新型冠状病毒融合表位抗原、尿液抗体测试装置及其应用的制作方法

1.本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种新型冠状病毒(sars-cov-2)融合表位抗原和一种新型冠状病毒尿液抗体检测试剂笔，及其应用。


背景技术：

2.新型冠状病毒(sars-cov-2)自2019年底爆发以来，已经历多次变异：从阿尔法(alpha)、贝塔(beta)、伽玛(gamma)、德尔塔(delta)变异株，再到现在的奥密克戎(omicron)变异株已经成为全球优势流行株。变异方向为更低致病性、更短潜伏期和更快传染性。鉴于病毒所致疾病症状从肺炎逐步演化为上呼吸道传染病，新冠的防控已经改变为乙类乙管的总体方案。新冠状病毒传播方式主要包括飞沫传播和接触传播，潜伏期1-14天，多为3-7天。发病症状有发热、咳嗽、肌痛、疲劳、呼吸困难，偶有咳痰、头痛、咯血等。
3.sars-cov-2病毒基因组全长在26～32kb之间。病毒基因组5’端约2/3为重叠的开放阅读框(open reading frame，orf)orf1a和orf1b，主要负责编码与病毒复制和转录相关的酶等非结构蛋白。通过对sars-cov-2基因组进行注释，发现其编码至少27种蛋白质，包括：膜蛋白(membrane protein，m)、核衣壳蛋白(nucleocapsid protein，n))，15种非结构蛋白(nsp1-nsp10，nsp12-nsp16)，4种结构蛋白(刺突蛋白(spike protein，s)、小膜蛋白(envelope membrane protein，e)以及8种附属蛋白(3a，3b，p6，7a，7b，8b，9b和14)，基因组类似sars-cov，但明显存在一些编码蛋白质序列的插入和缺失。尤其是s蛋白，sars-cov-2编码的s蛋白序列组成和sars以及mers相比差异最大。sars-cov-2和sars-cov的s蛋白均可分为s1和s2结构域。在病毒入侵宿主细胞过程中，宿主源组织蛋白酶切割s蛋白后得到一个s1受体结构域，内含受体结合区(receptor binding domain，rbd)可与来自不同动物的血管紧张素转换酶ⅱ(angiotensin converting enzymeⅱ，ace2，在人体中主要分布于呼吸道上皮细胞、肺脏、心脏、肾脏和消化道等位置)作为受体来感染宿主，此过程激活了病毒感染力并决定了宿主范围；另外得到一个主要介导病毒包膜与细胞膜融合的s2结构域。sars-cov-2和sars-cov在s蛋白的rbd区与宿主受体之间结合的5个关键位点中，有4个是不同的，这些不同的位点是新型冠状病毒在致病能力上与sars冠状病毒有差异的潜在原因。
4.因此可见，sars-cov-2病毒基因组复杂，编码诸多类型的蛋白，因此，如何以最精简的方式、相对最精准地实施检测、分析体内该病毒的抗体情况，从而判断受试者对于病毒感染的免疫力/抵抗力，是本领域需要优化研究的重要课题。
5.现有对新型冠状病毒的检测是基于核酸检测和抗原检测，存在检出期短，只能对感染期的人员进行排查，无法对既往感染做出判断，无法判断人群的免疫状态。新型冠状病毒抗体在人体内存在时间长达几个月甚至几年之久，可检测周期长，并能评估人体的免疫状态。人们也亟待有准确的检测试剂或检测工具来实现对机体免疫力的预测。
6.现有新型冠状病毒的抗体检测试剂盒均采用血清学检测，属于有创抽血取样，在使用体验和生物安全方面考虑，不利于推广居家自行检测使用。由于临床采血检测耗时耗力、成本相对高，亟待开发更为简便的检测病毒抗体的方法。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供一种冠状病毒融合表位抗原、尿液抗体测试装置及其应用。
8.在本发明的第一方面，提供融合表位蛋白在制备特异性检测sars-cov-2病毒抗体的检测系统中的应用；其中，所述融合表位蛋白包括：s蛋白来源的氨基酸序列如seq id no:4、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:10、seq id no:12、seq id no:18和seq id no:21所示的片段；n蛋白来源的氨基酸序列如seq id no:23、seq id no:24、seq id no:26、seq id no:29、seq id no:30和seq id no:32所示的片段；e蛋白来源的氨基酸序列如seq id no:35所示的片段。
9.在一种或多种优选实施方式中，所述的检测系统包括：检测试剂，检测装置(检测件或测试件)或检测体系；较佳地，所述的检测装置包括：固相载体，以及固定于其上的所述融合表位蛋白；较佳地，所述固相载体包括(但不限于)选自：测试垫(试纸，如胶体金测试垫)，测试试纸(试纸条，如胶体金试纸)，芯片(液相芯片、微流控芯片)，玻片，孔板(包被板)，微球，磁珠；更佳地，所述检测装置为测试笔，其中包括测试试纸，所述融合表位蛋白固定于所述测试试纸、基于胶体金技术进行测试。
10.在一种或多种优选实施方式中，所述检测sars-cov-2病毒抗体为检测体液中的sars-cov-2病毒抗体；较佳地，所述体液包括：血液，尿液，唾液，粘膜分泌液，腹水，淋巴液；较佳地，所述体液为尿液；较佳地，所述血液包括全血、血浆或血清。
11.在本发明的另一方面，提供一种融合表位蛋白，其包括：s蛋白来源的氨基酸序列如seq id no:4、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:10、seq id no:12、seq id no:18和seq id no:21所示的片段；n蛋白来源的氨基酸序列如seq id no:23、seq id no:24、seq id no:26、seq id no:29、seq id no:30和seq id no:32所示的片段；e蛋白来源的氨基酸序列如seq id no:35所示的片段。
12.在一种或多种优选实施方式中，所述各个片段之间，通过连接肽连接；较佳地，所述连接肽包括(但不限于)：柔性连接肽(如ggggs或其串联结构)，或为刚性连接(如eaaak)，或为寡聚赖氨酸(kk)，或为寡聚脯氨酸(ppp)等。
13.在一种或多种优选实施方式中，所述融合表位蛋白的n端至c端依次包括：s蛋白来源的片段、n蛋白来源的片段和e蛋白来源的片段；更佳地，所述融合表位蛋白包括seq id no:1中第19-371位、第1-371位、第19-395位或第1-395位所示的氨基酸序列。
14.在本发明的另一方面，提供一种多核苷酸或含有该多核苷酸的表达构建体(如表达载体)，所述多核苷酸编码所述的融合表位蛋白；较佳地，所述多核苷酸的核苷酸序列如seq id no:2所示，或其简并的序列。
15.在本发明的另一方面，提供一种融合表位蛋白的表达系统，所述表达系统含有所述的表达构建体或其基因组中整合有外源的所述的多核苷酸。
16.在一种或多种实施方式中，所述的表达系统为宿主细胞。
17.在一种或多种实施方式中，所述的表达系统为真核表达系统，如哺乳动物细胞。
18.在一种或多种实施方式中，所述的真核表达系统为人胚胎肾细胞2936e(hek-293-6e)表达系统。
19.在本发明的另一方面，提供一种制备所述的融合表位蛋白的方法，包括：利用所述
的融合表位蛋白的表达系统表达所述的融合表位蛋白；较佳地，所述方法还包括：纯化所述的融合表位蛋白，获得分离的融合表位蛋白。
20.在本发明的另一方面，提供一种用于检测sars-cov-2病毒抗体的检测装置，包括：固相载体，以及固定于其上的所述的融合表位蛋白；较佳地，所述固相载体包括(但不限于)选自：测试垫(试纸，如胶体金测试垫)，测试试纸(试纸条，如胶体金试纸)，芯片(液相芯片、微流控芯片)，玻片，孔板(包被板)，微球，磁珠；更佳地，所述检测装置为测试笔，其中包括测试试纸，所述融合表位蛋白固定于所述测试试纸、基于胶体金技术进行测试。
21.在本发明的另一方面，提供一种用于检测sars-cov-2病毒抗体的试剂盒，其中包括所述的检测装置。
22.在一种或多种实施方式中，所述试剂盒中还可包括(但不限于)选自下组的任一或多种试剂：稀释液(如样本和抗体稀释液)、第二抗体、洗涤液、校准品、质控品、终止液或发光液。
23.在一种或多种实施方式中，所述试剂盒中还可包括：样品收集管，使用说明书等。
24.在本发明的另一方面，提供一种制备检测sars-cov-2病毒抗体的检测装置的方法，所述方法包括：将所述的融合表位蛋白以胶体金标记，包被于固相载体(如聚酯膜)，获得经包被的固相载体；较佳地，还包括在所述固相载体上设置捕获线和质控线；较佳地，将所述固相载体分为加样区(如样品垫)、胶体金结合区(如结合垫)、检测区(含有捕获线和质控线)、吸水区(如设置吸水材料的区域)；较佳地，所述检测装置为测试笔。
25.在本发明的另一方面，提供一种检测sars-cov-2病毒抗体的方法，包括：利用所述的融合表位蛋白作为检测抗原检测所述sars-cov-2病毒抗体，确定该抗体的存在情况以及存在量；较佳地，所述融合表位蛋白被包被于固相载体上；较佳地，所述固相载体包括(但不限于)选自：测试垫(试纸，如胶体金测试垫)，测试试纸(试纸条，如胶体金试纸)，芯片(液相芯片、微流控芯片)，玻片，孔板(包被板)，微球，磁珠；更佳地，所述检测装置为测试笔，其中包括测试试纸，所述融合表位蛋白固定于所述测试试纸、基于胶体金技术进行测试。
26.在一种或多种实施方式中，所述的检测sars-cov-2病毒抗体的方法可以是体外方法。
27.在一种或多种实施方式中，所述的检测sars-cov-2病毒抗体的方法可以是不以获得疾病诊断结果为直接目的的方法，或为非诊断性的方法。
28.本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
29.图1、用于表达所述融合表位蛋白的表达载体的结构示意图。
30.图2、测试笔中的测试垫的总体结构示意图。
具体实施方式
31.本发明人经过深入的研究筛选，从诸多的sars-cov-2蛋白类型中，选择合适的蛋白以及其中表位片段，揭示一种新型冠状病毒(sars-cov-2)通用融合表位蛋白，与各变异株感染后产生的抗体均有反应。本发明中，还以所述融合表位蛋白作为检测sars-cov-2病
毒抗体的抗原，制备了一种新型冠状病毒尿样抗体检测的检测装置(测试笔)，尿液为无创取样，在操作和生物安全方面具有明显优势。
32.如本文所用，所述“表位”或“表位肽”是指对较长抗体反应性肽段完成特定抗体所识别鉴定的短肽。目前已知道非构象型抗体识别表位肽的长度有限[hodges rs，et al.antigen-antibody interaction.synthetic peptides define linear antigenic determinants recognized by monoclonal antibodies directed to the cytoplasmic carboxyl terminus of rhodopsin.j biol chem 1988，263:11768-11775]，但由于受方法学的限制，常常将未经抗体识别基序鉴定的大片段抗原性肽都称之为“表位”。作为常识，免疫学界人士一般不会将抗原“蛋白”称为“抗原性肽”或将“抗原性肽”称为“表位”。
[0033]
如本发明所用，“表位肽”、“表位”、“抗原表位”可互换使用。
[0034]
如本发明所用，所述的“融合表位蛋白”、“融合表位抗原”、“抗原性肽”或“抗原模拟表位”可以互换使用。
[0035]
如本发明所用，所述的“试剂笔”、“测试笔”或“检测笔”等可互换使用。
[0036]
如本发明所用，“待测样品(样本)”可以涵盖多种样品的类型，包括机体组织、体液；但是优选地，所述待测样品是尿液样品。当机体感染过sars-cov-2病毒之后，在一定的阶段内体内会产生抗病毒的抗体。
[0037]
如本发明所用，所述的“sars-cov-2病毒抗体”包括自身抗体。
[0038]
如本发明所用，所述的“自身抗体”为机体免疫系统为了应对病毒入侵通过免疫应答产生的抗体；所述自身抗体通常在被病毒侵染后的一段时间内产生，后续可能在机体内存留，也可能在一段时间后滴度降低或消失。因此自身抗体水平在疾病或身体状态发展进程中会发生波动，可以应用于监测疾病进展。
[0039]
如本发明所用，“免疫活性”或“免疫原性”指由天然、重组或合成的肽诱导哺乳动物体内的特异性体液和/或细胞免疫应答的能力。本文所用的术语“抗原”指可引发哺乳动物免疫应答的肽，无论是单独或融合，或与辅助分子结合。
[0040]
如本发明所用，“免疫应答”包括细胞性和/或体液性免疫应答，它们足以抑制或防止感染；或防止或抑制由微生物(尤其是病原性微生物)导致的疾病的发作。
[0041]
如本发明所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
[0042]
如本发明所用，检测所针对的“对象”或“个体”或“患者”指需要进行诊断或预后的任何目标，尤其是哺乳动物对象，特别是人，其它对象包括牛、狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马等。特别受关注的是那些已经受过病毒感染的对象。
[0043]
如本发明所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由
……
构成”、“基本上由
……
构成”、和“由
……
构成”；“主要由
……
构成”、“基本上由
……
构成”和“由
……
构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。
[0044]
在sars-cov-2病毒具有较多类型的蛋白的情况下，本发明人经过深入研究筛选和反复试验的基础上，从若干条蛋白中确定了一系列适于检测病毒抗体的表位、形成融合表位蛋白。
[0045]
在本发明的具体实施例中，本发明人通过生物信息学技术，根据蛋白晶体结构来分析表位及非表位氨基酸，利用随机森林算法(bepipred-2.0)以及基于人工神经网络模型(abcpred)对于sars-cov-2原始株的多种蛋白进行筛选，确定了从s蛋白、n蛋白以及e蛋白中筛选优势表位，结合考虑多个流行株所涉及突变位点进行候选优势表位的确定。在确定了优势表位后，本发明人还利用寡聚赖氨酸连接肽将各表位进行连接，并采用人白蛋白信号肽，以提升其在哺乳动物细胞中表达及分泌效率，以纯化标签如3
×
flag置于融合表位蛋白c端。将构建融合表位蛋白核酸序列经密码子优化后克隆于一具有全长cmv启动子的pcdna3.4质粒，并于悬浮的人胚肾上皮细胞(hek-293-6e)中进行瞬时转染表达。
[0046]
基于本发明人的上述新发现，提供了融合表位蛋白在在制备特异性检测sars-cov-2病毒抗体的检测系统中的应用。具体地，所述融合表位蛋白包括：s蛋白来源的氨基酸序列如seq id no:4、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:10、seq id no:12、seq id no:18和seq id no:21所示的片段；n蛋白来源的氨基酸序列如seq id no:23、seq id no:24、seq id no:26、seq id no:29、seq id no:30和seq id no:32所示的片段；e蛋白来源的氨基酸序列如seq id no:35所示的片段。其中，所述的检测系统包括：检测试剂，检测装置(检测件或测试件)或检测体系。本发明所述融合表位蛋白可以有效地用于进行病毒抗体的测定，具有理想的准确性、敏感性。
[0047]
本发明的融合表位蛋白可以以单拷贝存在，也可以以双拷贝或多拷贝的形式存在。每一拷贝之间以连接肽进行连接。
[0048]
本发明的融合表位蛋白可以与其它的抗原表位或抗原性肽进行连接，获得多价(包括双价)的肽。
[0049]
一旦获得了所述的融合表位蛋白的序列，就可以通过化学合成或重组表达的方法来生产所述的多肽。所谓重组表达，就是通常将所述融合表位蛋白的编码dna片段正负链退火后重组插入克隆载体，再转入感受态细胞，然后通过常规方法从培养增殖后的转化细胞中分离得到大量核苷酸序列正确的表达载体，并将得到的表达载体以脂质体转染方式转入目标宿主细胞，培养过程中宿主细胞将表达载体所对应的融合表位蛋白分泌至培养基中，最终通过对培养基中目标蛋白的回收获得序列正确的融合表位蛋白。就本发明的融合表位蛋白而言，也可采用化学合成方法，即通过多肽合成仪合成目的序列短肽，从而简便快速地获得所需要的目标肽。
[0050]
在本发明的具体实施例中，通过以下的方法进行了所述融合表位蛋白的表达：(1)融合表位重组蛋白表达系统构建：以连接肽连接各个筛选获得的融合表位肽；所述连接肽可选：寡聚赖氨酸kk，寡聚脯氨酸ppp，柔性连接肽ggggs，刚性连接肽eaaak等；(2)融合表位重组蛋白表达系统构建：利用了纯化标签；所述纯化标签可以为flag，3
×
flag，6
×
his，mbp，gst等；(3)融合表位重组蛋白表达系统构建：利用了信号肽；所述信号肽可以为人白蛋白信号肽，人球蛋白(ig)重链信号肽，人球蛋白(ig)轻链信号肽，人天青杀素原始蛋白信号肽，胱抑素-s前体信号肽等。
[0051]
本发明所述的方法表达获得的融合表位蛋白可被固定于固相载体上，制备方便检测的检测装置。可以以来源于不同地区新型冠状病毒奥密克戎变异株感染康复者尿液中的新型冠状病毒抗体为靶标，并与传统单一抗原蛋白进行检测灵敏度及特异性的综合对比。根据本发明的实施例的实验分析，确认其对于人尿液中新冠抗体的检测具有良好的准确性
和敏感性。
[0052]
根据本发明，所述固相载体可以是但不限于：磁微粒、微球、塑料珠、液相芯片、微孔板、亲和膜、玻片或试纸等。作为本发明的优选方式，采用共价固定方式将融合表位蛋白固定于固相载体。在一些方式中，可通过将抗原包被于微孔板来实现可见光比色法、荧光发光法和/或化学发光法检测检测，例如96孔板。
[0053]
本发明应用的免疫检测形式可以包括免疫层析、酶联免疫以及化学发光；标志物包括胶体金、有色乳胶、荧光、酶。
[0054]
在本发明的优选实施方式中，将融合表位蛋白固定于测试垫上，并安装于带有外壳的测试装置中，优选地所述测试装置为测试笔，或也可以是类似的便携测试装置，其中包括测试试纸，所述融合表位蛋白固定于所述测试试纸、基于胶体金技术进行测试。本发明所述测试笔，还可包括测试卡以及测试裸条。一种优选的测试装置请见本发明的图2。
[0055]
本发明适用于多种多样的待测样品，作为本发明的优选方式，所述的检测对象为人尿液。尿液的浓缩液或稀释液也可被用于检测病毒抗体水平。所述的检测可以是定性的，也可以是定量的。在本发明实施例中所提供的的检测方式基础上，可根据实际需求，在配方浓度、成分的调整。
[0056]
本发明的检测系统(检测试剂，检测装置(检测件或测试件)或检测体系)可被包含于试剂盒/包装中，从而便于本领领域技术人员或需要测试的普通受试者应用。在优选的方式中，所述试剂盒/包装中还可包含：样品收集管，使用说明书等，以便于人们使用。
[0057]
本发明的主要有益效果包括：
[0058]
筛选到的新型冠状病毒抗原模拟表位作为检测蛋白，再经过各参数优化，得到高特异性和灵敏度的新型冠状病毒尿液抗体检测装置，优选地为试剂笔。所述检测装置尤其适用于尿液样品中病毒抗体的检测。本发明的测试方法操作简单，仅15分钟即可完成检测，结果可以目视化。检测样本为尿样，采集无创、简单，适用于家庭自检。
[0059]
对于本发明所针对的病毒而言，机体尿液中抗体的含量会显著低于组织、粘膜、唾液、血液等中的含量，因此尤其需要高灵敏度的检测试剂/检测装置的开发，而本发明有效地解决了这一技术问题。
[0060]
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如j.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0061]
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
[0062]
实施例1、sars-cov-2抗原模拟表位筛选
[0063]
1.1s蛋白优势表位筛选
[0064]
为了获得sars-cov-2病毒的s蛋白的优势表位，本发明人进行了深入的分析、筛选以及实验验证。
[0065]
s蛋白原始序列如seq id no:22所示，其全长多达1273个氨基酸，为长度很长的蛋白。
[0066]
本发明人利用蛋白晶体结构来分析表位/非表位氨基酸，利用随机森林算法(bepipred-2.0)以及基于人工神经网络模型(abcpred)对于sars-cov-2原始株的s蛋白的b细胞线性表位进行分析和预测；进一步结合研究和实践经验，发明人获得一系列潜在的优势表位，如表1所示(seq id no:3～21)，并通过对比delta、omicron ba.1～5的突变株特点，进行反向筛选，兼顾考虑其保守区内可能表位。
[0067]
表1
[0068]
表位序列序列表编号swmesefrvyssanncseq id no:3mdlegkqgnfknlseq id no:4rsyltpgdsssgwtseq id no:5ksftvekgiyqtsnfrvqpseq id no:6svyawnrkrisncvaseq id no:7ellhapatvcgpkkstnlvknseq id no:8gvsvitpgtntsnqvaseq id no:9ytmslgaensvaysnnseq id no:10tktsvdctmyicgdstseq id no:11ladagfikqygdclgseq id no:12agtitsgwtfgagaalseq id no:13famqmayrfngigvtqseq id no:14igkiqdslsstasalgseq id no:15phgvvflhvtyvpaqeknfttapseq id no:16pqiittdntfvsgncdseq id no:17vydplqpeldsfkeeldkyfknhtspdvdlgdisgseq id no:18qkeidrlnevaknlneseq id no:19yeqyikwpwyiwlgfiseq id no:20scckfdeddsepvlkgseq id no:21
[0069]
化学合成seq id no:3～21所示多肽，并偶联至人血清白蛋白。分别以1μg/ml，100μl/孔，包被至96孔酶标板，孵育、洗涤、封闭后，备于检测。
[0070]
将20例不同来源的新型冠状病毒感染患者尿液等体积混合，并透析、浓缩至1/20体积后作为阳性样本；20例不同来源未接种新型冠状病毒疫苗并未曾感染新型冠状病毒人员尿液等体积混合，并透析、浓缩至1/20体积作为阴性样本。
[0071]
以elisa间接法对不同肽偶联蛋白进行筛选，发明人进一步优选得到8组特异性及灵敏度均可接受的多肽片段(阳性样本检出且阴性样本不检出)，序列分别为：seq id no:4，seq id no:6，seq id no:7，seq id no:8，seq id no:10，seq id no:12，seq id no:18，seq id no:21。
[0072]
1.2n蛋白优势表位筛选
[0073]
使用1.1中基本相同的方法，对n蛋白优势表位进行筛选。
[0074]
n蛋白原始序列如seq id no:34所示，其全长多达419个氨基酸。
[0075]
发明人结合多种手段的分析，获得一系列潜在的b细胞线性表位(优势表位)，如表
2所示(seq id no:23～33)。
[0076]
表2
[0077]
表位序列序列表编号dstgsnqngersgarskqrrpqglpnntseq id no:23kfprgqgvpintnsspddqigyyrratrrirggdgkmkdlsseq id no:24galntpkdhigtrnpannaaivlqlpqseq id no:25assrsssrsrnssrnsseq id no:26lgtgpeaglpygankdgiiwvateseq id no:27galntpkdhigtrnpannaaivlqlpqseq id no:28tvtkksaaeaskkprqkrtatkaseq id no:29rrgpeqtqgnfgdqelirqgtdykseq id no:30sgtwltytgaiklddkseq id no:31ktfpptepkkdkkkkadetqalpqrqkkseq id no:32skqlqqsmssadsseq id no:33
[0078]
以1.1中基本相同的的方法，阴阳性样本对于n蛋白所预测b细胞线性表位进行筛选，本发明人进一步获得6组特异性及灵敏度均可接受的多肽片段(阳性样本检出且阴性样本不检出)，序列分别为：seq id no:23，seq id no:24，seq id no:26，seq id no:29，seq id no:30，seq id no:32。
[0079]
1.3e蛋白优势表位筛选
[0080]
使用1.1中基本相同的方法，对e蛋白优势表位进行筛选。
[0081]
e蛋白原始序列如seq id no:36所示。
[0082]
使用1.1中基本相同的方法对e蛋白优势表位进行筛选。e蛋白筛选潜在的b细胞线性表位序列如下：
[0083]
yvysrvknlnssrvp(seq id no:35)
[0084]
以1.1中基本相同的的方法，阴阳性样本对于n蛋白所预测b细胞线性表位进行筛选，经过分析和验证，确认该b细胞线性表位符合要求。
[0085]
实施例2、融合表位重组蛋白表达系统构建
[0086]
对于经样本筛选以及实验分析后符合要求的多肽，以寡聚赖氨酸(kk)为连接肽进行串联(seq id no:37)：
[0087]
mdlegkqgnfknlkkksftvekgiyqtsnfrvqpkksvyawnrkrisncvakkellhapatvcgpkkstnlvknkkytmslgaensvaysnnkkladagfikqygdclgkkvydplqpeldsfkeeldkyfknhtspdvdlgdisgkkscckfdeddsepvlkgkkdstgsnqngersgarskqrrpqglpnntkkkfprgqgvpintnsspddqigyyrratrrirggdgkmkdlskkassrsssrsrnssrnskktvtkksaaeaskkprqkrtatkakkrrgpeqtqgnfgdqelirqgtdykkkktfpptepkkdkkkkadetqalpqrqkkkkyvysrvknlnssrvp
[0088]
本发明中将3
×
flag(seq id no:38：dykdhdgdykdhdidykddddk)置于融合表位蛋白c端作为纯化标签，所得融合表位蛋白序列如下(seq id no:38)：
[0089]
mdlegkqgnfknlkkksftvekgiyqtsnfrvqpkksvyawnrkrisncvakkellhapatvcgpkkstnlvknkkytmslgaensvaysnnkkladagfikqygdclgkkvydplqpeldsfkeeldkyfknhtspdvdlgdisgkkscckfdeddsepvlkgkkdstgsnqngersgarskqrrpqglpnntkkkfprgqgvpintnsspddqigyyrrat
rrirggdgkmkdlskkassrsssrsrnssrnskktvtkksaaeaskkprqkrtatkakkrrgpeqtqgnfgdqelirqgtdykkkktfpptepkkdkkkkadetqalpqrqkkkkyvysrvknlnssrvpkkdykdhdgdykdhdidykddddk
[0090]
本发明融合表位蛋白表达宿主系统为悬浮培养人胚肾上皮细胞(hek-293-6e)，为提高融合表位蛋白表达效率，选择将人体内表达量较高的分泌蛋白，人血清白蛋白信号肽(seq id no:39：mkwvtfisllflfssays)作为该融合表位蛋白信号肽，构成融合表位蛋白序列如下(seq id no:1)：
[0091]
mkwvtfisllflfssaysmdlegkqgnfknlkkksftvekgiyqtsnfrvqpkksvyawnrkrisncvakkellhapatvcgpkkstnlvknkkytmslgaensvaysnnkkladagfikqygdclgkkvydplqpeldsfkeeldkyfknhtspdvdlgdisgkkscckfdeddsepvlkgkkdstgsnqngersgarskqrrpqglpnntkkkfprgqgvpintnsspddqigyyrratrrirggdgkmkdlskkassrsssrsrnssrnskktvtkksaaeaskkprqkrtatkakkrrgpeqtqgnfgdqelirqgtdykkkktfpptepkkdkkkkadetqalpqrqkkkkyvysrvknlnssrvpkkdykdhdgdykdhdidykddddk
[0092]
通过针对宿主表达体系的密码子优化后转化为相对应核酸序列并在其3’端加入终止密码子tga(seq id no:2)：
[0093]
atgaagtgggtgaccttcatctctctgctgtttctgttttcctccgcctactccatggacctggagggcaaacaggggaattttaagaatctgaagaagaagtcttttaccgtggaaaagggcatctaccagacgagcaactttcgggtgcagcccaagaagagcgtgtacgcctggaaccgaaagcgtatcagcaactgcgtggccaagaaagagctgctgcacgctcccgccaccgtgtgtggcccaaagaagtcaaccaatctggtgaagaacaagaagtacaccatgtctctgggggccgagaacagcgtggcttattcaaataacaagaagctggccgacgcagggttcatcaagcagtatggcgactgtctgggcaaaaaggtgtacgatccactgcagcctgagctcgactccttcaaggaggagctggataaatacttcaagaaccacaccagccctgatgtggacctgggcgacatcagcggcaagaagagctgttgcaagttcgacgaggatgactccgagcccgtgctgaaaggcaagaaggactccaccggctctaatcagaacggcgagcgctctggcgccagatccaagcagagacgcccacagggcctgcctaataatacaaagaagaagtttccacgcggccagggcgtgcccatcaacacaaacagtagtcccgacgatcagatcggctactatagacgggccaccaggagaatccgggggggcgacggcaaaatgaaggacctgagcaagaaggctagcagccgctccagcagccggtcaagaaacagcagcagaaacagcaagaagaccgtgactaagaagtctgccgccgaagccagcaagaagccccggcagaagagaacagccactaaggccaagaagcggagaggccccgaacagacccagggaaatttcggcgatcaggaactgatcaggcaggggactgattacaagaagaagaagacctttcctccaaccgagccaaagaaggataagaaaaagaaagccgatgagacacaggctctgccacagagacaaaaaaaaaaaaagtacgtttacagcagagtgaaaaacctgaacagttccagggtgcccaaaaaggactataaggaccatgatggcgactacaaggaccacgacatcgattataaggacgacgacgacaagtga
[0094]
实施例3、融合表位重组蛋白的制备
[0095]
3.1片段扩增+克隆+质粒制备
[0096]
以过表达载体pcdna3.4扩增正向引物3.4-f(seq id no:40:aagggttcgatccctacc)以及反向引物3.4-r(seq id no:41：agggttcgatcctctagagt)，对表达载体pcdna3.4进行线性化扩增，并进行产物纯化。
[0097]
以片段扩增正向引物sne-f(seq id no:42:tctagaggatcgaaccc tatgaagtgggtgaccttc)以及反向引物sne-r(seq id no:43：ggtagggatcgaaccctttcacttgtcgtcgtcgtc)对融合表位蛋白片段进行扩增，并在其5’及3’端加入载体克隆位置的同源序列接头。
[0098]
将扩增片段与扩增载体以2:1比例进行同源重组，将扩增片段克隆至表达载体。获得的表达载体如图1。
[0099]
将构建后的载体转化至dh5α感受态细胞，并置于含有氨苄青霉素(amp)的luria-bertani(lb)固体培养基于37℃过夜培养。将生长于平板的阳性菌落以sne-f&r为引物进行菌落pcr验证，将电泳条带准确(1000bp左右)菌落置于含有amp的液体lb培养基培养，并送样进行测序。对于测序准确的菌株置于100ml含有amp的液体lb培养基进行扩大培养。
[0100]
对扩大培养后的dh5α进行裂解，并以无内毒素质粒提取试剂盒提取本发明所构建质粒。
[0101]
纯化后的质粒以乙醇醋酸钠沉淀法进行进一步纯化并浓缩，并以分光光度法对其含量进行测定。
[0102]
3.2转染+蛋白表达
[0103]
将hek-293-6e细胞复苏接种于带有挡板凹底以及滤膜瓶盖的三角摇瓶(培养基：含ala-gln、普朗尼克酸及遗传霉素的freestyle f17+2mm l-ala-l-gln；培养条件：5％ co2，37℃，125rpm)。
[0104]
转染前确保细胞存活率不低于95％，并将培养基替换为转染培养基(含ala-gln、普朗尼克酸及丙戊酸的freestyle f17)，并将细胞浓度确定为1
×
106/ml，继续置于5％ co2，37℃环境下以125rpm进行培养。
[0105]
2小时后以1μg/ml转染量通过293-fectin进行前述建立的重组质粒的转染。4小时后加入等体积转染培养基并继续培养。
[0106]
次日加入tn1以及遗传霉素持续以相同环境下继续培养6日。
[0107]
3.3蛋白纯化+浓缩
[0108]
表达完成后以离心去除细胞，收集转染上清，并加入1/9体积的弱碱性10
×
tbs。
[0109]
将装有anti-flag亲和填料层析柱以1
×
tbs平衡后，以1ml/min流速将转染上清重复上样2次后再次以20倍柱体积的1
×
tbs进行清洗。
[0110]
以0.1m ph 3.0～3.5的gly-hcl缓冲液以1ml/min流速进行洗脱，并将洗脱液直接置于预先装有ph 8.0的1m tris中和液(20μl中和液/ml洗脱液)。
[0111]
收集后的洗脱液以1
×
pbs平衡后的脱盐柱进行缓冲液替换，即获得所述融合表位重组蛋白。
[0112]
实施例4、新型冠状病毒融合表位的标记及测试装置的制备
[0113]
4.1结合垫的制备
[0114]
(1)金溶胶的制备
[0115]
使用柠檬酸酸三钠还原氯金酸方法，制备40nm左右的胶体种子金；再通过添加抗坏血酸和氯金酸促成种子金的生长，制备约80mm左右的胶体纳米花。扫描胶体纳米花的最大吸收波长为550nm。
[0116]
(2)蛋白标记
[0117]
使用20mm ph9.0硼酸-硼砂缓冲液调节胶体纳米花的ph至7.2，加入50μg/ml前述制备的新型冠状病毒融合表位蛋白，搅拌反应30分钟。使用10％bsa封闭1小时。10000rpm 10分钟，离心收集收集沉淀后，加入1/10原体积的20mm ph8.0的tris缓冲液(含1％bsa和0.5％tw20)。
[0118]
使用同样方法制备鸡igy蛋白金标记溶液。
[0119]
将以上两种蛋白溶液按3：1的比例进行混合。
[0120]
(3)结合垫的制备
[0121]
将前述金标记后蛋白溶液，按5.0μl/cm的量喷涂在聚酯膜上(上海金标生物-dl42)，经37℃烘干5小时后，切割成8mm*30mm的尺寸，获得胶体金结合垫，干燥保存。
[0122]
4.2新型冠状病毒尿液抗体免疫层析检测笔的制备
[0123]
(1)包被膜制备
[0124]
将硝酸纤维素膜(赛多利斯，cn140)粘帖至pvc胶板(上海金标)。并在中间以1.0μl/cm的量分别喷涂质控线羊抗鸡igy和捕获线鼠抗人igg，两者浓度分别为0.5～2mg/ml，两者间隔4～5mm。经50℃干燥箱烘干5小时。
[0125]
(2)样品垫制备
[0126]
使用100mm ph9.0的tris缓冲液(另含1％氯化钠、1％牛血清白蛋白、0.5％peg8000、1％吐温20)，以40ml/张处理玻璃纤维(上海金标-rb65)。经50℃烘箱干燥12小时后，切割成42mm*300mm尺寸。
[0127]
所获得的测试垫总体结构示意图如图2。
[0128]
(3)测试笔制备
[0129]
将以上处理后包被膜、胶体金结合垫和样品垫分别粘在pvc底板上。吸水材料(吸水纸)覆盖硝酸纤维素膜上端1mm，结合垫覆盖硝酸纤维素膜下端1mm，样品垫覆盖结合垫3mm。pcv底板上各部件粘帖牢固后，按长度方向切割成4mm宽度的试剂条，加测试笔外壳上盖和下板，压紧后盖上笔帽。组装成新型冠状病毒尿液抗体检测试剂笔。
[0130]
添加干燥剂后单独密封包装至铝箔袋中。
[0131]
测试笔外壳包括上盖、下底板和笔帽。上盖上有观察窗，以及进样孔。观察窗上有“c”、“t”字样标识。
[0132]
实施例5、层析测试笔的应用
[0133]
5.1检测方法
[0134]
用尿杯采集新鲜尿样30～50ml。拔掉试剂笔的笔帽，将试剂笔的下端浸入尿液样本中。试剂笔通过毛细作用将尿液样本输送至结合垫上，当尿液样本中含有新型冠状病毒抗体并浓度高于检测下限时，样本中的抗体先与结合垫上的金标抗原融合表位多肽结合；随着层析作用，尿液样本中的igg抗体被硝酸纤维素膜上的t线(鼠抗人igg)捕获，形成肉眼可见的红色线条。当尿液样本中不含新型冠状病毒抗体或样本中抗体浓度低于检测下限时，尿液样本无法与金标抗原融合表位多肽结合也无法被t线捕获，在t线位置无法形成线条。
[0135]
结合垫上的金标鸡igy随着样本层析进行，被c线(羊抗鸡igy)回收，无论样本中是否含有抗体，c线均将显色，表示层析正常完成。
[0136]
结果判断：
[0137]
阳性：在检测线(t线)和质控线(c线)位置均出现红色线条。
[0138]
阴性:只在质控线(c线)位置出现一条红色线条。
[0139]
无效：质控线(c线)位置未出现线条。
[0140]
5.2临床样本检测
[0141]
(1)与血液样本一致性测试
[0142]
选取新型冠状病毒感染者108例，未感染也未接种疫苗者110例，分别取血液样本和尿液样本。检测两者检测的一致性。结果如表3-表4所示。
[0143]
表3、未感染也未接种疫苗者样本一致性检测
[0144][0145]
表4、感染者样本一致性检测
[0146][0147]
通过上述检测结果可知，本发明所述测试笔在测试尿样样本和常规测试血液抗体样本的一致性分析上，对未感染也未接种疫苗者检测阴性符合率为100％。对感染者检测阴性符合率为100％，阳性符合率为98.13％。
[0148]
综上，本发明与血液检测的阴性总符合率为100％，阳性总符合率达到98.13％。说明本发明在检测新型冠状病毒感染的性能上与血液抗体检测具有高度一致性。
[0149]
(2)敏感性测试
[0150]
选取新型冠状病毒奥密克戎变异株感染者20例，从出现症状开始同时收集血样和尿样，直至血样抗体和尿液抗体均检出为止。统计每次检测的检出率。如表5和表6。
[0151]
表5、尿样敏感性测试
[0152]
时间阴性阳性阳性率3天41680％5天21890％7天11995％15天020100％30天020100％
[0153]
表6、血样敏感性测试
[0154]
时间阴性阳性阳性率3天31785％5天11995％7天020100％15天020100％30天020100％
[0155]
通过上述结果可知，新冠感染者从出现症状3天内尿样抗体检出达到80％，出现症状一周内的检出率达到95％。与血液抗体检测相比，窗口期相近。说明本发明的敏感度较好。
[0156]
(3)检测下限
[0157]
选取新型冠状病毒感染的康复者血液样本3例，按倍比稀释测试滴度的方法检测本发明制备的融合表位蛋白以及制备的测试笔在检测下限上与血液抗体的检测试剂进行比较。本发明测试笔使用阴性尿液基质进行稀释，血液抗体检测试剂使用阴性血浆基质进行稀释。结果见表7
[0158]
表7、检测下限比较
[0159][0160][0161]
通过上述结果可知，本发明制备的融合表位蛋白以及制备的测试笔在样本检测中，可以达到100-1000倍滴度；对照的血液抗体检测可以达到10-100倍滴度。本发明制备的融合表位蛋白以及制备的测试笔比对照的血液抗体检测的试剂，检测下限低10-100倍。
[0162]
可见，本发明制备的融合表位蛋白以及制备的测试笔在灵敏度性能上有显著提升，适用于检测尿液基质中的低浓度抗体。
[0163]
(4)包容性
[0164]
选取不同地区不同变异株感染的新型冠状病毒康复者尿液总计40例，使用本发明工艺制备的测试笔测试阳性检测情况，结果见表8。
[0165]
表8、不同变异株包容性检测
[0166]
变异株数量检出阳性数量阳性率野生株55100％阿尔法(alpha，b.1.1.7)55100％
贝塔(beta，b.1.351)55100％伽玛(gamma，p.1)55100％德尔塔(delta，b.1.617.2)55100％奥密克戎(omicron，b.1.1.529)55100％奥密克戎(omicron，ba.5.2)55100％奥密克戎(omicron，bf.7)55100％
[0167]
通过上述结果可知，本发明制备的融合表位蛋白检测靶点可以覆盖已知的国际关注株和目前流行株。
[0168]
5.3比较实验
[0169]
选取s蛋白、n蛋白、e蛋白的原始全长序列，n端添加人血清白蛋白信号肽，c端添加3
×
flag纯化标签，通过重组表达的方法制备重组s、n、e蛋白(原始序列)。
[0170]
重组s蛋白(原始序列)如seq id no:22所示，制备过程中为确保其在宿主中以分泌蛋白形式转运至胞外，同样在n端加入人白蛋白信号肽作为该重组蛋白信号肽(seq id no:39：mkwvtfisllflfssays)；同样的为方便后期纯化，在c端加入3
×
flag作为纯化标签(seq id no:38：dykdhdgdykdhdidykddd dk)，所得重组蛋白序列如seq id no:44.
[0171]
将该序列相对应核酸序列进行密码子优化后如seq id no：45。
[0172]
并将该核酸片段扩增并克隆至pcdna3.4表达载体，转染至hek-293-6e进行表达，并使用偶联有anti-flag抗体的填料对其进行纯化。
[0173]
对于所述重组n蛋白(原始序列)，以同样方式进行制备，其中前者重组蛋白氨基酸序列如seq id no：46。核酸序列如seq id no:47。
[0174]
e蛋白由于其长度较短(seq id no:36)，以化学合成形式并偶联至klh蛋白作为捕获蛋白直接使用。
[0175]
利用所述重组s、n、e蛋白以及本发明seq id no:1的融合表位蛋白，分别制备测试笔。测试新型冠状病毒感染康复者尿样20例，未感染也未接种疫苗者20例，进行检测效果的比较(表9)。
[0176]
表9、融合表位蛋白以及测试结果
[0177]
融合表位蛋白序列阴性符合率阳性符合率本发明融合表位蛋白seq id no:1100％100％重组s蛋白(原始序列)seq id no：45100％65％重组n蛋白(原始序列)seq id no：46100％80％重组e蛋白(原始序列)seq id no:36100％20％
[0178]
通过上述结果可知，在保持特异性的基础上，本发明制备的融合表位蛋白阳性符合率远高于单一蛋白的阳性符合率。说明本发明制备的融合表位蛋白具有优异的敏感性，而其它蛋白的敏感性远不如本发明seq id no:1。
[0179]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。同时，在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。

技术特征：
1.融合表位蛋白在制备特异性检测sars-cov-2病毒抗体的检测系统中的应用；其中，所述融合表位蛋白包括：s蛋白来源的氨基酸序列如seq id no:4、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:10、seq id no:12、seq id no:18和seq id no:21所示的片段；n蛋白来源的氨基酸序列如seq id no:23、seq id no:24、seq id no:26、seq id no:29、seq id no:30和seq id no:32所示的片段；e蛋白来源的氨基酸序列如seq id no:35所示的片段。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的检测系统包括：检测试剂，检测装置或检测体系；较佳地，所述的检测装置包括：固相载体，以及固定于其上的所述融合表位蛋白；较佳地，所述固相载体包括选自：测试垫，测试试纸，芯片，玻片，孔板，微球，磁珠；更佳地，所述检测装置为测试笔，其中包括测试试纸，所述融合表位蛋白固定于所述测试试纸、基于胶体金技术进行测试。3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测sars-cov-2病毒抗体为检测体液中的sars-cov-2病毒抗体；较佳地，所述体液包括：血液，尿液，唾液，粘膜分泌液，腹水，淋巴液；较佳地，所述体液为尿液；较佳地，所述血液包括全血、血浆或血清。4.一种融合表位蛋白，其包括：s蛋白来源的氨基酸序列如seq id no:4、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:10、seq id no:12、seq id no:18和seq id no:21所示的片段；n蛋白来源的氨基酸序列如seq id no:23、seq id no:24、seq id no:26、seq id no:29、seq id no:30和seq id no:32所示的片段；e蛋白来源的氨基酸序列如seq id no:35所示的片段。5.如权利要求1所述的应用或权利要求4所述的融合表位蛋白，其特征在于，所述各个片段之间，通过连接肽连接；较佳地，所述连接肽包括：柔性连接肽，或为寡聚赖氨酸，或为寡聚脯氨酸，柔性连接肽；较佳地，所述融合表位蛋白的n端至c端依次包括：s蛋白来源的片段、n蛋白来源的片段和e蛋白来源的片段；更佳地，所述融合表位蛋白包括seq id no:1中第19-371位、第1-371位、第19-395位或第1-395位所示的氨基酸序列。6.一种多核苷酸或含有该多核苷酸的表达构建体，所述多核苷酸编码权利要求4或5所述的融合表位蛋白；较佳地，所述多核苷酸的核苷酸序列如seq id no:2所示，或其简并的序列。7.一种融合表位蛋白的表达系统，所述表达系统含有权利要求6所述的表达构建体或其基因组中整合有外源的权利要求6所述的多核苷酸。8.一种制备所述的融合表位蛋白的方法，包括：利用权利要求7所述的融合表位蛋白的表达系统表达所述的融合表位蛋白；较佳地，所述方法还包括：纯化所述的融合表位蛋白，获得分离的融合表位蛋白。9.一种用于检测sars-cov-2病毒抗体的检测装置，包括：固相载体，以及固定于其上的权利要求4或5所述的融合表位蛋白；较佳地，所述固相载体包括选自：测试垫，测试试纸，芯片，玻片，孔板，微球，磁珠；更佳地，所述检测装置为测试笔，其中包括测试试纸，所述融合表位蛋白固定于所述测试试纸、基于胶体金技术进行测试。
10.一种用于检测sars-cov-2病毒抗体的试剂盒，其中包括权利要求9所述的检测装置。

技术总结
本发明提供了新型冠状病毒融合表位抗原、尿液抗体测试装置及其应用。经过深入的研究筛选，本发明揭示一种新型冠状病毒(SARS-CoV-2)通用融合表位蛋白，与各变异株感染后产生的抗体均有反应。本发明中，还以所述融合表位蛋白作为检测SARS-CoV-2病毒抗体的抗原，制备了一种新型冠状病毒尿样抗体检测的检测装置(测试笔)，尿液为无创取样，在操作和生物安全方面具有明显优势。有明显优势。


技术研发人员：韩斌 王伟萍 朱绎磬 缪维杰 蔡林燕 应建军 寿莹佳 华绍炳
受保护的技术使用者：杭州德同生物技术有限公司
技术研发日：2023.06.25
技术公布日：2023/8/13