发酵乳杆菌grx08及其热灭活菌在制备缓解/治疗肝损伤药物中的应用

1.本发明属于肝损伤治疗药物领域，涉及一种发酵乳杆菌grx08及其热灭活菌在制备缓解/治疗肝损伤药物中的应用。


背景技术：

2.化疗是目前对恶性肿瘤较为有效而又普遍使用的一种治疗方法。环磷酰胺是一种常用的烷化类抗肿瘤化疗药物，其具有细胞毒性，在肝微粒体酶的催化下能分解释放出具有强烷化作用的氯乙基磷酰胺，能杀死有丝分裂的细胞，具有强免疫抑制作用。但环磷酰胺等化疗药物均会在治疗疾病的同时降低机体的免疫能力，并造成了肝损伤。
3.现有的研究表明，一些益生菌和热灭活的益生菌具有抗氧化的能力，可以缓解非酒精性肝损伤和急性酒精肝损伤等肝脏损伤。不同于脂质氧化以及乙醇代谢造成的肝脏损伤，环磷酰胺代谢生成的肝毒性化合物丙烯醛，能提高氨基转移酶的含量，进而导致肝小叶中心充血，肝细胞死亡，同时丙烯醛还会增加机体活性氧的水平，破坏线粒体功能，继而引发肝脏的氧化损伤和细胞凋亡。
4.益生菌和热灭活益生菌的益生功能具有菌株特异性，对不同益生菌缓解肝损伤的一项比较研究中发现，不同益生菌的抗氧化能力不同，其对肝损伤的缓解作用存在差异，具有菌株特异性；且部分益生菌热灭活后其对肝损伤的缓解效应并不能完全保持(chen x,zhang j,yi r,et al.hepatoprotective effects of lactobacillus on carbon tetrachloride-inducedacute liver injury in mice[j].int j mol sci,2018,19(8):2212.)。因而缺乏针对缓解环磷酰胺引起的肝脏损伤的益生菌以及热灭活菌株的筛选。
[0005]
与此同时，热灭活益生菌的应用也逐渐成为研究的热点，热灭活益生菌相较于活菌具有更好的安全性以及稳定性，能够保证其功能特性的稳定发挥，同时也可与抗生素同时使用，相较于活菌更适合化疗病人使用，且具有更为广泛的应用前景。


技术实现要素：

[0006]
本发明提供一种发酵乳杆菌grx08及其热灭活菌在制备缓解/治疗肝损伤药物中的应用。
[0007]
本发明所述的发酵乳杆菌grx08，保藏编号为cgmcc no：7695，已在中国专利zl201310309222.7中充分公开。
[0008]
本发明所述的肝损伤为化疗药物所致肝损伤。
[0009]
本发明所述的化疗药物为环磷酰胺。
[0010]
本发明首次发现发酵乳杆菌grx08及其热灭活菌体能够降低肝脏脏器指数，恢复了血清转氨酶水平，清除肝脏自由基、减少肝脏氧化产物、调节肝脏谷胱甘肽组成比例并增强解毒酶活性，同时减少肝脏脂质堆积和缓解炎症反应，进而缓解环磷酰胺所致的肝脏损伤。发酵乳杆菌grx08及其热灭活菌体适用于制备缓解/治疗肝损伤药物中的应用。
附图说明
[0011]
图1为大鼠脏器指数测定图，*表示与模型组相比呈显著性差异(p＜0.05)，下同。
[0012]
图2为大鼠肝脏自由基水平测定图。
[0013]
图3为大鼠肝脏氧化产物测定图。
[0014]
图4为大鼠肝脏谷胱甘肽及其相关酶测定图。
[0015]
图5为大鼠肝脏脂质堆积测定图。
[0016]
图6为大鼠肝脏炎症因子测定图。
具体实施方式
[0017]
发明人前期研究已经发现发酵乳杆菌grx08(保藏编号为cgmcc no：7695)具有辅助降血脂的功能(中国专利zl201310309222.7)。
[0018]
本发明通过进一步研究发现该菌株能够缓解化疗药物所致肝损伤的功能，同时利用动物实验来研究发酵乳杆菌grx08在体内缓解化疗药物所致肝损伤的效果。本发明通过腹腔注射环磷酰胺(100mg/kg体重)建立化疗药物所致肝损伤大鼠模型，灌胃发酵乳杆菌grx08菌悬液和热灭活菌体后，记录大鼠体重及免疫器官重量，测定大鼠血清中丙氨酸氨基转移酶(alt)、天门冬氨酸氨基转移酶(ast)的含量。同时取肝脏组织，制备组织匀浆，测定肝脏中一氧化碳(no)、超氧阴离子(o
2-)、活性氧(ros)、丙二醛(mda)、还原型谷胱甘肽(gsh)、氧化型谷胱甘肽(gssg)和谷胱甘肽s-转移酶(gst)以及炎症因子肿瘤坏死因子-ɑ
(tnf-ɑ
)、白细胞介素-6(il-6)和核因子κb(nf-κb)的含量或活性，从而评价发酵乳杆菌grx08的体内缓解化疗药物所致肝损伤的效果。
[0019]
下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详述。
[0020]
实施例1
[0021]
1.灌胃样品制备
[0022]
将保藏的发酵乳杆菌grx08活化后，按3％的接种量接种到mrs液体培养基中，37℃培养18h后，4000
×
g离心10min后收集菌体。
[0023]
发酵乳杆菌grx08菌悬液的制备：用生理盐水悬浮收集菌体并进行菌落计数，饲喂前用生理盐水稀释至1
×
109cfu/ml。
[0024]
发酵乳杆菌grx08热灭活菌悬液的制备：配置好的发酵乳杆菌grx08菌悬液，80℃热灭活20min。
[0025]
药物对照组灌胃液的配制：取50粒联苯双酯，溶于20ml生理盐水中，现配现用。
[0026]
2.动物分组及建模
[0027]
spf级wistar雄性大鼠35只，饲养在通风、透光和清洁卫生，室温为23.0
±
1.0℃，湿度为50
±
5％的动物房中，并用一周时间适应性饲喂基础饲料(面粉20％、米粉10％、玉米20％、鼓皮26％、豆料20％、鱼粉2％、骨粉2％)，适应有规律的12h白天/12h黑夜的循环，然后按各组间平均体重无显著差异重新分组，通过腹腔注射环磷酰胺(100mg/kg体重，1次)建立环磷酰胺诱导的化学肝损伤模型，建模后分别使用发酵乳杆菌grx08菌悬液和热灭活菌体进行灌胃作为实验组，空白组和模型组给予生理盐水，阳性对照组给予联苯双酯滴丸溶液，干预时间为4周。分组及处理如表1所示。
[0028]
表1动物实验分组
[0029][0030]
注：灌胃量为每100g大鼠体重灌胃1ml。
[0031]
3.试验结果表征
[0032]
(1)大鼠脏器指数
[0033]
称取大鼠体重以及脏器重量，计算脏器指数，脏器指数＝脏器重量(g)/体重(100g)，结果如表2所示。
[0034]
表2大鼠脏器指数
[0035][0036]
同列比较，*表示与模型组相比呈显著性差异(p＜0.05)
[0037]
由表2可知，与空白组相比，模型组肝脏指数显著增加(p＜0.05)，发酵乳杆菌grx08及其热灭活菌体干预后，大鼠肝脏指数较模型组均显著降低(p＜0.05)。各受试组肾脏指数和心脏指数均无显著性差异(p＞0.05)。
[0038]
(2)大鼠肝功能情况
[0039]
肝脏是药物代谢的主要器官，环磷酰胺等化学药物会严重损害肝脏，alt和ast是反映肝脏损伤的重要指标，当肝脏遭受损伤时，会引起血液中alt和ast的升高。取大鼠血清，使用全自动生化分析仪测定各组大鼠血清中丙氨酸氨基转移酶(alt)、天门冬氨酸氨基转移酶(ast)的含量。由图1可知，与空白组相比，模型组大鼠血清ast均显著性降低(p＜0.05)，alt含量显著性增加(p＜0.05)。与模型组相比，发酵乳杆菌grx08及其热灭活菌体干
预后，大鼠alt含量显著降低(p＜0.05)，由56.25u/l降至44.25u/l和46.00u/l；同时大鼠ast的含量显著增加(p＜0.05)，由153.50u/l恢复至192.75u/l和204.00u/l。上述结果说明，发酵乳杆菌grx08及其热灭活菌体恢复了大鼠转氨酶水平。
[0040]
(3)大鼠肝脏的自由基水平
[0041]
通过酶系统或者非酶系统，机体会产生氧阴离子自由基、no自由基等大量自由基。这些自由基会攻击生物膜中的不饱和脂肪酸，从而引发脂质过氧化作用，形成脂质过氧化物，消耗体内的抗氧化物质，并可引起生物膜损害、线粒体功能紊乱、atp合成障碍等，导致细胞坏死和凋亡。取大鼠肝脏，组织匀浆，使用一氧化碳测定试剂盒和超氧阴离子测定试剂盒测定大鼠肝脏中自由基no和o
2-的含量。由图2可知，与空白组相比，大鼠肝脏中no和o
2-的含量均显著增加(p＜0.05)，发酵乳杆菌grx08及其热灭活菌体干预后，大鼠肝脏中no和o
2-的含量较模型组均显著降低(p＜0.05)，其中no含量由0.24μmol/g降至0.13μmol/g和0.16μmol/g，o
2-的含量由0.15μmol/min/g降至0.05μmol/min/g和0.09μmol/min/g。上述结果说明，发酵乳杆菌grx08及其热灭活菌体能够清除自由基。
[0042]
(4)大鼠肝脏的氧化产物水平
[0043]
ros是指在生物体内与氧代谢有关的、含氧自由基和易形成自由基的过氧化物的总称。机体内活性氧含量过高会造成机体的氧化损伤，丙二醛(mda)作为自由基引起的脂质过氧化反应的产物，其含量可反映机体内氧化损伤的程度，可间接反映肝脏细胞受自由基攻击的严重程度。取大鼠肝脏，组织匀浆，使用活性氧elisa试剂盒和丙二醛测定试剂盒测定大鼠肝脏中氧化产物ros和mda的含量。由图3可知，与空白组相比，对大鼠肝脏中氧化产物ros和mda的含量均显著上升。与模型组相比，发酵乳杆菌grx08及其热灭活菌体干预后，大鼠肝脏中ros和mda的含量显著降低(p＜0.05)，其中ros的含量(荧光强度)由350.53降至285.15和246.53，mda的含量由429.67nmol/g降至148.12nmol/g和315.33nmol/g。发酵乳杆菌grx08及其热灭活菌体能够减少氧化产物。
[0044]
(5)大鼠肝脏的谷胱甘肽及相关酶的水平
[0045]
gsh是肝细胞内最主要的抗氧化巯基物质，在抗氧化、蛋白质巯基保护和氨基酸跨膜运输等中具有重要作用。还原型与氧化型比值(gsh/gssg)是细胞氧化还原状态的主要动态指标。因此，测定gsh和gssg含量以及gsh/gssg比值，能够很好地反映肝细胞所处的氧化还原状态。gst是体内解毒酶系统的重要组成部分，在保护肝细胞免受亲电子化合物的损伤中发挥着重要的生物学功能。取大鼠肝脏，组织匀浆，使用还原型谷胱甘肽含量检测试剂盒、氧化型谷胱甘肽含量检测试剂盒和谷胱甘肽s-转移酶活性检测试剂盒测定大鼠肝脏中gsh、gssg和gst的活性，并计算gsh/gssg。由图4可知，与空白组相比，大鼠gsh/gssg和gst的活性均显著降低(p＜0.05)。与模型组相比，发酵乳杆菌grx08及其热灭活菌体干预均显著升高了gsh/gssg以及gst的活性(p＜0.05)，其中gsh/gssg由0.73升至0.94和1.55，gst的活性则由11.07u/g增至13.01u/g和13.70u/g。上述结果说明，发酵乳杆菌grx08及其热灭活菌体能够增强机体的抗氧化能力和解毒作用。
[0046]
(6)大鼠肝脏的脂质堆积情况
[0047]
肝脏是维持机体碳水化合物，脂质和蛋白质代谢平衡的重要器官，化学性肝损伤会导致肝脏中脂肪的积蓄，其中主要以甘油三酯的堆积为主。取大鼠肝脏，组织匀浆，使用全自动生化分析仪测定大鼠肝脏中tc和tg的含量。由图5可知，各受试组大鼠肝脏tc含量无
显著性变化(p＞0.05)。与空白组相比，模型组大鼠肝脏tg含量显著升高(p＜0.05)，发酵乳杆菌grx08及其热灭活菌体干预后，大鼠肝脏tg含量较模型组均显著降低(p＜0.05)，由0.72mmol/l降至0.65mmol/l和0.57mmol/l。上述结果说明，发酵乳杆菌grx08及其热灭活菌体缓解了环磷酰胺引起的肝脏脂质堆积。
[0048]
(7)大鼠肝脏的炎症反应情况
[0049]
细胞因子是机体防御系统的重要组成部分，既是免疫反应的产物，又可以增强免疫反应。tnf-α和il-6具有广泛的生物学活性，被认为是反映炎性反应严重程度的重要指标，nf-κb作为一种多功能的细胞转录因子，在炎症反应、细胞凋亡等病理生理中起着重要作用。取大鼠肝脏，组织匀浆，使用elisa试剂盒测定大鼠肝脏中炎症因子tnf-ɑ
，il-6和nf-κb的含量。由图6可知，与空白组相比，模型组大鼠血清中tnf-ɑ
，il-6和nf-κb的含量均显著性增加(p＜0.05)。与模型组相比，发酵乳杆菌grx08及其热灭活菌体干预均能显著降低大鼠血清中tnf-ɑ
、il-6和nf-κb的含量(p＜0.05)，其中，tnf-ɑ
的含量由291.27pg/ml降至224.86pg/ml和227.12pg/ml，il-6的含量由137.85pg/ml降至104.07pg/ml和1053.52pg/ml，nf-κb的含量由1179.67pg/ml降至941.17pg/ml和737.40pg/ml。上述结果说明，发酵乳杆菌grx08及其热灭活菌体缓解了环磷酰胺引起的肝脏炎症反应。

技术特征：
1.发酵乳杆菌grx08及其热灭活菌在制备缓解/治疗肝损伤药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，肝损伤为化疗药物所致肝损伤。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的化疗药物为环磷酰胺。

技术总结
本发明公开了一种发酵乳杆菌grx08及其热灭活菌在制备缓解/治疗肝损伤药物中的应用。发酵乳杆菌grx08及其热灭活菌能够降低肝脏脏器指数，恢复了血清转氨酶水平，清除肝脏自由基、减少肝脏氧化产物、调节肝脏谷胱甘肽组成比例并增强解毒酶活性，同时减少肝脏脂质堆积和缓解炎症反应，进而缓解环磷酰胺所致的肝脏损伤，适用于制备缓解/治疗肝损伤药物中的应用。用。用。


技术研发人员：顾瑞霞 瞿恒贤 张龙飞 刘潇潇 刘洋 陈大卫 黄玉军
受保护的技术使用者：扬州大学
技术研发日：2023.06.02
技术公布日：2023/8/13