基于甘西鼠尾草转录组序列开发的EST-SSR分子标记、引物及应用的制作方法

基于甘西鼠尾草转录组序列开发的est-ssr分子标记、引物及应用
技术领域
1.本发明属于植物分子生物学和植物基因工程技术领域，具体涉及基于甘西鼠尾草转录组序列开发的est-ssr分子标记、引物及应用。


背景技术：

2.甘西鼠尾草为唇形科植物甘西鼠尾草salvia przewalskii maxim.的干燥根。分布于甘肃、青海、四川、云南、西藏等地。甘西鼠尾草中含有的化学成分主要有丹参素钠、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸b、二氢丹参酮ⅰ、隐丹参酮、丹参酮ⅰ、丹参酮ⅱa、ⅱb、羟基丹参酮、丹参酸甲酯、紫丹参酯a、b，亚甲基丹参醌，1,2-二氢丹参酯，齐墩果酸、紫丹参萜酸a、b，丹参新酯b、丹参内酯、去甲丹参酮和紫丹参蒽醌等。甘西鼠尾草具有活血祛瘀，消肿止痛，养血安神之功效，用于月经不调，痛经，闭经，症瘕，产后瘀阻，胸腹或肢体瘀血疼痛，痈肿疮毒，心烦失眠。甘西鼠尾草与丹参是同科同属的近源物种，丹参的基因组和转录组已有公开研究的论文发表，且已开发出83对est-ssr位点的特殊引物。李文渊等研究者曾研究过甘西鼠尾草issr-pcr反应体系的建立与优化，但基于转录组研究数据开发的est-ssr引物及基因产物还未开展相关研究，尚未开发出应用在甘西鼠尾草种植资源鉴定、遗传图谱构建、功能基因定位等功能性稳定高效的特异性分子标记体系。
3.表达序列标签ssr(est-ssr)源于基因的转录编码区，与大量基因组ssr的筛选和多态性的克隆筛选相比，基于植物转录组数据开发的ssr具有经济高效低成本的优点，更容易获得基因表达的信息和ssr引物序列，在唇形科植物中，比如丹参、云南鼠尾草、溪黄草和仙草等已有不少研究，est-ssr引物和分子标记的开发且可为异同种植资源的鉴定、亲缘关系、遗传多样性评价、分子育种、基因定位克隆及功能基因的直接鉴定提供重要的依据。


技术实现要素：

4.针对上述现有技术存在的问题，本发明提供了基于甘西鼠尾草转录组序列开发的est-ssr分子标记、引物及应用。
5.本发明的第一方面，提供基于甘西鼠尾草转录组序列开发的est-ssr分子标记，所述est-ssr分子标记为rzewssr02、przewssr03、przewssr04、przewssr05、przewssr08、przewssr09、przewssr10、przewssr11、przewssr15，核苷酸序列依次如seq id no.1-9所示。
6.本发明的第二方面，提供所述est-ssr分子标记的扩增引物，所述扩增引物的核苷酸序列依次如seq id no.10-27所示。
7.本发明的第三方面，提供包含所述扩增引物的试剂盒。
8.本发明的第四方面，提供所述est-ssr分子标记、所述扩增引物或所述试剂盒的如下任一应用：
9.a1)在甘西鼠尾草品种鉴定中的应用；
10.a2)在甘西鼠尾草遗传图谱或分子身份证构建中的应用；
11.a3)在甘西鼠尾草遗传育种中的应用；
12.a4)在甘西鼠尾草亲缘关系或遗传多样性分析中的应用。
13.本发明的第五方面，提供甘西鼠尾草种质资源遗传多样性分析的方法，包括以下步骤：
14.b1)提取甘西鼠尾草的基因组dna；
15.b2)以所述基因组dna为模板采用所述扩增引物进行pcr扩增；
16.b3)数据分析：对电泳结果读带、核苷酸序列读取和进行聚类分析。
17.进一步的，b2)中，pcr扩增体系为：dna模板2.5ul，bl553a 2
×
taq plus master mix25.0ul，1.5μl的正向引物和反向引物，加入ddh2o至50.0ul。
18.更进一步的，pcr扩增程序为：94℃预变性5min，进行35个循环，每个循环包括：94℃变性45s，56℃复性30s，72℃延伸60s；最后72℃延伸10min，pcr产物在4℃保存。
19.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
20.本发明中的9对est-ssr分子标记引物及对应的est-ssr分子标记序列是基于甘西鼠尾草转录组的est序列，并通过不同样本中提取的甘西鼠尾草dna开展pcr扩增和测序验证为明确的包含简单重复序列的ssr分子标记，是稳定有效的一组甘西鼠尾草的特异性分子标记，利用上述分子标记引物对和分子标记对甘西鼠尾草不同样本扩增验证，对测序的分子标记结果和同属植物丹参数据库中对应分子标记开展聚类分析，可直接将本发明所提供的9对est-ssr引物及9条分子标记应用至甘西鼠尾草及同属植物的种质资源的鉴定、遗传多样性分析、分子辅助选育及功效成分生物合成功能基因鉴定等相关领域。
附图说明
21.图1甘西鼠尾草植物整体和花部位。
22.图2为甘西鼠尾草不同组织转录组研究分析流程图。
23.图3为12个样本总rna质量凝胶电泳检测图。
24.图4为12个样本转录组文库pcr质检图。
25.图5为不同转录本长度数量和占比比例的统计图。
26.图6为转录本unigenes在不同通路中作用的分类图。
27.图7为甘西鼠尾草(样本号为poc509107)16对est-ssr引物扩增对应分子标记pcr产物(przewssr01-17)琼脂糖凝胶回收电泳图。
28.图8为两个甘西鼠尾草样本(poc509107和duq2022051)和丹参(ncbi数据库下载)基于9对est-ssr引物组和分子标记序列比对后基于upgma法构建的聚类分析图。
具体实施方式
29.下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
30.实施例1：甘西鼠尾草转录组数据rna-seq分析
31.1.转录组研究植物样本的采集、处理及分组
32.(1)采集及处理：于2018年9月10日在青海省西宁市同仁县采集3株甘西鼠尾草的新鲜植物全草(见图1)，用少量水清洗后，将不同组织分开，共计12个样本，包裹到锡箔纸中，并用记号笔写明样本的采样信息及编号后，用液氮速冻，于-80℃冰箱中保存。
33.(2)植物样本的分组：
34.分为两组：分别为甘西鼠尾草转录组研究生物学重复样本信息与分组(表1)和差异基因比较样品分组信息(表2)：
35.表1甘西鼠尾草转录组研究样本信息与分组
[0036][0037][0038]
表2差异基因比较样品分组信息
[0039][0040]
2.甘西鼠尾草不同组织转录组研究流程
[0041]
实验研究的流程如图2所示
[0042]
3.总rna提取及质量检测：
[0043]
用rna提取试剂盒提取甘西鼠尾草的12个不同组织根、茎、叶、花样本中的总rna，用agilent 2100bioanalyzer检测结果rin，28s和18s的rna的比值，28s和18s的rna的比值大于或等于1.5：1，电泳质量检测图如3所示，从图中可看出总rna质量条带清晰，用qubit rna assay kit对total rna质量进行准确检测后均合格达到后续研究的要求。
[0044]
4.转录组文库构建、测序
[0045]
用带有oligod(t)的beads对total rna中mrna进行纯化、片段化后，合成cdna第一链和第二链，对cdna产物通过pcr体系进行末端修复和polya加尾，并通过接头反应制备好接头后，开展pcr扩增并用qubit dna hs assay kit对pcr产物质控(图4)，用2100bioanalyzer chip检测pcr切胶产物的片段大小至符合后续研究要求，通过q-pcr标准品的摩尔浓度对构建的文库进行摩尔浓度的绝对定量，采用illumina推荐的kapa定量试剂盒(catno.kk4602)准确定量合格后开展文库构建合成和测序。
[0046]
5.转录组数据分析
[0047]
(1)测序数据过滤
[0048]
使用ngsqctoolkit-2.3.3软件过滤掉低原始序列中低质量reads和有引物污染的reads，得到高质量的clean reads，过滤前后reads统计结果见表3。从表3中可看出，去除低质量reads数，过滤后的总reads数占原始数据总reads的比例大于96.46％，且质量值大于20的碱基数占总碱基数的比例大于98.37％，质量值大于30的碱基数占总碱基数的比例大于95.43％。
[0049]
表3转录组原始数据reads数和碱基过滤后的数据
[0050][0051][0052]
(2)转录本组装和长度统计
[0053]
使用trinity对clean reads进行组装，trinity利用de bruijn graph path算法对reads进行de novo拼接，得到组装的unigene library，过滤掉长低于300bp的转录本，并经cdhit(identity》0.8)聚类，过滤低表达转录本得到一个最终的不同转录本，统计其长度。从图5中可见长度为200-300bp,300-500bp,500-1000bp,1000-2000bp,2000-5000bp,大于5000bp的转录本数量分别为41945条，43582条，44285条，31165条，17191条和808条，占比的比例分别为23.44％，24.35％，24.74％，17.41％，9.61％和0.45％。其中长度为500-1000bp的转录本最多，长度大于5000bp的转录本数量最少。
[0054]
(3)预测转录本unigenes在不同kegg pathway中的作用
[0055]
使用blast与kobas软件通过序列比对的方式，得到转录本所对应的kegg pathway信息，对unigenes的kegg pathway的结果进行分类，得到unigenes在不同通路中作用的分类图6。从图6中可见，组装出来的转录本在感觉系统、神经系统、免疫系统、排泄系统、内分泌系统、消化系统、循环系统、细胞生长和死亡、细胞的运动性、细胞群落、运输和分解代谢、膜运输、信号转导、信号分子和相互作用、折叠、整理和降解、复制和修复、转录、翻译、氨基酸代谢、碳水化合物代谢、能量代谢、糖聚糖的生物合成和代谢、脂质代谢、辅助因子和维生素的代谢、萜类和聚酮类物质的代谢、核苷酸代谢和环境适应性发挥不同的功能。
[0056]
实施例2：甘西鼠尾草est-ssr分子标记引物对的筛选、挖掘和设计
[0057]
结合差异基因共表达结果中的前100个高表达相关性的节点和靶点位置，在misa软件筛选出的转录本序列中查找匹配来源和位点的ssr(简单重复序列)，共发现有25种39条ssr分子标记序列。对序列再设置条件进行筛选，ssr位点距离序列两端大于50bp的序列利用设计引物，去除序列中单个碱基连续重复超过4个以上和以a/t碱基开头的序列，最终选定16条序列用于分子标记的扩增，分子标记及ssr引物特征见表4，用primer premier 5.0软件在序列两端设计est-ssr引物对，引物长度控制在18-22bp，tm55-65℃。其中前后引物tm值相差不大于4℃，预期产物长度100-400bp(表4)。
[0058]
表4 16对甘西鼠尾草中est-ssr引物对和扩增产物分子标记的特征
[0059]
[0060][0061]
实施例3：甘西鼠尾草est-ssr分子标记的扩增和筛选
[0062]
对不同来源的两份甘西鼠尾草样本(样本1来源于国家植物标本库，样本号为poc509107；样本2来源于中科院西北高原生物研究所标本库，标本号为duq2022051)，分别采用改良的mctab方法(十六烷基三甲基溴化铵,hexadecyltrimethylammonium bromide)方法、全式金基因组提取试剂盒(plant genomic dna kit(含rnase a)，北京全式金生物(transgen biotech))和天根高效植物基因组dna提取试剂盒(dp350)提取基因组dna(样本1提取dna1次，样本2提取dna3次)，操作参照参考文献和试剂盒说明书进行，获得的dna用微量分光光度计法检测浓度。以两个甘西鼠尾草样本中提取出的基因组dna为模板进行pcr扩增16条est-ssr分子标记，pcr反应体系为50μl，其中包括：dna模板2.5ul，bl553a 2
×
taq plus master mix(含红色染料)25.0ul(biosharp，兰杰柯科技有限公司)，1.5μl的正向引物和反向引物，加入ddh2o至50.0ul；反应程序为94℃预变性5min，然后进行35个循环，每个循环包括：94℃变性45s，56℃复性30s，72℃延伸60s；最后72℃延伸10min，pcr产物在4℃保存。每个dna样本扩增2-3次，产物检测：扩增获得的pcr产物经过1.5％琼脂糖凝胶电泳与dna marker2000(天根生化科技(北京)有限公司)对比检测，应用溶胶液(北京艾德莱生物科技有限公司)和上海硕美(ensure biological)磁珠法胶回收试剂盒(dna gel extraction kit)回收条带清晰与目标产物预期大小一致的条带，胶回收后纯化用琼脂糖凝胶电泳鉴定，鉴定回收产物浓度，应用bigdyetr v3.1 cycle seq kit(美国应用生物系统公司abi)配制测序反应的体系和开展pcr测序反应。每个pcr产物进行两次测序反应，反应结束后使用磁珠法进行沉淀后在3730xl测序仪进行测序，每个pcr产物用正向引物测序2-3次(北京睿博兴科生物技术有限公司和生工生物工程(上海)股份有限公司)，获得测序峰图，分析测序序列结果。结果显示，扩增获得的pcr产物经过1.5％琼脂糖凝胶电泳胶回收检测后，可获得12条清晰、多态性高、重复性好的ssr分子标记条带(其中6,7,14,17没有扩增条带，图7)，对12条分子标记的测序数据进行分析，其中9对est-ssr分子标记的引物扩增出来的分子标记序列中的ssr位点是存在且稳定的(分子编号为przewssr01,przewssr13和przewssr16号没有ssr序列(表4))，由此表明9对est-ssr引物是多态性的，可以用来作为甘西鼠尾草的est-ssr分子标记的引物对。
[0063]
实施例4：甘西鼠尾草及其易混物种丹参的est-ssr分子标记的聚类分析
[0064]
丹参与甘西鼠尾草同是唇形科鼠尾草属的近源物种，丹参物种中对应以上9条分子标记序列从ncbi数据库下载(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)，对甘西鼠尾草的样本和丹参样本中上述ssr分子标记的序列结果通过软件bioxm 2.7、phylosuite分析比对和mega-x构建upgma聚类图，如图8，从图中可见，四个甘西鼠尾草(salvia przewalskii)的样本聚为一支，易混淆物种丹参(salvia miltiorrhiza)单独聚为一支，通过以上9条est-ssr分子标记可将甘西鼠尾草和丹参两个物种有效鉴定、区别和分开。
[0065]
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
[0066]
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

技术特征：
1.基于甘西鼠尾草转录组序列开发的est-ssr分子标记，其特征在于，所述est-ssr分子标记为rzewssr02、przewssr03、przewssr04、przewssr05、przewssr08、przewssr09、przewssr10、przewssr11、przewssr15，核苷酸序列依次如seq id no.1-9所示。2.权利要求1所述est-ssr分子标记的扩增引物，其特征在于，所述扩增引物的核苷酸序列依次如seq id no.10-27所示。3.包含权利要求2所述扩增引物的试剂盒。4.权利要求1所述est-ssr分子标记、权利要求2所述扩增引物或权利要求3所述试剂盒的如下任一应用：a1)在甘西鼠尾草品种鉴定中的应用；a2)在甘西鼠尾草遗传图谱或分子身份证构建中的应用；a3)在甘西鼠尾草遗传育种中的应用；a4)在甘西鼠尾草亲缘关系或遗传多样性分析中的应用。5.甘西鼠尾草种质资源遗传多样性分析的方法，其特征在于，包括以下步骤：b1)提取甘西鼠尾草的基因组dna；b2)以所述基因组dna为模板采用权利要求2所述扩增引物进行pcr扩增；b3)数据分析：对电泳结果读带、核苷酸序列读取和进行聚类分析。6.根据权利要求5所述的甘西鼠尾草种质资源遗传多样性分析的方法，其特征在于，b2)中，pcr扩增体系为：dna模板2.5ul，bl553a 2
×
taq plus master mix25.0ul，1.5μl的正向引物和反向引物，加入ddh2o至50.0ul。7.根据权利要求6所述的甘西鼠尾草种质资源遗传多样性分析的方法，其特征在于，pcr扩增程序为：94℃预变性5min，进行35个循环，每个循环包括：94℃变性45s，56℃复性30s，72℃延伸60s；最后72℃延伸10min，pcr产物在4℃保存。

技术总结
本发明属于植物分子生物学和植物基因工程技术领域，具体涉及基于甘西鼠尾草转录组序列开发的EST-SSR分子标记、引物及应用。所述EST-SSR分子标记为9条，其序列依次如SEQ ID NO.1-9所示，各条分子标记所对应的SSR引物序列依次如SEQ ID NO.10-27所示。本发明提供的EST-SSR分子标记能有效鉴定和区分不同来源甘西鼠尾草和易混淆近缘物种丹参，可应用于甘西鼠尾草及同科属植物种质资源的鉴定、亲本鉴别、遗传多样性分析评价、分子辅助育种及功能基因组分析等领域。基因组分析等领域。基因组分析等领域。


技术研发人员：杜清 郭苏城 钟晓敏
受保护的技术使用者：清新天正（北京）国际科技有限责任公司
技术研发日：2023.05.04
技术公布日：2023/8/13