石蜡、5x-tris甘氨酸电泳缓冲液，购于北京索莱宝科技有限公司；脱脂奶粉，购于碧云天生物技术有限公司；预制sds-page凝胶，购于北京全式金生物科技有限公司；胎牛血清(fbs)，购于浙江天杭生物科技有限公司；氯金酸、柠檬酸三钠，购于国药集团化学试剂有限公司；pvc板、硝酸纤维素(nc)膜、样品垫、吸水垫、金标垫，购于上海金标生物有限公司。
40.实施例1
41.一种猫冠状病毒单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
42.步骤一、小鼠免疫
43.以本技术人前期制备得到的fcov-s重组蛋白为包被抗原，该fcov-s重组蛋白的制备方法如本技术人的中国发明专利zl202110449837.4所述，取6周龄左右的balb/c小鼠采用皮下多点注射的免疫方式进行小鼠免疫，每只免疫100μg，每两周免疫一次；首次免疫与等体积的弗氏完全佐剂乳化均匀后免疫，此后的免疫与等体积的弗氏不完全佐剂乳化均匀后免疫，第三次免疫后，在融合细胞前的第三天加强免疫小鼠；第四次免疫7d后，小鼠尾尖静脉采血，采用间接elisa法进行血清抗体效价测定；
44.步骤二、细胞融合及杂交瘤细胞的筛选
45.在细胞融合前1d，取balb/c小鼠的腹腔巨噬细胞，铺于96孔板中，作为饲养层细胞；取免疫小鼠脾细胞与sp2/0细胞以8∶1混合均匀，以质量体积分数为50％(单位为g/ml)的peg3350作为融合剂，接种于含有饲养细胞的96孔培养板中,在融合后第3天和第6天换液用hat培养液，第9天和第12天换液改用ht培养液，第15天后用普通的完全培养液；采用间接elisa方法检测杂交瘤细胞培养孔上清液,使用有限稀释法进行克隆纯化，直到筛出能够稳定分泌抗体的阳性杂交瘤细胞株；
46.步骤三、腹水制备及纯化
47.将0.5ml石蜡油腹腔注射balb/c小鼠，7d后腹腔注射1
×
10 5
个阳性杂交瘤细胞；
待小鼠腹腔隆起膨大后采集腹水，12000r/min离心10min；吸取中间层澄清透明的液体，通过proteing层析柱纯化抗体，使用binding/wash buffer洗涤，1/10洗脱液体积，收集洗脱液，加入中和buffer，调节ph到7.4，制得猫冠状病毒单克隆抗体；使用并通过间接elisa方法测定抗体效价，－70℃保存备用。
48.根据本公开的至少一个实施方式，所述步骤一中，所述间接elisa法进行血清抗体效价测定的方法为：以fcov-s重组蛋白为包被抗原，用包被缓冲液稀释至5μg/ml，包被于96孔酶标板，每孔100μl，37℃孵育2h；pbst洗涤3次；加入质量体积分数为5％的脱脂奶粉37℃孵育2h，pbst洗涤3次；加入稀释后的小鼠血清作为一抗，同时以空白小鼠血清作为阴性对照，37℃孵育1h，pbst洗涤3次，各孔加入山羊抗鼠igg，1∶8000稀释，37℃孵育2h，pbst洗涤3次，最后加入tmb显色液，充分显色后加入终止液，最后将酶标板放入酶标仪中，测定450nm处的吸光值。
49.根据本公开的至少一个实施方式，所述的制备方法还包括采用western blot法检测步骤三制得的猫冠状病毒单克隆抗体：使用fcov-s重组蛋白与loading buffer混合均匀，经sds-page并转印至硝酸纤维素膜，分别以待测的猫冠状病毒单克隆抗体为一抗，1:5000稀释；以山羊抗小鼠igg作为二抗，1∶20000稀释；dab显色液显色，以鉴定猫冠状病毒单克隆抗体是否特异性的识别fcov-s重组蛋白。
50.根据本公开的至少一个实施方式，所述的制备方法还包括猫冠状病毒单克隆抗体亚型的鉴定：用单克隆抗体亚型鉴定试剂盒鉴定进行亚型鉴定，以od450值判定不同亚型，得到猫冠状病毒单克隆抗体亚型为igg2b亚型。
51.根据本公开的至少一个实施方式，所述步骤三中，通过间接elisa方法测定抗体效价，抗体效价达1：256000。
52.实施例2
53.一种猫冠状病毒单克隆抗体胶体金试纸条，所述胶体金试纸条至少包括胶体金标记的猫冠状病毒单克隆抗体。
54.根据本公开的至少一个实施方式，所述胶体金粒径大小为20nm。
55.目前普通方法烧制的颗粒是在40nm左右，本技术人通过控制烧制时间20～25min以及还原法中加入柠檬酸三钠2.5～3.0ml，可以实现效果为粒径大小20nm粒径均匀，性质稳定，亲和力强，生物相容性好，易于生物分子固定修饰。胶金呈液体状，无胶状粘稠感，结合效率明显倍数提高。
56.实施例3
57.一种猫冠状病毒单克隆抗体胶体金试纸条的制备方法，包括以下步骤：
58.采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒溶液，标记量为6μg/ml胶体金溶液的单克隆抗体，搅拌30min，加入终浓度质量体积分数为0.4％(单位为g/ml)的bsa溶液，以及终浓度质量体积分数为0.2％(单位为g/ml)的peg-20000稳定未结合的胶体金颗粒，以2500r/min 4℃离心20min，再将上清转移到另一新的离心管中，8000r/min、4℃离心1h后，弃上清，再用含有质量体积分数为1％(单位为g/ml)的bsa、质量体积分数为2％(单位为g/ml)的蔗糖的tris-hcl溶液进行重悬，最终沉淀用重悬液稀释至原体积的10％；将标记好的胶体金溶液均匀涂布于金标垫上，37℃烘干30min备用；选用了1％(单位为g/ml)bsa、2％(单位为g/ml)蔗糖的tris-hcl溶液做为金标蛋白重悬液，保证了金标物液态稳定、干燥过程中稳
定，以及干燥后的稳定并且最终充分释放；
59.将羊抗小鼠igg二抗和猫冠状病毒单克隆抗体分别以1mg/ml、0.32mg/ml浓度包被硝酸纤维素膜作为质控线c线和检测线t线，封闭液封闭1h后37℃烘干30min备用；将准备好的硝酸纤维素膜、样品垫、金标垫和吸水纸按顺序各部分重叠2mm粘贴到背衬板上，切条机切割成4mm条，组装成检测试纸条。
60.根据本公开的至少一个实施方式，所述样品垫、所述金标垫、所述吸水垫分别采用cb06、dl42及sx18。
61.本技术人通过不同型号膜在该产品的应用比较，选出比爬速和灵敏度最高的材料。样品垫、结合垫、吸水垫分别采用cb06、dl42、sx18，最早可在5min以内判读结果。
62.根据本公开的至少一个实施方式，所述封闭液为质量体积分数为含3％的bsa、质量体积分数为4％的蔗糖的tris-hcl溶液。
63.本技术人经过不同封闭液测试筛选，最终选出含3％bsa、4％蔗糖的tris-hcl溶液做为封闭液，将nc膜未结合蛋白的位点封闭，封闭完全，效果好。
64.实施例4
65.一种猫冠状病毒单克隆抗体胶体金试剂盒，所述试剂盒包括如实施例3所述的的试纸条，还包括样品稀释液，所述样品稀释液为含1％(单位为g/ml)的tween-20的tris缓冲液，该tris缓冲液0.01m，ph8.5
±
0.2；起到促进释放的作用，加快了检测速度。
66.为了比对采用本公开样品稀释液与传统稀释液的检测时间，比较了分别采用(1)pbs；(2)2.0％ nacl，1.0％吐温20，0.3％edta的稀释液，经比对发现，采用(1)和(2)的稀释液，检测时间均为8min；而采用本公开的稀释液(含1％的tween-20的tris缓冲液)，检测时间为5min。
67.单克隆抗体的筛选
68.免疫的balb/c鼠脾细胞与sp2/0细胞融合后，间接elisa方法筛选阳性的杂交瘤细胞，经过三次亚克隆后筛选到1株能稳定分泌抗fcov-s重组蛋白的杂交瘤细胞株。1株杂交瘤细胞制备小鼠腹水，间接elisa方法测定抗体效价。结果如图1所示，随着抗原包被浓度降低以及腹水稀释倍数增高，od450值不断降低，抗体效价达1：256000。
69.间接elisa法血清抗体效价测定
70.间接elisa法测定小鼠第四轮免疫增强后血清抗体滴度，通过spss统计分析，结果表明小鼠经四轮免疫增强后血清抗体滴度与空白对照组具有统计学差异p《0.05，结果如图2所示。
71.western blot法检测猫冠状病毒单克隆抗体
72.western blotting检测结果显示，筛选得到的杂交瘤细胞株单克隆抗体能与fcov-s重组蛋白发生特异性反应，在约32kda处出现特异条带，与实验前期制备的fcov-s重组蛋白约在32kda的条件下成功表达和纯化一致，结果如图3所示。
73.单克隆抗体亚型的鉴定
74.用单克隆抗体亚型检测试剂盒对筛选得到的杂交瘤细胞株分泌的抗体进行亚型分析，通过测定制备到的抗体与试剂盒中不同类型的抗体的结合值，可以得出igg2b的值最高，其细胞株分泌的抗体为igg2b亚型，结果如表1所示。
75.表1单克隆抗体亚型鉴定结果(od450值)
[0076][0077]
胶体金检测试纸条的评价
[0078]
特异性试验：
[0079]
试纸条检测fcov为阳性，猫瘟病毒、猫疱疹病毒、猫杯状病毒，pbs均为阴性，说明试纸条有良好的特异性，结果如图4所示。
[0080]
敏感性试验：
[0081]
将fcov阳性血清10倍稀释，每个稀释度取100μl样品进行检测，检测结果显示稀释至10-7
仍出现条带，试纸条检测的敏感性是10-7
，具有良好的敏感性，结果如图5所示。
[0082]
本公开通过将表达纯化的fcov-s重组蛋白为包被抗原进行小鼠免疫，取其淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以重组纯化的fcov-s蛋白为包被抗原，通过间接elisa方法筛选稳定分泌抗体的阳性杂交瘤细胞，制备腹水，检测腹水中抗体效价。用单克隆抗体亚型鉴定试剂盒对腹水中抗体进行单克隆抗体亚型鉴定，用western blot和间接免疫荧光评价单克隆抗体对fcov结合活性。结果表明fcov-s单克隆抗体具有良好的特异性，获得的杂交瘤细胞株经过三次亚克隆之后杂交瘤细胞的阳性率达到100％，每次的细胞效价稳定且高效价，经鉴定该株单克隆抗体属于ig g2a亚型。
[0083]
本公开建立的胶体金免疫层析检测方法与传统pcr方法相比，具有不需要任何仪器设备、检测时间短，10min内即可定结果、检测成本低、操作简单、不需要专业的技术人员等优点。本公开结果表明，制备的胶体金试纸条检测猫瘟病毒、猫疱疹病毒、猫杯状病毒的结果均为阴性，试纸条检测的敏感性是10-7
，说明其具有良好的敏感性、特异性。对于fcov表现出两种致病形式：fip和fecv，其中fip致死率高，临床上无有效诊断方案，本公开制备的猫冠状病毒胶体金试纸条在其快速诊断方面作用更为明显，对于fcov早期诊断具有重要意义。
[0084]
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例/方式”、“一些实施例/方式”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例/方式或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本技术的至少一个实施例/方式或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例/方式或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例/方式或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例/方式或示例以及不同实施例/方式或示例的特征进行结合和组合。
[0085]
本领域的技术人员应当理解，上述实施方式仅仅是为了清楚地说明本公开，而并非是对本公开的范围进行限定。对于所属领域的技术人员而言，在上述公开的基础上还可以做出其它变化或变型，并且这些变化或变型仍处于本公开的范围内。

技术特征：
1.一种猫冠状病毒单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、小鼠免疫以fcov-s重组蛋白为包被抗原，取6周龄的balb/c小鼠采用皮下多点注射的免疫方式进行小鼠免疫，每只免疫100μg，每两周免疫一次；首次免疫与等体积的弗氏完全佐剂乳化均匀后免疫，此后的免疫与等体积的弗氏不完全佐剂乳化均匀后免疫，第三次免疫后，在融合细胞前的第三天加强免疫小鼠；第四次免疫7d后，小鼠尾尖静脉采血，采用间接elisa法进行血清抗体效价测定；步骤二、细胞融合及杂交瘤细胞的筛选在细胞融合前1d，取balb/c小鼠的腹腔巨噬细胞，铺于96孔板中，作为饲养层细胞；取免疫小鼠脾细胞与sp2/0细胞以8∶1混合均匀，以质量体积分数为50％的peg3350作为融合剂，接种于含有饲养细胞的96孔培养板中,在融合后第3天和第6天换液用hat培养液，第9天和第12天换液改用ht培养液，第15天后用普通的完全培养液；采用间接elisa方法检测杂交瘤细胞培养孔上清液,使用有限稀释法进行克隆纯化，直到筛出能够稳定分泌抗体的阳性杂交瘤细胞株；步骤三、腹水制备及纯化将0.5ml石蜡油腹腔注射balb/c小鼠，7d后腹腔注射1
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个阳性杂交瘤细胞；待小鼠腹腔隆起膨大后采集腹水，12000r/min离心10min；吸取中间层澄清透明的液体，通过proteing层析柱纯化抗体，使用binding/wash buffer洗涤，1/10洗脱液体积，收集洗脱液，加入中和buffer，调节ph到7.4，制得猫冠状病毒单克隆抗体；使用并通过间接elisa方法测定抗体效价，－70℃保存备用。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤一中，所述间接elisa法进行血清抗体效价测定的方法为：以fcov-s重组蛋白为包被抗原，用包被缓冲液稀释至5μg/ml，包被于96孔酶标板，每孔100μl，37℃孵育2h；pbst洗涤3次；加入质量体积分数为5％的脱脂奶粉37℃孵育2h，pbst洗涤3次；加入稀释后的小鼠血清作为一抗，同时以空白小鼠血清作为阴性对照，37℃孵育1h，pbst洗涤3次，各孔加入山羊抗鼠igg，1∶8000稀释，37℃孵育2h，pbst洗涤3次，最后加入tmb显色液，充分显色后加入终止液，最后将酶标板放入酶标仪中，测定450nm处的吸光值。3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的制备方法还包括采用western blot法检测步骤三制得的猫冠状病毒单克隆抗体：使用fcov-s重组蛋白与loading buffer混合均匀，经sds-page并转印至硝酸纤维素膜，分别以待测的猫冠状病毒单克隆抗体为一抗，1:5000稀释；以山羊抗小鼠igg作为二抗，1∶20000稀释；dab显色液显色，以鉴定猫冠状病毒单克隆抗体是否特异性的识别fcov-s重组蛋白。4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的制备方法还包括猫冠状病毒单克隆抗体亚型的鉴定：用单克隆抗体亚型鉴定试剂盒鉴定进行亚型鉴定，以od450值判定不同亚型，得到猫冠状病毒单克隆抗体亚型为igg2b亚型。5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤三中，通过间接elisa方法测定抗体效价，抗体效价达1：256000。6.一种猫冠状病毒单克隆抗体胶体金试纸条，其特征在于，所述胶体金试纸条至少包括胶体金标记的如权利要求1所述的猫冠状病毒单克隆抗体。
7.如权利要求6所述的胶体金试纸条，其特征在于，所述胶体金粒径大小为20nm。8.一种如权利要求6或7所述的猫冠状病毒单克隆抗体胶体金试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒溶液，标记量为6μg/ml胶体金溶液的单克隆抗体，搅拌30min，加入终浓度质量体积分数为0.4％的bsa溶液，以及终浓度质量体积分数为0.2％的peg-20000稳定未结合的胶体金颗粒，以2500r/min 4℃离心20min，再将上清转移到另一新的离心管中，8000r/min、4℃离心1h后，弃上清，再用含有质量体积分数为1％的bsa、质量体积分数为2％的蔗糖的tris-hcl溶液进行重悬，最终沉淀用重悬液稀释至原体积的10％；将标记好的胶体金溶液均匀涂布于金标垫上，37℃烘干30min备用；将羊抗小鼠igg二抗和猫冠状病毒单克隆抗体分别以1mg/ml、0.32mg/ml浓度包被硝酸纤维素膜作为质控线c线和检测线t线，封闭液封闭1h后37℃烘干30min备用；将准备好的硝酸纤维素膜、样品垫、金标垫和吸水纸按顺序各部分重叠2mm粘贴到背衬板上，切条机切割成4mm条，组装成检测试纸条。9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述封闭液为质量体积分数为含3％的bsa、质量体积分数为4％的蔗糖的tris-hcl溶液。10.一种猫冠状病毒单克隆抗体胶体金试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求6或7所述的试纸条，还包括样品稀释液，所述样品稀释液为含1％的tween-20的tris缓冲液，所述tris缓冲液0.01m，ph8.5
±
0.2。

技术总结
本公开提供了一种猫冠状病毒单克隆抗体的制备方法，包括小鼠免疫、细胞融合及杂交瘤细胞的筛选及腹水制备及纯化步骤，首次制得了猫冠状病毒单克隆抗体。本公开还提供了一种猫冠状病毒单克隆抗体胶体金试纸条及其制备方法，制备的胶体金试纸条具有良好的敏感性、特异性，可以快速诊断猫冠状病毒FCoV。可以快速诊断猫冠状病毒FCoV。可以快速诊断猫冠状病毒FCoV。


技术研发人员：邓海燕 林炜明 颜筱舫 莫婷婷 李妍 苏格霖 陈伊妮 陈玉芩 洪婉萌
受保护的技术使用者：龙岩学院
技术研发日：2023.06.13
技术公布日：2023/8/13