一种用于癌症的溶瘤病毒免疫治疗的免疫检查点调节VSV-NDV杂合病毒

一种用于癌症的溶瘤病毒免疫治疗的免疫检查点调节vsv-ndv杂合病毒
技术领域
1.本发明涉及一种重组溶瘤病毒。本发明进一步涉及一种编码重组溶瘤病毒的核酸。本发明还涉及一种包含编码重组溶瘤病毒的核酸的载体。此外，本发明涉及一种包含重组溶瘤病毒的药物组合物。


背景技术：

2.尽管进行了几十年的深入研究，但癌症仍然是主要的全球健康问题，并且在流行病学和经济上都给带来了沉重的社会负担。作为在癌症治疗中激动人心的模式转变，通过利用患者的免疫系统作为治疗的基础，癌症免疫治疗正在快速地改变医学肿瘤学的面貌。溶瘤病毒(oncolytic viruses，ov)最近作为癌症免疫治疗的一个激动人心的亚类赢得了一席之地。通过直接肿瘤细胞溶瘤作用的启动、肿瘤微环境的调节以及刺激靶向肿瘤细胞的适应性免疫反应的潜力，ov提供了一种新的、多机制的方法。因此，ov方法(特别是与其他免疫疗法在合理设计的联合方案的背景下)目前正在深入研究中。
3.癌症免疫治疗涵盖范围广泛的方法，其共同目的是调节患者的免疫系统以识别和排斥入侵的肿瘤细胞。疫苗接种方法和过继免疫细胞疗法，如嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，car)t细胞，依赖于识别合适的肿瘤相关抗原(tumor-associated antigens，taa)和靶向新抗原。由于肿瘤内的异质性和癌症免疫编辑过程，靶向单一抗原的策略会导致选择不表达靶抗原并且可以逃避治疗的肿瘤细胞。此外，由于每种肿瘤都有其独特的基因特征，靶向治疗通常需要昂贵而耗时的肿瘤活检筛查和随后个性化治疗的产生。
4.免疫检查点是一种补偿性控制，其作用是通过抑制t细胞激活和产生t细胞“耗竭”状态来防止对外来抗原的免疫炎症反应的持续激活。肿瘤细胞利用这些免疫检查点创建免疫抑制微环境，在该环境中它们可以逃避免疫清除并继续入侵宿主。免疫检查站越来越多地被认为是癌症免疫治疗的有前景的目标。使用针对关键检查点分子的抗体进行阻断已进入用于有限的癌症适应症市场，但似乎仅对一小部分癌症患者有效，通常对高度发炎且具有高突变负荷的肿瘤有效。此外，全身应用所需的这些高剂量抗体会导致严重的免疫相关毒性。
5.溶瘤病毒(ov)通过其引起直接肿瘤细胞裂解的能力，同时刺激针对肿瘤的免疫反应，为癌症治疗提供了一种巧妙的多模式方法。然而，ov作为单一疗法的潜力受到抗病毒免疫反应相对快速的开始和过继免疫刺激不足以提供全身肿瘤清除以及防止复发的限制。在过去的十年里，增强型ov疗法的开发取得了重大进展，一些载体已进入临床试验。到目前为止，单一ov已获得美国联邦药品监督管理局(fda)和欧洲医学协会(ema)批准作为临床药物使用。该病毒是一种重组单纯疱疹i型病毒(herpes simplex virus i，hsv-i)载体，目前仅被批准用于一种单一适应症，即不可切除的黑色素瘤。此外，us10604574b2涉及治疗性多肽的溶瘤病毒递送。然而，由于在具有免疫能力的宿主中大多数ov疗法对肿瘤的反应不足，临
床试验结果往往令人失望。
6.本发明人先前已经设计了一种杂合溶瘤病毒技术(wo 2017/198779)，该技术结合了溶瘤性水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus，vsv)和新城疫病毒(newcastle disease virus，ndv)的有益特征，同时消除了每种病毒的安全隐患。
7.最近，出现了一种将ov与免疫检查点疗法相结合的策略。其原理是肿瘤内的局部病毒感染可以将“冷”的肿瘤微环境转变为发炎的、以高水平的细胞因子和免疫细胞浸润为特征的“热”环境，从而使肿瘤对免疫检查点阻断的影响敏感。据推测，用溶瘤病毒进行肿瘤治疗会导致肿瘤内共抑制性t细胞受体、程序性细胞死亡蛋白1(programmed cell death protein 1，pd-1)的配体pd-l1上调，并且阻断pd-1和pd-l1之间的相互作用增强了溶瘤免疫治疗效果。一种利用表达spd-1的溶瘤性粘液瘤病毒的策略已经发表[1]。
[0008]
然而，为了充分利用ov与免疫检查点疗法相结合的潜力，必须解决各种障碍。首先，一个挑战是传统的免疫检查点调节由抗体组成的药物，其需要全身性高浓度给药，这往往会导致无法忍受的副作用。其次，免疫疗法高昂的成本极大地限制了将此类药物中的两种单独药物产品组合的可行性。再次，为了优化协同效应，一个挑战是选择一种有效的溶瘤病毒，其将有效的肿瘤减积作用与免疫原性细胞死亡和炎症相结合。
[0009]
因此，本领域需要用于溶瘤病毒治疗的改进的手段和方法以及改进的溶瘤病毒。本发明的目的是提供一种优越的癌症治疗方法，在没有全身毒性的情况下，将最佳的病毒介导的溶瘤作用与有效的免疫介导作用相结合。


技术实现要素：

[0010]
在下文中，将描述本发明的要素。这些要素与特定的实施方案一起列出，然而，应该理解，它们可以以任何方式和任何数量的组合以创建额外的实施例。各种描述的实例和优选实施方案不应被解释为将本发明仅限于明确描述的实施方案。本说明书应理解为支持并涵盖将两个或多个明确描述的实施方案组合的实施方案，或将一个或多个中明确描述的实施方案与任何数量的公开和/或优选要素组合的实施方案。此外，除非上下文另有说明，否则本技术中所有描述的要素的任何排列和组合都应被认为是由本技术的说明书所公开。
[0011]
在第一方面，本发明涉及一种重组溶瘤病毒，
[0012]
包含水疱性口炎病毒(vsv)，
[0013]
其中vsv的糖蛋白(g蛋白)缺失，并且包含
[0014]
新城疫病毒(ndv)的修饰融合蛋白(f蛋白)，以及
[0015]
ndv的血凝素神经氨酸酶(hemagglutinin neuraminidase，hn)蛋白，
[0016]
进一步包含可溶性pd-1(spd-1)。
[0017]
在一个实施方案中，所述重组病毒进一步包含fc结构域或其片段，优选人igg1、igg2、igg3和/或igg4的fc结构域或其片段。
[0018]
在一个实施方案中，所述fc结构域或其片段与所述spd-1融合。
[0019]
在一个实施方案中，所述spd-1是高亲和力spd-1(ha-spd-1)，优选对其配体pd-l1和pd-l2具有的亲和力比野生型spd-1对所述配体的亲和力高至少2倍，例如分别高45倍和30倍，和/或对pd-l1具有kd《3.2μm的亲和力和/或对pd-l2具有kd《0.1μm的亲和力。
[0020]
在一个实施方案中，所述spd-1在选自seq id no.2的132和41的位置处包含突变，
优选选自a132l、l41i和l41v的突变。
[0021]
在一个实施方案中，所述spd-1包含或由具有seq id no.2的序列组成，并且任选地进一步包含在选自seq id no.2的132和41的位置处的突变，优选选自a132l、l41i和l41v的突变。
[0022]
在一个实施方案中，所述spd-1是具有seq id no.3序列的ha-spd-1-a132l。
[0023]
在一个实施方案中，ndv的修饰融合蛋白(f蛋白)是具有seq id no.25序列的f3aa-修饰的f蛋白，
[0024]
和/或在蛋白酶切割位点中包含至少一个氨基酸取代，优选在seq id no.25的l289位，更优选l289a；
[0025]
和/或ndv的修饰融合蛋白(f蛋白)是具有seq id no.4且具有一个氨基酸取代l289a的f3aa-修饰的f蛋白；
[0026]
和/或vsv的g蛋白被具有seq id no.4序列的修饰的融合蛋白和具有seq id no.5序列的ndv的hn蛋白替代。
[0027]
在另一方面，本发明涉及编码如上文所定义的重组溶瘤病毒的核酸。
[0028]
在一个实施方案中，所述核酸包含编码fc结构域或其片段的核酸，优选具有seq id no.7的序列，其与编码所述spd-1的核酸融合，优选具有seq id no.6的序列，其中，优选地，其融合产物具有seq id no.8的核酸序列。
[0029]
在该方面，所述重组溶瘤病毒、所述fc结构域、所述片段和所述spd-1如上文所定义。
[0030]
在另一方面，本发明涉及一种包含如上文所定义的核酸的载体，优选具有seq id no.9的序列，
[0031]
任选地进一步包含以下中的任意一种：
[0032]-报告基因，如hsv1-sr39tk、钠碘转运体(sodium iodide symporter，nis)、生长抑素受体2(somatostatin receptor 2，sstr2)、萤光素酶(萤火虫或海肾)、绿色荧光蛋白(green fluorescence protein，gfp)、lacz和酪氨酸酶中的任意一种；
[0033]-待递送至肿瘤细胞和/或肿瘤组织的基因，例如以下中的任意一种：
[0034]
免疫刺激基因，例如ifn-α、ifn-β或粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony-stimulating factor，gm-csf)、il-12或il-15；
[0035]
免疫检查点抑制性抗体，例如pd-1、pd-1-l、ctla-4、lag-3或b7-h3；和/或
[0036]
用于疫苗接种的肿瘤相关抗原(taa)(对靶向肿瘤是特异性的)；
[0037]-或其组合。
[0038]
在另一方面，本发明涉及如上文所定义的核酸或如上文所定义的载体，其包含或由seq id no.9或15的核苷酸序列组成，
[0039]
或者包含或由与seq id no.9或15的核苷酸序列具有至少60％、优选至少70％或80％、更优选至少90％或95％序列同一性的核苷酸序列组成，
[0040]
或者包含或由seq id no.16的核苷酸序列组成，
[0041]
或者包含或由与seq id no.16的核苷酸序列具有至少60％、优选至少70％或80％、更优选至少90％或95％序列同一性的核苷酸序列组成。
[0042]
在一个优选的实施方案中，如上文所定义的核酸或如上文所定义的载体包含或由
seq id no.9或15的核苷酸序列，或与seq id no.9或15具有至少60％，优选至少70％或80％，更优选至少90％或95％序列同一性的核苷酸序列组成。
[0043]
在另一方面，本发明涉及一种药物组合物，其包含
[0044]
(i)如上文所定义的重组溶瘤病毒、如上文所定义的核酸或如上文所定义的载体；和
[0045]
(ii)任选地，药学上可接受的载体和/或赋形剂，
[0046]
(iii)任选地，另一种药物，例如
[0047]
化学治疗剂，
[0048]
放射治疗剂，
[0049]
肿瘤疫苗，
[0050]
免疫检查点抑制剂，例如抗-ctla4，
[0051]
过继细胞治疗系统，例如t细胞或树突状细胞，
[0052]
细胞载体系统，
[0053]
小分子抑制剂，
[0054]
栓塞剂，
[0055]
屏蔽聚合物。
[0056]
在一个实施方案中，如上文所定义的药物组合物被配制用于全身递送、肿瘤注射、静脉内施用和动脉内施用中的任意一种，
[0057]
和/或用于皮内、皮下、肌内、静脉内、骨内、腹腔内、鞘内、硬膜外、心内、关节内、海绵体内、脑内、脑室内或玻璃体内注射。
[0058]
在另一方面，本发明涉及用作药物的如上文所定义的重组溶瘤病毒、如上文所定义的核酸、如上文所定义的载体、或如上文所定义的药物组合物。
[0059]
在另一方面，本发明涉及用于预防和/或治疗癌症的如上文所定义的重组溶瘤病毒、如上文所定义的核酸、如上文所定义的载体或如上文所定义的药物组合物，例如预防和/或治疗选自肝细胞癌、胰腺癌和黑色素瘤的癌症。
[0060]
在一个实施方案中，如上文所定义的用途的重组溶瘤病毒、如上文所定义的用途的核酸、如上文所定义的用途的载体或如上文所定义的用途的药物组合物与其他疗法组合使用，例如
[0061]
细胞载体系统，例如t细胞、树突状细胞、nk细胞、间充质干细胞，
[0062]
免疫疗法，例如肿瘤疫苗或免疫检查点抑制剂，
[0063]
过继细胞疗法，例如用t细胞或树突状细胞，和/或
[0064]
标准肿瘤疗法，例如射频消融、化疗、栓塞、小分子抑制剂。
[0065]
在另一方面，本发明涉及用于癌症的诊断的如上文所定义的重组溶瘤病毒、如上文所定义的核酸、如上文所定义的载体或如上文所定义的药物组合物，例如癌症的诊断选自肝细胞癌、胰腺癌和黑色素瘤。
[0066]
在另一方面，本发明涉及如上文所定义的重组溶瘤病毒、或如上文所定义的核酸、或如上文所定义的载体、或如上文所定义的药物组合物作为基因递送工具、(无创)病毒生物分布的成像和/或用于肿瘤检测的用途。在一个实施方案中，这种用途是体外用途。
[0067]
在另一方面，本发明涉及诊断、预防和/或治疗癌症的方法，包括向有需要的受试
者施用治疗有效量的如上文所定义的重组溶瘤病毒、或如上文所定义的核酸、或如上文所定义的载体、或如上文所定义的药物组合物。
[0068]
在一个实施方案中，所述给药是全身的、静脉内的、动脉内的，通过注射到肿瘤中，和/或通过皮内、皮下、肌内、静脉内、骨内、腹膜内、鞘内、硬膜外、心内、关节内、海绵体内、脑内、脑室内和玻璃体内注射。
[0069]
在该方面，所述癌症和所述给药均如上文所定义。
[0070]
在另一方面，本发明涉及如上文所定义的重组溶瘤病毒、或如上文所定义的核酸、或如上文所定义的载体、或如上文所定义的药物组合物用于制备用于诊断、预防和/或治疗癌症的药物中的用途。在该方面，所述癌症和所述诊断、所述预防和/或所述治疗如上文所定义。
具体实施方式
[0071]
本发明的增强型病毒是一种修饰的vsv-ndv，其提供了优于传统溶瘤病毒的一些有益特征，例如通过诱导细胞-细胞融合反应产生快速有效的肿瘤细胞溶瘤，同时保持了优越的安全性。受感染的细胞不仅与邻近的肿瘤细胞融合从而杀死它们，而且还会引发一系列事件，导致患者的免疫系统对剩余的未受感染的肿瘤细胞发起攻击，产生炎症性的肿瘤微环境。由于vsv-ndv可以在所有肿瘤细胞中容易地复制，它在多种肿瘤适应症中具有深远的治疗效果。
[0072]
本发明提供了一种在单一治疗剂中具有有效免疫检查点阻断分子的有效溶瘤病毒。本发明人使用安全和免疫刺激性的rvsv-ndv病毒作为载体来表达可溶性pd-1(spd-1)分子，其包含人pd-1的信号传导结构域和可溶性细胞外结构域。重组载体感染肿瘤细胞，在那里复制并引起spd-1的分泌。然后，spd-1附着在周围肿瘤细胞和免疫细胞(即树突状细胞)表面的配体pd-l1和pd-l2上，从而作为诱饵竞争t细胞与其抑制性配体的结合，从而使t细胞保持活性，而不需要抗体(图1)。
[0073]
与通过抗体进行的传统免疫检查点阻断(icb)治疗相比，本发明的创新之处在于它将溶瘤病毒疗法和icb结合到单一治疗剂中，通过直接的溶瘤作用同时使肿瘤减积，并且减轻微环境中的免疫抑制。此外，该方法通过病毒复制和pd-1直接在肿瘤部位的局部释放来允许治疗剂自我扩增，这与抗体方法相比是一个主要的安全益处。
[0074]
本发明的优点在于，首先，载体含有高度融合的ndv融合(f)蛋白，例如ndv/f3aa(l289a)，其诱导有效的免疫原性细胞死亡，并与免疫检查点阻断最佳协同作用；其次，构建体中使用的spd-1优选是与野生型spd-1相比具有增加的亲和力的“高亲和力”版本。这种高亲和力版本例如是通过在氨基酸132(a132l)处引入单个亮氨酸对丙氨酸的取代产生的，以导致与其配体pd-l1和pd-l2[2]的亲和力分别高45倍和30倍，或者例如，是在41位编码异亮氨酸或缬氨酸的高亲和力共有变体对pd-l1的亲和力是野生型的40000倍[3]。再次，ha-spd-1与人igg的fc结构域融合以增强稳定性。在一个实施方案中，fc区直接跟随框中的spd-1序列，其中去除spd-1的终止密码子以产生具有fc结构域的spd-1-fc融合蛋白。在一个实施方案中，与野生型spd-1和/或与野生型pd-1相比，高亲和力spd-1(ha-spd-1)具有增加的亲和力，例如对相应配体的亲和力增加两倍。在一个实施方案中，spd-1的“高亲和力”版本具有野生型spd-1亲和力的至少两倍高的亲和力，例如高5倍的亲和力、高10倍的亲和
力，高30倍的亲和力或高45倍的亲和力。在一个实施方案中，野生型人pd-1对pd-l1和pd-l2分别具有6.36μm和0.19μm的kd值。在一个实施方案中，ha-spd-1(高亲和力spd-1)对pd-l1具有kd《3.2μm的亲和力以及对pd-l2具有kd《0.1μm的亲和力，优选对pd-l1具有kd《0.5μm的亲和力以及对pd-l2具有kd《0.01μm的亲和力，例如对pd-l1和pd-l2分别为0.14μm和0.0065μm。
[0075]
野生型spd-1与其配体的结合可能太弱，无法支持其作为治疗有效方法的应用。本发明的优点是本发明载体中使用的spd-1高亲和力版本更有效，因此在癌症治疗中具有更高的效率。
[0076]
本发明的载体提供了优于基于抗体的icb疗法的几个优点。例如，它提供了pd-1的局部释放，特别是在肿瘤部位，这有可能避免归因于这些抗体全身递送的严重副作用。它还通过肿瘤减积、诱导抗肿瘤免疫反应和肿瘤微环境中的免疫抑制的治疗性调节提供了协同作用机制。此外，rvsv-ndv-spd-1药物产品可能以pd-1抗体的一小部分价格生产，并且比ov与单独的pd-1抗体的联合治疗更具成本效益。此外，本发明的载体有利地对人类使用是安全的。
[0077]
本发明具有进一步的优点，例如优于表达spd-1的溶瘤性粘液瘤病毒的优点。首先，rvsv-ndv载体是一种最佳的溶瘤病毒平台，由于其通过直接的溶瘤作用和诱导高度免疫原性的细胞死亡来杀死肿瘤，导致远隔效应(abscopal effects)，因此是非常安全和高效的。这些优异的治疗效果归因于用ndv(包含融合蛋白(f)和血凝素神经氨酸酶(hn)蛋白)的包膜蛋白取代vsv糖蛋白，更具体地说，通过使用被设计到病毒构建体中的修饰的高融合蛋白(f)。在一个实施方案中，ndv的修饰的融合蛋白(f蛋白)是f3aa-修饰的f蛋白，例如具有seq id no.25的序列，任选地进一步包含在蛋白酶切割位点的至少一个氨基酸取代，优选在seq id no.25的l289位，更优选为l289a。在一个实施方案中，使用ndv融合(f)蛋白的l289a-修饰版本，即ndv/f3aa(l289a)，例如具有seq id no.4的氨基酸序列的蛋白，提供了增加的高融合原性。这些特性是rvsv-ndv与icb组合成为理想ov载体的基础。此外，rvsv-ndv-spd-1载体利用spd-1，优选人spd-1的高亲和力版本，提供了spd-1与其配体更强的相互作用，因此具有更高的治疗效果潜力。最后，高亲和力的spd-1与人igg的fc结构域融合，这提供更高的稳定性以改善体内的药代动力学特征。在一个实施方案中，本发明的核酸和/或载体包含具有seq id no.9或15的核苷酸序列，其中seq id no.9和15均编码vsv-ndv-haspd1-fc，其中seq id no.9进一步包含非编码区。
[0078]
浓度、数量和其他数据可以在本文中以范围格式表达或呈现。应该理解，使用这样的范围格式仅仅是为了方便和简洁，因此应该被灵活地解释为不仅包括明确地列举为范围限制的数值，而且还包括该范围内包含的所有单个数值或子范围，就好像每个数值和子范围都被明确地列举一样。作为说明，“20至100个核苷酸”的数值范围应被解释为不仅包括明确列举的20至100的值，还包括所示范围内的单个值和子范围。因此，包括在该数值范围内的是诸如20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、
…
97、98、100的单个值和诸如从25至35、从20至40、从25至50等的子范围。同样的原理适用于仅列举一个数值的范围，例如“至少25个核苷酸”。此外，无论所描述的范围的广度或特征如何，这种解释都应适用。
[0079]
如本文所用，术语“vsv”涉及水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus，vsv)，其是一种弹状病毒科的负链rna病毒。由于其固有的肿瘤特异性和快速的复制周期
(导致高的肿瘤内滴度和随后的肿瘤细胞裂解)，vsv载体是非常有吸引力的溶瘤剂。vsv的基因组是一个负链rna单分子，编码五种主要蛋白质：糖蛋白(g)、大聚合酶蛋白(l)、磷蛋白(p)、基质蛋白(m)和核蛋白(n)。总基因组约为11000个核苷酸。vsv g蛋白使病毒能够进入。它介导病毒附着到存在于宿主细胞上的ldl受体(ldlr)或ldlr家族成员。结合后vsv-ldlr复合物迅速被内吞。它随后介导病毒包膜与内质膜的融合。vsv通过部分网格蛋白包被囊泡进入细胞；含有病毒的囊泡比常规的囊泡包含更多的网格蛋白和网格蛋白衔接物。含有病毒的囊泡募集肌动蛋白机器(actin machinery)的组分用于相互作用，从而诱导其自身的摄取。复制发生在细胞质中。vsv l蛋白由基因组的一半编码，并与磷蛋白结合以催化mrna的复制。vsv m蛋白由831个核苷酸长的mrna编码并翻译为229个氨基酸的蛋白。预测的m蛋白序列不包含任何可能促进膜结合的长疏水性或非极性结构域。蛋白质富含碱性氨基酸，并含有一个高度碱性的氨基末端结构域。术语“rvsv”与重组水疱性口炎病毒(vsv)有关。
[0080]
vsvindiana完整基因组seq id no.17
[0081]
ncbi genbank登录号j02428.1
[0082]
vsvindianag蛋白seq id no.18
[0083]
核苷酸和氨基酸序列参见genbank登录号x03633.1
[0084]
如本文所用，术语“ndv”涉及新城疫病毒(newcastle disease virus，ndv)，其是副粘病毒科的禽病毒。该科的成员具有单链线性rna。总基因组约为16000个核苷酸。病毒的复制发生在宿主细胞的细胞质中。它是一种负链rna病毒，并且由于其固有的在肿瘤细胞中复制和引起裂解的能力，同时使健康细胞不受伤害，而作为溶瘤病毒被开发出来。i-ii期临床试验表明，与该疗法相关的毒性最小。ndv作为溶瘤剂的一个主要好处是，由血凝素-神经氨酸酶(hn)和融合(f)蛋白组成的病毒包膜不仅介导病毒附着和融合到靶细胞，而且还导致感染细胞与其相邻的未感染细胞融合，为病毒传播和肿瘤细胞杀伤提供了强有力的机制。此外，新的证据表明，由细胞-细胞融合引起的合胞体形成导致多模式细胞死亡反应，这可以与病毒的直接溶瘤作用协同作用，形成强有力的肿瘤破坏机制。
[0085]
新城疫病毒的两种蛋白质被插入到包膜内。它们是血凝素/神经氨酸酶蛋白(hn)和融合蛋白(f)。这两种蛋白质在确定病毒的毒力以及病毒如何感染宿主细胞方面很重要。血凝素/神经氨酸酶蛋白有两个值得关注的部分：(1)血凝素部分，其是一种附着蛋白并且与包括红细胞在内的宿主细胞的膜外侧上的受体结合。(2)神经氨酸酶部分是一种酶的活性位点，有助于从宿主细胞膜中释放病毒。该酶的活性影响病毒从红细胞中洗脱所需的时间。
[0086]
融合蛋白f将病毒包膜融合到宿主细胞的膜上。这允许通过病毒基因组浸润宿主细胞。为了使融合发生，必须改变天然融合蛋白的形状。当宿主细胞蛋白酶在特定的切割位点切割蛋白质时就会发生这种变化。这种情况发生后，融合蛋白被激活，并且即可融合到细胞膜上。切割位点周围的氨基酸序列决定了可以激活蛋白质切割的蛋白酶的范围。因此该序列决定了病毒毒力。ndv f蛋白是负责病毒与细胞膜的融合，并负责通过合胞体的形成使病毒在细胞间传播。在f蛋白内存在多碱基切割位点以允许被广泛的蛋白酶蛋白质切割和激活，并且是强毒性病毒株毒力的决定因素。发明人先前已经证明，与仅携带f3aa突变的病毒相比，在f3aa-修饰的融合蛋白中，从亮氨酸到丙氨酸的第289位氨基酸(l289a)的单一氨基酸取代导致实质上更大的合胞体形成和肿瘤坏死，并且没有任何额外的毒性[4]。rndv/
f3aa菌株的融合活性和溶瘤活性可以通过f蛋白中残基289处从亮氨酸到丙氨酸的点突变产生rndv/f3aa(l289a)而进一步增强。在原位免疫活性肝肿瘤大鼠模型中，通过肝动脉输注突变病毒的施用导致显著的合胞体形成和坏死，这转化成为了比用原始rndv/f3aa病毒治疗显著延长20％的生存期[4]。
[0087]
ndvhitchnerb1完整基因组seq id no.20
[0088]
genbank登录号af375823
[0089]
ndvhn蛋白seq id nos.5和19
[0090]
核酸和氨基酸序列参见genbank登录号af375823和ncbi基因id912270。
[0091]
ndvf蛋白seq id nos.21和22
[0092]
核酸和氨基酸序列参见genbank登录号af375823和ncbi基因id912271。
[0093]
ndvf3aa-修饰的融合蛋白seq id nos.24和25
[0094]
具有l289a的ndvf3aa-修饰的融合蛋白seq id nos.23和4
[0095]
如上文所述，本发明提供了重组溶瘤vsv病毒，其中vsv的糖蛋白是假型的，并且其进一步包含可溶性pd-1。在一个实施方案中，当提及“进一步包含可溶性pd-1”的病毒时，这优选是指这样一种情况，其中所述病毒的核酸优选为编码所述可溶性pd-1的所述病毒的基因组；例如编码可溶性pd-1的vsv和/或vsv-ndv的病毒基因组。例如，编码所述可溶性pd-1的核酸可以通过基因修饰并入到病毒基因组中，例如vsv或vsv-ndv杂合病毒的基因组。在一个实施方案中，从该病毒基因组表达所述可溶性pd-1，例如通过诸如癌细胞的细胞。在一个实施方案中，进一步包含可溶性pd-1的重组溶瘤病毒包含编码所述可溶性pd-1的核酸序列。在一个实施方案中，重组溶瘤病毒进一步包含可溶性pd-1作为重组溶瘤细胞病毒的病毒基因组的一部分，优选作为vsv的病毒基因组一部分。在一个实施方案中，可溶性pd-1表达为重组蛋白。在一个实施方案中，感染所述重组溶瘤病毒的细胞(例如癌细胞)表达所述可溶性pd-1。在一个实施方案中，进一步包含可溶性pd-1的重组溶瘤病毒是编码所述可溶性pd-1的重组溶瘤病毒；优选在所述病毒的基因组中编码所述可溶性pd-1。将病毒的糖蛋白(“假型化”)与异源病毒的糖蛋白交换的理念此前已被证明是改变病毒嗜性的有效手段。使用这种方法，病毒骨架保持完整，因此，病毒在易感细胞中的复制应该受到最小的影响。
[0096]
在一个实施方案中，vsv的g蛋白被修饰的融合蛋白(优选在l289位具有氨基酸取代的修饰的融合蛋白(f)，例如l289a，以及ndv的hn蛋白)替换。在一个实施方案中，重组溶瘤病毒还包含vsv的其余蛋白，即大聚合酶蛋白(l)、磷蛋白(p)、基质蛋白(m)和核蛋白(n)。例如，vsv的内源性糖蛋白可以从编码全长vsv基因组的质粒中删除。包含修饰的融合蛋白(ndv/f(l289a))和血凝素-神经氨酸酶(ndv/hn)的ndv糖蛋白可以作为离散转录单元插入vsv基质(m)和大聚合酶(l)基因之间(参见图2a和wo 2017/198779)。在一个实施方案中，ndv的修饰融合蛋白(f蛋白)是f3aa-修饰的f蛋白，任选地在蛋白酶切割位点包含至少一个氨基酸取代，优选在l289位置，例如l289a。
[0097]
在本发明的载体，优选重组vsv(rvsv)载体的一个实施方案中，ndv的修饰融合蛋白(f蛋白)包含或由seq id no.25[＝f3aa蛋白氨基酸序列]或seq id no.4[＝f3aa蛋白/l289a氨基酸序列]的氨基酸序列，
[0098]
或与seq id nos.25或4的氨基酸序列具有至少60％、或优选至少70％或80％或90％或95％序列同一性的氨基酸序列组成，
[0099]
和/或其中ndv的修饰融合蛋白(f蛋白)由seq id no.24[＝f3aa蛋白的核苷酸序列]或seq id no.23[＝f3aa蛋白/l289a核苷酸序列]的核苷酸序列，
[0100]
或由与seq id no.24或23的核苷酸序列具有至少60％、或优选至少70％或80％或90％或95％序列同一性的核苷酸序列编码。
[0101]
在本发明的载体，优选rvsv载体的一个实施方案中，ndv的hn蛋白包含或由seq id no.5的氨基酸序列，
[0102]
或与seq id no.5的氨基酸序列具有至少60％、或优选至少70％或80％或90％或95％序列同一性的氨基酸序列组成，
[0103]
和/或ndv的hn蛋白由seq id no.19的核苷酸序列或与seq id no.19的核苷酸序列具有至少60％、或优选至少70％或80％或90％或95％序列同一性的核苷酸序列编码。
[0104]
本发明包括编码本发明溶瘤病毒的核酸。本发明进一步包括包含本发明核酸的载体。
[0105]
在一个实施方案中，本发明的载体还包括以下中的任意一种：
[0106]-报告基因，
[0107]
如hsv1-sr39tk、钠碘转运体(nis)、生长抑素受体2(sstr2)、萤光素酶(萤火虫或海肾)、绿色荧光蛋白(gfp)、lacz和酪氨酸酶中的任意一种，
[0108]-待递送至肿瘤细胞和/或肿瘤组织的基因，例如以下中的任意一种：
[0109]
免疫刺激基因，例如ifn-α、ifn-β或粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)、il-12或il-15；
[0110]
免疫检查点抑制性抗体，例如pd-1、pd-l1、ctla-4、lag-3或b7-h3；和
[0111]
用于疫苗接种的肿瘤相关抗原(taa)(对靶向的肿瘤是特异性的)；
[0112]-及其组合。
[0113]
本发明提供了用作药物的重组溶瘤病毒、本发明的核酸、本发明的载体和/或本发明的药物组合物。本发明进一步提供了用于癌症的诊断、预防和/或治疗的重组溶瘤病毒、本发明的核酸、本发明的载体和/或本发明的药物组合物。本发明还提供了用于溶瘤治疗，特别是溶瘤病毒治疗的重组溶瘤病毒、本发明的核酸、本发明的载体和/或本发明的药物组合物。如本文所用，术语“溶瘤病毒治疗”是指通过施用溶瘤病毒、编码它们的核酸或相应的载体以诱导肿瘤消退的癌症疗法。在一个实施方案中，本发明的重组溶瘤病毒、本发明的核酸、本发明的载体和/或本发明的药物组合物用于与其他疗法组合使用，例如
[0114]
细胞载体系统，例如t细胞、树突状细胞、nk细胞、间充质干细胞，
[0115]
免疫疗法，例如肿瘤疫苗或免疫检查点抑制剂，
[0116]
过继细胞疗法，例如用t细胞或树突状细胞，和/或
[0117]
标准肿瘤治疗，例如射频消融、化疗、栓塞、小分子抑制剂。
[0118]
在一个实施方案中，对有需要的患者施用重组溶瘤病毒、核酸、载体和/或药物组合物是全身的、静脉内的、动脉内的、通过注射到肿瘤中，和/或通过皮内、皮下、肌内、静脉内、骨内、腹膜内、鞘内、硬膜外、心内、关节内、海绵体内、脑内、脑室内和玻璃体内注射。在一个优选的实施方案中，将包含本发明的重组溶瘤病毒的药物组合物配制为液体组合物用于给药，例如静脉内或肿瘤内给药。该组合物以合适的间隔施用于有需要的患者，例如一周一次，持续1至15周。
[0119]
本发明进一步提供了一种癌症的诊断、预防和/或治疗方法，包括向有需要的受试者施用治疗有效量的重组溶瘤病毒、本发明的核酸或载体或本发明的药物组合物的步骤。本发明的重组溶瘤病毒、核酸或载体的治疗有效量是导致所需治疗结果特别是肿瘤消退的量。
[0120]
重组病毒、核酸、载体或其药物组合物优选在一段时间内以多次循环给药，例如数天至数周。在一个实施方案中，本发明的药物组合物包含载体和/或赋形剂，例如生理缓冲液，和/或聚合物和/或脂质以提高稳定性和肿瘤转导效率。
[0121]
本发明还涉及本发明的重组溶瘤病毒、核酸、载体和/或药物组合物作为基因递送工具、病毒生物分布的成像(无创)和/或用于肿瘤检测的体外和/或离体用途。本发明的载体包含插入到vsv g-缺失载体中的修饰的高融合原性f蛋白和ndv hn附着蛋白。通过创建这两种有效溶瘤载体的杂合体，融合了每种病毒的积极特征，同时消除了每种病毒的安全隐患。得到的载体具有vsv骨架，因此维持了野生型vsv的快速复制周期。此外，由于并入ndv的hn和高融合原性f蛋白，重组病毒诱导增强的合胞体形成，允许病毒能够有效地在肿瘤内传播，以及肿瘤细胞死亡和诱导抗肿瘤免疫应答的有效机制。使用这种策略，可以实现融合病毒的益处，而无需受与ndv相关环境的威胁。此外，由于内源性vsv糖蛋白已缺失，因此没有与载体相关的神经毒性。最后，由于ndv通过唾液酸残基附着在靶细胞上，唾液酸残基可在肿瘤细胞上上调，因此本发明用假型载体实现了额外的肿瘤靶向转导。除了病毒更安全之外，由于vsv包膜蛋白被ndv包膜蛋白取代，特异性病毒修饰允许提供高效的病毒。已经引入了ndv f蛋白的突变版本，以进一步提高所得到的重组病毒的效力，而不会对安全性产生负面影响。除此之外，载体还包括高仿射可溶性pd-1，其允许对免疫检查点的高效抑制。
[0122]
具有糖蛋白交换的载体的益处有三重：
[0123]
1.与内源性vsv糖蛋白相关的神经向性可以通过vsv包膜的缺失和引入非神经向性ndv包膜蛋白来避免；
[0124]
2.可以通过唾液酸残基的上调靶向肿瘤细胞，唾液酸残基是ndv的天然受体；和
[0125]
3.通过引入ndv f蛋白的高度融合突变版本，可以显著提高病毒传播。
[0126]
与其他载体相比，本发明的病毒提供了改善的安全性和增强的效力。此外，使用rvsv-ndv载体骨架是有利的，因为它具有高融合特性，在普通人群中缺乏预先存在的免疫力，并且与vsv或ndv相比没有预期的衰减。此外，spd-1与fc融合的优点是，首先，spd-1的稳定性增加，并且其次，fc结构域使复合物能够与免疫细胞上的fc受体相互作用，这进一步有助于免疫治疗。优选地，本发明的重组溶瘤病毒是重组溶瘤水疱性口炎病毒(vsv)。在一个实施方案中，本发明的重组溶瘤病毒包含溶瘤病毒，如wo 2017/198779中所定义的，进一步包含可溶性pd-1(spd-1)，优选高亲和力spd-1(ha-spd-1)，例如具有seq id no.3的高亲和力spd-1-变体，任选地进一步包含fc结构域，其中所述任选的fc结构区优选与所述spd-1融合。在一个实施方案中，本发明的重组溶瘤病毒包含溶瘤病毒，如wo 2017/198779中所定义的，进一步包含spd-1，优选高亲和力spd-1(ha-spd-1)，例如具有seq id no.3的高亲和力spd-1-变体，进一步包含与所述spd-1融合的fc结构域。在一个实施方案中，本发明的病毒包含vsv的n蛋白、p蛋白、m蛋白和l蛋白，ndv的修饰f蛋白和hn蛋白，以及ha-spd-1-fc融合蛋白和/或编码这些蛋白的基因。
[0127]
如本文所用，术语“fc结构域”涉及抗体的片段可结晶区，其是与细胞表面受体相
互作用的抗体的尾部区域，例如fc受体和补体系统的一些蛋白质。在一个实施方案中，fc结构域是人igg1-fc结构域、igg2-fc结构域、igg3-fc结构域和igg4-fc结构域中的任一种。在一个实施方案中，当提到“fc结构域”和/或“fc结构域或其片段”时，该术语还包括fc结构域的生物功能性片段，例如fc结构域的ch3片段，即该术语包括整个fc结构域及其片段，例如ch3片段。fc结构域的片段通常是fc结构域的生物功能片段，即该片段具有与细胞表面受体(例如fc受体)相互作用和/或与补体系统的成分(例如ch3片段)相互作用的能力。
[0128]
在一个实施方案中，患者对感染本发明重组病毒的反应诱导高度发炎的肿瘤微环境，从而使肿瘤对免疫检查点抑制敏感。在一个实施方案中，术语“受试者”和“患者”可互换使用，并且优选地涉及哺乳动物患者，更优选地涉及人类患者。
[0129]
在一个实施方案中，术语“可溶性pd-1”涉及程序性细胞死亡蛋白1(pd-1)的可溶性形式。pd-1是一种免疫检查点，即一种通过下调免疫系统在调节免疫系统反应中起作用并通过抑制t细胞炎症活性来促进自身耐受的蛋白质。pd-1有两个配体，即pd-l1和pd-l2，它们是b7家族的成员。pd-1通常具有如seq id no.1所示的序列。pd-1是细胞表面的蛋白质，并且可溶性pd-1是其可从细胞分泌的可溶性形式。可溶性pd-1通常具有如seq id no.2所示的序列。在一个实施方案中，可溶性pd-1是具有seq id no.3序列的高亲和力spd-1。在一个实施方案中，本发明的病毒和/或本发明的药物组合物包含与具有seq id no.1-3中任一个(优选具有seq id no.3)的氨基酸序列具有至少60％、优选80％、更优选95％或更多例如99％的序列同一性的spd-1。在一个实施方案中，本发明的病毒、本发明的核酸、本发明的载体和/或本发明的药物组合物包含与编码具有seq id no.1-3中任一个(优选具有seq id no.3)的氨基酸序列的核酸具有至少60％、优选80％、更优选95％或更多例如99％的序列同一性的spd-1，例如具有seq id no.6序列的核酸。由于遗传密码的密码子冗余，当涉及核酸时，也包括编码相同氨基酸序列且包含替代密码子的替代核酸序列。
[0130]
术语“融合”和/或“融合蛋白”，如本文在spd-1和fc的上下文中所使用的，涉及通过最初编码分离蛋白的两个或多个基因的连接而产生的蛋白的融合，例如spd-1和fc。这种融合基因的翻译，例如spd-1-fc，产生具有来源于每个原始蛋白质的功能特性的单个或多个多肽。蛋白质的融合通常包括从编码第一种蛋白质的cdna序列中去除终止密码子，然后通过本领域技术人员已知的方法，例如连接或重叠延伸pcr，将第二种蛋白质的cdna序列附加在框架中。所得dna序列将通过细胞表达为单个蛋白质。该蛋白质可以被改造为包括两种原始蛋白质的完整序列，或者仅包括其中一种的一部分。任选地，在融合蛋白的组分之间可以包括接头。在一个实施方案中，术语“融合产物”涉及通过融合两个或多个基因产生的产物，例如包含编码fc结构域的核酸的融合基因，优选具有seq id no.7的序列，并且包含编码spd-1的核酸，优选具有seq id no.6的序列，和/或由这样的融合基因编码的产物。在一个实施方案中，ha-spd-1和fc的示例性融合产物具有seq id no.8的核酸序列和/或seq id no.13的氨基酸序列。在一个实施方案中，fc结构域或其片段与spd-1(例如ha-spd-1)融合，这意味着编码fc结构域或其片段的核酸与编码spd-1(例如ha-spd-1)的核酸融合。在一个实施方案中，当在ndv的融合(f)蛋白的上下文中使用时，术语“融合蛋白”不涉及连接在一起的两种或多种蛋白质，而是该术语涉及诱导病毒包膜与细胞受体融合的蛋白质。
[0131]
如本文所用，术语“高亲和力”涉及与相应野生型蛋白(例如spd-1)对相应结合伴侣的亲和力相比，修饰蛋白(例如ha-spd-1)对其结合伴侣(例如pd-l1)的亲和力增加。在一
个实施方案中，与野生型spd-1相比，“高亲和力”版本的spd-1(ha-spd-1)对其配体具有增加的亲和力，例如增加两倍的亲和力。这种高亲和力版本例如是通过在spd-1的氨基酸132处引入单个亮氨酸对丙氨酸的取代(a132l)而产生的，这导致更高的亲和力，例如与其配体pd-l1和pd-l2的亲和力分别高45倍和30倍，或者例如，编码41位异亮氨酸或缬氨酸的高亲和力共有变体产生更高的亲和力，例如与野生型spd-1相比对pd-l1的亲和力高40000倍。在一个实施方案中，高亲和力spd-1对pd-l1的kd《3.2μm，并且对pd-l2的kd《0.1μm。在一个实施方案中，突变优选为点突变。
[0132]
seq id no.1代表人pd-1的氨基酸序列。
[0133]
seq id no.2代表人pd-1(可溶性)的氨基酸序列。
[0134]
seq id no.3代表示例性高亲和力pd-1(可溶性)的氨基酸序列，其为ha-spd-1-a132l。
[0135]
seq id no.4代表ndv的具有氨基酸取代l289a的f3aa-修饰融合蛋白(f蛋白)的氨基酸序列。
[0136]
seq id no.5代表ndv的hn蛋白的氨基酸序列。
[0137]
seq id no.6代表编码示例性高亲和力pd-1(可溶性)的核酸序列，其为ha-spd-1-a132l。
[0138]
seq id no.7代表人igg1-fc的核酸序列；人igg1重链的ch2和ch3结构域以及铰链区。
[0139]
seq id no.8代表示例性高亲和力可溶性pd-1-igg1-fc融合基因的核酸序列。
[0140]
seq id no.9代表包含构建体vsv-ndv-ha-spd-1-fc的本发明的示例性载体的核酸序列。
[0141]
seq id no.10代表n蛋白的氨基酸序列。
[0142]
seq id no.11代表p蛋白的氨基酸序列。
[0143]
seq id no.12代表m蛋白的氨基酸序列。
[0144]
seq id no.13代表ha-spd-1-fc蛋白的氨基酸序列。
[0145]
seq id no.14代表l蛋白的氨基酸序列。
[0146]
seq id no.15代表构建体vsv-ndv-ha-spd-1-fc的核酸序列。
[0147]
seq id no.16代表rvsv-ndv-spd-1的总核酸序列，其中所述spd-1是没有高亲和力修饰的正常spd-1，并且其中所述序列不包含fc编码序列。
[0148]
seq id no.17代表vsv indiana的完整基因组。
[0149]
seq id no.18代表vsv indiana g蛋白的氨基酸序列。
[0150]
seq id no.19代表ndv hn蛋白的核酸序列。
[0151]
seq id no.20代表ndv hitchner b1的完整基因组。
[0152]
seq id no.21代表ndv f(未修饰的)蛋白的核酸序列。
[0153]
seq id no.22代表ndv f(未修饰的)蛋白的氨基酸序列。
[0154]
seq id no.23代表具有l289a的ndv f3aa-修饰的融合蛋白的核酸序列。
[0155]
seq id no.24代表ndv f3aa-修饰的融合蛋白的核酸序列。
[0156]
seq id no.25代表ndv f3aa-修饰的融合蛋白的氨基酸序列。
[0157]
seq id no.26代表人可溶性pd-1(spd-1)的核酸序列。
附图说明
[0158]
现在通过参考以下附图来进一步描述本发明。
[0159]
下面的附图描述中提到的所有方法都是按照实施例中详细的描述来实施的。
[0160]
图1显示了pd-1/pd-l1相互作用和可溶性pd-1的干扰。当耗竭t细胞与表达pd-l1的肿瘤细胞接触时，t细胞上的pd-1参与并失活，允许肿瘤细胞逃避免疫清除。可溶性pd-1的局部表达与t细胞表达的pd-1竞争其与pd-l1配体的结合，并干扰相互作用，使t细胞能够保持功能并引发其对肿瘤细胞的细胞毒性效应功能[5]。
[0161]
图2显示了本发明的rvsv-ndv骨架(a)和rvsv-nda-spd-1构建体(b)。
[0162]
a)表达ndv糖蛋白的重组假型vsv构建体(参见wo 2017/198779a1)。将vsv的内源性糖蛋白从编码全长vsv基因组的质粒中缺失。将包含修饰的融合蛋白(ndv/f(l289a))和血凝素-神经氨酸酶(ndv/hn)的ndv糖蛋白，作为离散转录单元插入vsv基质(m)和大聚合酶(l)基因之间。使用已建立的反向遗传学系统拯救各自的假型vsv载体。
[0163]
b)本发明的构建体包含与人igg的fc结构域融合的可溶性人pd-1基因，优选高亲和力可溶性人pd-1基因(ha-spd-1)。与人igg的fc结构域融合的高亲和力可溶性人pd-1基因(ha-spd-1)被克隆为ndv附着蛋白(hn)和vsv大聚合酶(l)基因之间的附加转录单元。示出了所得的病毒基因组。
[0164]
图3显示了rvsv-ndv-ha-spd-1-fc在小鼠黑色素瘤细胞中以轻微衰减进行复制。用感染复数(moi)为0.01的rvsv-ndv-gfp或rvsv-ndv-ha-spd-1-fc感染小鼠黑色素瘤细胞系b16-ova。感染1小时后，洗涤细胞，并向细胞中加入新鲜培养基。在感染后的不同时间点收集上清液的等分试样，用tcid50测定法测量病毒滴度。实验重复进行三次，数据表示为平均值+/-平均值的标准误差。
[0165]
图4显示了rvsv-ndv-ha-spd-1-fc有效杀死小鼠黑色素瘤细胞。用感染复数(moi)为0.01的rvsv-ndv-gfp或rvsv-ndv-ha-spd-1-fc感染小鼠黑色素瘤细胞系b16-ova。感染1小时后，洗涤细胞并向细胞中加入新鲜培养基。在感染后的不同时间点收集上清液的等分试样，用ldh测定细胞毒性。实验重复进行三次，数据表示为平均值+/-平均值的标准误差。
[0166]
图5显示了rvsv-ndv-ha-spd-1-fc导致携带同源基因b16-ova黑色素瘤细胞的免疫能力小鼠的肿瘤生长延迟。在雄性c57bl/6小鼠侧腹皮下植入2.4
×
105个b16-ova细胞。在肿瘤植入后的第7、10和13天，将pbs或107tcid50的rvsv-ndv-gfp或rvsv-ndv-ha-spd-1-fc以50μl的体积注射到肿瘤中。每天监测肿瘤大小，并使用公式：4/3*pi()*((l+w)/4)3计算肿瘤体积。示出了每种治疗的个体肿瘤生长曲线。每条曲线代表一个单独的小鼠。
[0167]
图6显示了瘤内注射rvsv-ndv-ha-spd-1-fc可显著延长b16-ova荷瘤小鼠的存活时间。在雄性c57bl/6小鼠侧腹皮下植入2.4
×
105个b16-ova细胞。在肿瘤植入后的第7、10和13天，将pbs或107tcid50的rvsv-ndv-gfp或rvsv-ndv-ha-spd-1-fc以50μl的体积注射到肿瘤中。每天对小鼠进行监测，当肿瘤直径达到1.5cm或皮肤因肿瘤生长而破裂时实施安乐死。将治疗后的存活时间绘制为kaplan-meier生存曲线，并通过时序检验确定统计学显著性。rvsv-ndv-ha-spd-1-fc相对于pbs的p值《0.05。
[0168]
图7显示了编码可溶性pd1(spd1)的示例性重组vsv-ndv载体。将人spd1基因克隆到vsv-ndv载体中，作为血凝素-神经氨酸酶(hn)和大聚合酶(l)基因之间的单独转录单元。额外的修饰包括高亲和力(ha)突变和与经过额外改造的人fc片段的融合。示出了所得的基
因组。
[0169]
图8显示了与对照rvsv ndv-gfp相比，rvsv-ndv-spd1变体在b16黑色素瘤细胞中具有相似的生长动力学和细胞毒性作用。在体外用moi为0.01的rvsv-ndv-gfp、rvsv-ndv-spd1、rvsv-ndv-ha-spd1、rvs-vndv-spd1-fc或rvsv-ndv-ha-spd1-fc感染小鼠b16黑色素瘤细胞。上图：在感染后24小时和48小时，以200倍放大倍数获得代表性显微照片。未感染的b16细胞作为对照。左下：使用乳酸脱氢酶测定法(ldh，promega)对感染后不同时间点的细胞毒性进行定量。示出了重复实验的平均值+平均值的标准误差。右下：对感染后多个时间点采集的上清液等分试样进行tcid50分析，以分析病毒生长动力学。示出了三次重复实验的平均值+平均值的标准误差。
[0170]
图9显示了表达spd1的重组vsv-ndv载体产生并分泌人pd1。用moi为0.01的表达可溶性人pd1的vsv-ndv-gfp或vsv-ndv变体(vsv-ndv-spd1、vsv-nd-vha-spd1、vsv-ndv-spd1-fc或vsv-ndv-ha-spd1-fc)感染或模拟感染b16小鼠黑色素瘤细胞。左：在感染后的不同时间点收集细胞裂解物和上清液的等分试样，并对人pd1或gapdh进行蛋白质印迹分析。右：在24小时收集上清液的等分试样，并进行elisa测定用于释放的人pd1的定量。示出了平均值+平均值的标准误差。
[0171]
图10显示了与vsv-ndv对照相比，用rvsv-ndv-ha-spd1-fc治疗具有免疫能力的荷瘤小鼠导致了对肿瘤生长改善的控制和肿瘤特异性t细胞的富集。a)雌性c57bl/6小鼠在对侧腹皮下植入同源基因b16黑色素瘤细胞。将pbs、107tcid50的rvsv-ndv或rvsv-ndv-ha-spd1-fc注射到右侧的肿瘤中，而左侧的肿瘤保持未处理。每天监测肿瘤体积，并在第15天采集血液。b)使用ova特异性四聚体通过流式细胞术对循环ova特异性t细胞进行定量，以染色从血液中获得的外周血单核细胞(pbmc)。示出了单个数据点、平均值和标准误差。c)与rvsv-ndv和pbs组相比，rvsv-ndv-ha-spd1-fc组的肿瘤体积显著减少。
[0172]
在下文中，参考实施例，给出这些实施例是为了说明而非限制本发明。
[0173]
实施例
[0174]
实施例1：rvsv-ndv-spd-1病毒的制备
[0175]
为了构建rvsv-ndv-spd-1病毒，首先通过rt-pcr从人pbmc中扩增pd-1的信号传导结构域和细胞外结构域。产生的rt-pcr产物用作模板进行一轮重叠pcr，以引入高亲和力的a132l突变，产生2个包含突变碱基对的重叠pcr片段。将这些片段退火并进行最后的延伸步骤以产生全长ha-spd-1基因。将ha-spd-1片段克隆到pfuse-higg1-fc1中，以产生ha-spd-1与人fc片段的融合基因。为了将ha-spd-1-fc构建体插入rvsv-ndv中，使用正向和反向寡核苷酸引入合适的限制性位点，并通过pcr扩增。最后，通过ndv-hn和vsv-l基因之间的多克隆位点，将插入物作为附加的转录单元连接到全长vsv-ndv基因组中。病毒构建体如图2b所示。使用已建立的反向遗传学方法拯救了相应的感染性重组病毒。
[0176]
实施例2：rvsv-ndv-spd-1病毒的表征
[0177]
在小鼠黑色素瘤细胞系b16-ova中对重组vsv-ndv-ha-spd-1-fc病毒进行表征。将病毒的生长动力学与亲本rvsv-ndv病毒进行比较，发现由于转基因的表达而略有减弱，并且在感染后约48小时达到复制峰值，感染复数(moi)为0.01(图3)。与这些发现一致，在相同细胞中进行的细胞毒性分析显示，rvsv-ndv-ha-spd-1-fc感染对肿瘤细胞的杀伤略有延迟，但在感染后72小时，细胞单层几乎完全杀伤(图4)。因此，与没有ha-spd-1-fc的病毒相
比，vsv-ndv-ha-spd-1-fc病毒在感染后72小时后提供了增强的效率。
[0178]
实施例3：rvsv-ndv-spd-1病毒在体内的抗癌作用
[0179]
为了确定体内疗效，在具有免疫能力的c57bl/6小鼠中进行了实验，该小鼠的侧腹皮下带有b16-ova肿瘤。在肿瘤植入后第7、10和13天，将pbs或107tcid50的rvsv-ndv-gfp或rvsv-ndv-ha-spd-1-fc以50μl的体积注射到肿瘤中。每天测量肿瘤，并使用以下公式：v＝4/3*pi()*((l+w)/4)3计算肿瘤体积。数据显示，与pbs相比，在用rvsv-ndv-gfp处理的小鼠中肿瘤生长显著延迟，这在接受rvsv-ndv-ha-spd-1-fc的小鼠中更为明显(图5)。
[0180]
实施例4：用rvsv-ndv-ha-spd-1-fc处理的小鼠的存活率增加
[0181]
在一项存活率的研究中，在人道终点(当肿瘤直径达到1.5cm或肿瘤生长导致皮肤破裂时)对小鼠实施安乐死。绘制了第一次处理剂量的存活时间，并且显示与pbs相比，用rvsv-ndv-ha-spd-1-fc处理的小鼠的存活时间显著延长，中位存活时间分别为26天和14天(图6)。浅灰色线表示用pbs处理后的存活时间；中灰色表示rvsv-ndv-gfp处理的存活时间；黑色表示rvsv-ndv-ha-spd-1-fc处理的存活时间。数据表明，与用缓冲液或亲本rvsv-ndv病毒处理相比，用rvsv-ndv-ha-spd-1-fc处理导致肿瘤生长显著延迟，导致生存期延长。
[0182]
实施例5：编码可溶性pd1(spd1)的重组vsv-ndv载体
[0183]
一组编码可溶性pd1的vsv-ndv重组载体，无论是带有人fc片段(spd1-fc)还是不带有(spd1)，以及无论带有高亲和力突变(ha-spd1)还是不带有，都被建立的反向遗传系统改造并拯救(图7)。与体外对照rvsv-ndv载体相比，这些rvsv-ndv-spd1变体得到了充分表征，并且选择rvsv-ndav-ha-spd1-fc载体在小鼠黑色素瘤的免疫活性模型中进行体内进一步表征。
[0184]
实施例6:rvsv-ndv-spd1变体在b16小鼠黑色素瘤细胞中复制良好并引起细胞毒性
[0185]
为了在体外表征rvsv-ndv-spd1变体组，选择b16小鼠黑色素瘤细胞系作为代表。用感染复数(moi)为0.01的各种spd1变体或vsv-ndv-gfp对照病毒感染b16细胞。在感染后的不同时间点对细胞进行显微镜检查，以观察细胞毒性作用。此外，收集上清液样品，通过乳酸脱氢酶(ldh)测定法分析细胞活力，并通过组织培养感染剂量50(tcid50)测定法进行病毒复制的定量。这些数据显示，在spd1变体中或与rvsv-ndv相比，病毒复制或肿瘤细胞杀伤动力学没有实质性变化(图8)。
[0186]
实施例7:rvsv-ndv-spd1变体在体外产生并释放可溶性人pd1
[0187]
为了证实重组构建体产生并释放可溶性人pd1，进行了蛋白质印迹和elisa测定。用moi为0.01的表达spd1的vsv-ndv构建体或对照vsv-ndv-gfp感染b16细胞或保持未感染，在感染后的不同时间点收集裂解物和上清液，并对spd1进行蛋白质印迹分析。此外，对gapdh进行分析以控制蛋白质负载。正如预期的那样，受spd1病毒感染的样本产生了预期大小的条带，而表达spd1-fc融合蛋白的病毒的大小发生了相当大的改变，这与spd1和fc片段的相加大小相对应(图9，左图)。对24小时收集的附加上清液样品进行elisa测定，以定量分泌到上清液中的pd1的量。正如预期的那样，只有来自感染表达spd1的vsv-ndv的细胞样本产生了可检测水平的pd1，而那些表达与fc片段融合的spd1(spd1-fc)的样本的pd1水平甚至高于没有融合的样本，这支持了fc片段的存在稳定了细胞外spd1的假设(图9，右图)。
[0188]
实施例8：同源基因小鼠黑色素瘤的体内rvsv-ndv-ha-spd1-fc处理导致肿瘤特异
性t细胞反应增强和肿瘤生长延迟
[0189]
对于vsv-ndv介导的spd1表达的体内分析，发明人将重点放在ha-spd1-fc变体上，这是由于通过ha突变的高亲和力结合的潜在益处以及由spd1与fc片段的融合所提供的血液中的稳定性。发明人利用b16黑色素瘤的皮下模型，其中肿瘤被植入对侧腹部，并在肿瘤植入后第7、10和13天将剂量为107tcid50的pbs、rvsv-ndv或rvsv-nda-ha-spd1-fc瘤内注射到右侧腹部的病变中(图10a)。从第15天采集的血液中分离外周血单核细胞(pbmc)，并对b16细胞表达的模型抗原卵清蛋白特异性cd8+t细胞进行facs分析。虽然与pbs相比，vsv-ndv处理导致ova特异性t细胞的统计学显著增加，但在用rvsv-ndv-ha-spd1-fc处理的小鼠中，该作用甚至进一步增加(图10b)。此外，对注射的和对侧未注射病变的肿瘤生长的分析显示，与rvsv-ndv-处理或pbs-处理相比，rvsv-ndv-ha-spd1-fc-处理的动物生长延迟(图10c)。这些结果表明，rvsv-ndv-ha-spd1-fc允许增强的t细胞活化，从而导致免疫介导的远隔效应。
[0190]
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[0196]
在说明书、权利要求书和/或附图中公开的本发明的特征，无论是单独的还是其任何组合，都可以是用于以各种形式实现本发明的材料。

技术特征：
1.一种重组溶瘤病毒，包含水疱性口炎病毒(vsv)，其中vsv的糖蛋白(g蛋白)缺失，并且包含新城疫病毒(ndv)的修饰融合蛋白(f蛋白)，以及ndv的血凝素神经氨酸酶(hn)蛋白，进一步包含可溶性pd-1(spd-1)。2.根据权利要求1所述的重组溶瘤病毒，其中所述重组病毒进一步包含fc结构域或其片段，优选人igg1、igg2、igg3和/或igg4的fc结构域或其片段。3.根据权利要求1或2所述的重组溶瘤病毒，其中所述fc结构域或其片段与所述spd-1融合。4.根据前述权利要求中任意一项所述的重组溶瘤病毒，其中所述spd-1是高亲和力spd-1(ha-spd-1)，优选地对其配体pd-l1和pd-l2具有的亲和力比野生型spd-1对所述配体的亲和力高至少2倍，例如分别高45倍和30倍，和/或对pd-l1具有k
d
<3.2μm的亲和力和/或对pd-l2具有k
d
<0.1μm的亲和力。5.根据前述权利要求中任意一项所述的重组溶瘤病毒，其中所述spd-1在选自seq id no.2的132和41的位置处包含突变，优选选自a132l、l41i和l41v的突变。6.根据前述权利要求中任意一项所述的重组溶瘤病毒，其中所述spd-1是具有seq id no.3序列的ha-spd-1-a132l。7.根据前述权利要求中任意一项所述的重组溶瘤病毒，其中ndv的修饰融合蛋白(f蛋白)是具有seq id no.25序列的f3aa-修饰的f蛋白，和/或在蛋白酶切割位点中包含至少一个氨基酸取代，优选在seq id no.25的l289位，更优选l289a；和/或其中ndv的修饰融合蛋白(f蛋白)是具有seq id no.4且具有一个氨基酸取代l289a的f3aa-修饰的f蛋白；和/或其中vsv的g蛋白被具有seq id no.4序列的修饰的融合蛋白和具有seq id no.5序列的ndv的hn蛋白替代。8.一种编码前述权利要求中任意一项所述的重组溶瘤病毒的核酸。9.根据权利要求8所述的核酸，其包含编码fc结构域或其片段的核酸，优选具有seq id no.7的序列，其与编码所述spd-1的核酸融合，优选具有seq id no.6的序列，其中，优选地，其融合产物具有seq id no.8的核酸序列。10.一种包含权利要求8或9所述的核酸的载体，优选具有seq id no.9的序列，任选地进一步包含以下中的任意一种：-报告基因，如hsv1-sr39tk、钠碘转运体(nis)、生长抑素受体2(sstr2)、萤光素酶(萤火虫或海肾)、绿色荧光蛋白(gfp)、lacz和酪氨酸酶中的任意一种；-待递送至肿瘤细胞和/或肿瘤组织的基因，例如以下中的任意一种：免疫刺激基因，例如ifn-α、ifn-β或粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)、il-12或il-15；免疫检查点抑制性抗体，例如pd-1、pd-l1、ctla-4、lag-3或b7-h3；和/或
用于疫苗接种的肿瘤相关抗原(taa)(对靶向肿瘤是特异性的)；-或其组合。11.根据权利要求8-9中任意一项所述的核酸或根据权利要求10所述的载体，其包含或由seq id no.9或15的核苷酸序列组成，或者包含或由与seq id no.9或15的核苷酸序列具有至少60％、优选至少70％或80％、更优选至少90％或95％序列同一性的核苷酸序列组成，或者包含或由seq id no.16的核苷酸序列组成，或者包含或由与seq id no.16的核苷酸序列具有至少60％、优选至少70％或80％、更优选至少90％或95％序列同一性的核苷酸序列组成。12.一种药物组合物，其包含(i)权利要求1-7中任意一项所述的重组溶瘤病毒，权利要求8-9和11中任意一项所述的核酸或权利要求10-11中任意一项所述的的载体；和(ii)任选地，药学上可接受的载体和/或赋形剂，(iii)任选地，另一种药物，例如化学治疗剂，放射治疗剂，肿瘤疫苗，免疫检查点抑制剂，例如抗-ctla4，过继细胞治疗系统，例如t细胞或树突状细胞，细胞载体系统，小分子抑制剂，栓塞剂，屏蔽聚合物。13.根据权利要求12所述的药物组合物，其被配制用于全身递送、肿瘤注射、静脉内施用和动脉内施用中的任意一种，和/或用于皮内、皮下、肌内、静脉内、骨内、腹腔内、鞘内、硬膜外、心内、关节内、海绵体内、脑内、脑室内或玻璃体内注射。14.用作药物的权利要求1-7中任意一项所述的重组溶瘤病毒、权利要求8-9和11中任意一项所述的的核酸、权利要求10-11中任意一项所述的载体、或权利要求12-13中任意一项所述的药物组合物。15.用于预防和/或治疗癌症的权利要求1-7中任意一项所述的重组溶瘤病毒、权利要求8-9和11中任意一项所述的的核酸、权利要求10-11中任意一项所述的载体、或权利要求12-13中任意一项所述的药物组合物，例如预防和/或治疗选自肝细胞癌、胰腺癌和黑色素瘤的癌症。16.权利要求1-7中任意一项所述的重组溶瘤病毒、权利要求8-9和11中任意一项所述的的核酸、权利要求10-11中任意一项所述的载体、或权利要求12-13中任意一项所述的药物组合物作为基因递送工具、(无创)病毒生物分布的成像和/或用于肿瘤检测的用途。

技术总结
本发明涉及一种重组溶瘤病毒。本发明进一步涉及一种编码重组溶瘤病毒的核酸。本发明还涉及包含编码重组溶瘤病毒的核酸的载体。此外，本发明涉及一种包含重组溶瘤病毒的药物组合物。本发明进一步涉及一种用作药物的病毒、核酸、载体和药物组合物，例如用于预防和/或治疗癌症。此外，本发明涉及病毒、核酸、载体和药物组合物作为基因递送工具、(无创)病毒生物分布的成像和/或用于肿瘤检测的用途。布的成像和/或用于肿瘤检测的用途。


技术研发人员：J
受保护的技术使用者：慕尼黑工业大学附属伊萨右岸医院
技术研发日：2021.10.29
技术公布日：2023/8/13