靶向颗粒蛋白前体的反义寡核苷酸的制作方法

1.本发明涉及改变颗粒蛋白前体的剪接模式的反义寡核苷酸，以及它们在治疗神经系统疾患中的用途。此类反义寡核苷酸可以上调或恢复细胞中外显子1-外显子2颗粒蛋白前体剪接变体的表达。


背景技术：

2.颗粒蛋白前体(pgrn)是一种高度保守的分泌蛋白，在多种细胞类型中表达，在cns和外周组织中均存在。
3.中枢神经系统中分泌蛋白颗粒蛋白前体的缺乏导致神经退行性疾病额颞叶痴呆(ftd)。致病性颗粒蛋白前体突变通过单倍剂量不足导致颗粒蛋白前体水平损失约50％，并且导致tdp-43蛋白在神经元内聚集。颗粒蛋白前体在大脑内的许多过程中以细胞自主性方式和非自主性方式两者发挥支持和保护作用，这些过程包括神经突起生长、突触生物学、对外源性应激源的应答、溶酶体功能、神经炎症和血管生成。
4.颗粒蛋白前体直接和通过转化为颗粒体蛋白来调节溶酶体功能、细胞生长、存活、修复和炎症。颗粒蛋白前体在调节cns中与溶酶体功能相关联的小胶质细胞应答中起主要作用。导致蛋白质单倍剂量不足的颗粒蛋白前体基因的常染色体显性突变与家族性额颞叶痴呆相关，伴神经病理性额颞叶变性(ftld)，与43kda(tdp-43)内含物(ftld-tdp)的tar-dna结合蛋白的积累相关。纯合子grn突变与神经元蜡样质脂褐质沉积症(ncl)相关(townley，等人，neurology，2018年6月12日；90(24)：1127)。
5.最近，颗粒蛋白前体基因中的突变已确定为所有ftd(包括一些散发性病例)的约5％的原因。最近使用小鼠模型进行的研究已经阐明了颗粒蛋白前体在大脑中的表达(petkau等人，2010)。颗粒蛋白前体在神经发育晚期表达，用成熟神经元的标志物进行定位。颗粒蛋白前体在大部分大脑区域中的神经元中表达，在丘脑、海马体和大脑皮层中的表达水平最高。小胶质细胞也表达颗粒蛋白前体，并且表达水平被小胶质细胞活化上调。在ftd中已经确定出大约70种不同的颗粒蛋白前体基因突变，并且所有突变均降低颗粒蛋白前体水平或导致颗粒蛋白前体功能丧失。
6.因此，迫切需要能够增加颗粒蛋白前体的表达和/或活性的治疗剂。


技术实现要素：

7.保留内含子1的5
′
部分的颗粒蛋白前体的剪接变体在大脑中，诸如在神经元或小胶质细胞中表达(capell等人the journal of biological chemistry，2014，289(37)，25879-25889)。该剪接变体包括内含子1的5
′
末端271个核苷酸，其总共3823个核苷酸。内含子1的271个核苷酸片段包括外显子2中经典下游aug(开放阅读框)上游的两个aug位点。来自这两个上游aug位点的翻译不会编码颗粒蛋白前体蛋白，并且由于提前终止密码子，转录本可能会经历无义介导的mrna衰变(nmd)。
8.wo2020/191212描述了可以靶向颗粒蛋白前体mrna的特异性寡核苷酸。在此，发明
人已确定减少保留内含子1的5
′
部分的剪接变体会增加外显子1和外显子2剪接变体，并且进一步增加颗粒蛋白前体蛋白表达。
9.本发明提供颗粒蛋白前体的反义寡核苷酸。这些反义寡核苷酸能够改变颗粒蛋白前体的剪接模式，特别是反义寡核苷酸可以上调外显子1-外显子2颗粒蛋白前体剪接变体的表达，减少保留内含子1的5
′
部分的颗粒蛋白前体内含子1-外显子2剪接变体的产生、增加颗粒蛋白前体蛋白的表达。这些反义寡核苷酸可被描述为颗粒蛋白前体剪接的调节剂，或颗粒蛋白前体外显子1-外显子2的激动剂。
10.本发明的反义寡核苷酸可用于恢复或增强细胞中颗粒蛋白前体外显子1-外显子2剪接变体的表达。
11.本发明提供了一种反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸的长度为8个至40个核苷酸并且包含长度为8个至40个核苷酸的连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列与人颗粒蛋白前体mrna前体的剪接调节位点互补，诸如完全互补。
12.本发明提供了一种反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸的长度为8个至40个核苷酸并且包含长度为8个至40个核苷酸的连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列与人颗粒蛋白前体mrna前体的外显子1、内含子1和外显子2序列的剪接调节位点互补，诸如完全互补。
13.本发明提供了一种反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸的长度为8个至40个核苷酸并且包含一个长度为8个至40个核苷酸的连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列与人颗粒蛋白前体mrna前体转录本互补，诸如完全互补，该人颗粒蛋白前体mrna前体转录本包含人颗粒蛋白前体mrna前体转录本的外显子1、内含子1和外显子2序列(seq id no 276)。
14.颗粒蛋白前体外显子1、内含子1和外显子2序列如下所示为seq id no：276。颗粒蛋白前体外显子1序列(以大写字母表示)对应于基因组ensemble(www.ensemble.org)染色体17位置44,345,123；至位置44,345,334。内含子1对应于基因组ensemble染色体17位置44,345,335至44,349,157，并且外显子2序列(以大写字母表示)对应于基因组ensemble染色体17位置44,349,158至位置44,349,302。
15.人颗粒蛋白前体mrna前体的外显子1、内含子1和外显子2序列(seq id no：276)：
16.17.[0018][0019]
本发明提供一种反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸的长度为8个至40个核苷酸并且包含长度为至少12个核苷酸的连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列与人颗粒蛋白前体mrna前体的剪接调节位点互补，诸如完全互补。
[0020]
本发明提供一种反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸的长度为8个至40个核苷酸并且包含长度为12个至16个核苷酸的连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列与人颗粒蛋白前体mrna前体的剪接调节位点互补，诸如完全互补。
[0021]
本发明提供一种反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸的长度为12个至16个核苷酸并且包含长度为12个至16个核苷酸的连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列与人颗粒蛋白前体mrna前体的剪接调节位点互补，诸如完全互补。
[0022]
本发明提供一种反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸的长度为8个至40个核苷酸并且包含长度为12个至18个核苷酸的连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列与人颗粒蛋白前体mrna前体的剪接调节位点互补，诸如完全互补。
[0023]
本发明提供一种反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸的长度为12个至18个核苷酸并且包含长度为12个至18个核苷酸的连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列与人颗粒蛋白前体mrna前体的剪接调节位点互补，诸如完全互补。
[0024]
本发明提供了一种反义寡核苷酸，其中该反义寡核苷酸的长度为8个至40个核苷酸并且包含长度为12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸的连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列与人颗粒蛋白前体mrna前体的剪接调节位点互补，诸如完全互补。
[0025]
本发明提供了一种反义寡核苷酸，其中该反义寡核苷酸的长度为8个至40个核苷酸并且包含长度为8个至40个核苷酸的连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列与seq id no：276内包含的核苷酸序列互补，诸如完全互补。
[0026]
本发明提供了一种反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸的长度为8个至40个核苷酸并且包含长度为8个至40个核苷酸的连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列与seq id no：276的核苷酸441至468内包含的核苷酸序列互补，诸如完全互补。
[0027]
本发明提供了一种反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸的长度为8个至40个核苷酸
并且包含长度为8个至40个核苷酸的连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列与seq id no：276的核苷酸441至462内包含的核苷酸序列互补，诸如完全互补。
[0028]
本发明提供了一种反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸的长度为8个至40个核苷酸并且包含长度为8个至40个核苷酸的连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列与选自由以下项组成的组的序列互补，诸如完全互补：seq id no 277、seq id no 278、seq id no 279和seq id no 280。
[0029]
seq id no：71(seq id no 277)的靶位点
[0030]
attcttgacccagctc
[0031]
seq id no：73(seq id no 278)的靶位点
[0032]
cacaccattcttgacc
[0033]
seq id no：74(seq id no 279)的靶位点
[0034]
gaccacaccattcttg
[0035]
seq id no：75(seq id no 280)的靶位点
[0036]
agggaccacaccattc
[0037]
本发明提供了一种反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸的长度为8个至40个核苷酸并且包含长度为8个至40个核苷酸的连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列与seq id no：276的核苷酸268至283内包含的核苷酸序列互补，诸如完全互补。
[0038]
本发明提供了一种反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸的长度为8个至40个核苷酸并且包含长度为8个至40个核苷酸的连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列与seq id no 281互补，诸如完全互补。
[0039]
seq id no：134(seq id no：281)的靶位点
[0040]
gccatgtgagcttgag
[0041]
本发明提供了一种反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸的长度为8个至40个核苷酸并且包含长度为8个至40个核苷酸的连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列与选自由以下项组成的组的序列互补，诸如完全互补：seq id no：291和seq id no：292。
[0042]
该反义寡核苷酸的长度可以为8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个或40个核苷酸。在一些实施例中，反义寡核苷酸的长度为8个至40个、12个至40个、12个至20个、10个至20个、14个至18个、12个至18个或16个至18个核苷酸。
[0043]
连续核苷酸序列的长度可以为8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个或40个核苷酸。在一些实施例中，连续核苷酸序列具有的长度为至少12个核苷酸，诸如长度为12个至16个核苷酸或12个至18个核苷酸的长度。
[0044]
在一些实施例中，连续核苷酸序列的长度与反义寡核苷酸的长度相同。
[0045]
在一些实施例中，反义寡核苷酸由连续核苷酸序列组成。
[0046]
在一些实施例中，反义寡核苷酸为连续核苷酸序列。
[0047]
在一些实施例中，连续核苷酸序列与seq id no：276内包含的核苷酸序列完全互
补。
[0048]
在一些实施例中，连续核苷酸序列与seq id no：276的第441至468个核苷酸内包含的核苷酸序列完全互补。
[0049]
在一些实施例中，连续核苷酸序列与seq id no：276的第441至462个核苷酸内包含的核苷酸序列完全互补。
[0050]
在一些实施例中，连续核苷酸序列与选自由以下项组成的组的序列互补：seq id no 277、seq id no 278、seq id no 279和seq id no 280。
[0051]
在一些实施例中，连续核苷酸序列与seq id no：277完全互补。
[0052]
在一些实施例中，连续核苷酸序列与seq id no：278完全互补。
[0053]
在一些实施例中，连续核苷酸序列与seq id no：279完全互补。
[0054]
在一些实施例中，连续核苷酸序列与seq id no：280完全互补。
[0055]
在一些实施例中，连续核苷酸序列与seq id no：276的第256至283个核苷酸内包含的核苷酸序列完全互补。
[0056]
在一些实施例中，连续核苷酸序列与seq id no：281完全互补。
[0057]
在一些实施例中，连续核苷酸序列为选自由以下项组成的组的序列：seq id no 51、seq id no 52、seq id no 53、seq id no 54、seq id no 55、seq id no 62、seq id no 63、seq id no 67、seq id no 71、seq id no 73、seq id no 74、seq id no 75、seq id no 100、seq id no 134、seq id no 135、seq id no 196、seq id no 220、seq id no 228和seq id no 252，或其至少8个连续核苷酸。
[0058]
在一些实施例中，连续核苷酸序列为选自由以下项组成的组的序列：seq id no 51、seq id no 52、seq id no 53、seq id no 54、seq id no 55、seq id no 62、seq id no 63、seq id no 67、seq id no 71、seq id no 73、seq id no 74、seq id no 75、seq id no 100、seq id no 134、seq id no 135、seq id no 196、seq id no 220、seq id no 228和seq id no 252，或其至少9个连续核苷酸。
[0059]
在一些实施例中，连续核苷酸序列为选自由以下项组成的组的序列：seq id no 51、seq id no 52、seq id no 53、seq id no 54、seq id no 55、seq id no 62、seq id no 63、seq id no 67、seq id no 71、seq id no 73、seq id no 74、seq id no 75、seq id no 100、seq id no 134、seq id no 135、seq id no 196、seq id no 220、seq id no 228和seq id no 252，或其至少10个连续核苷酸。
[0060]
在一些实施例中，连续核苷酸序列为选自由以下项组成的组的序列：seq id no 51、seq id no 52、seq id no 53、seq id no 54、seq id no 55、seq id no 62、seq id no 63、seq id no 67、seq id no 71、seq id no 73、seq id no 74、seq id no 75、seq id no 100、seq id no 134、seq id no 135、seq id no 196、seq id no 220、seq id no 228和seq id no 252，或其至少11个连续核苷酸。
[0061]
在一些实施例中，连续核苷酸序列为选自由以下项组成的组的序列：seq id no 51、seq id no 52、seq id no 53、seq id no 54、seq id no 55、seq id no 62、seq id no 63、seq id no 67、seq id no 71、seq id no 73、seq id no 74、seq id no 75、seq id no 100、seq id no 134、seq id no 135、seq id no 196、seq id no 220、seq id no 228和seq id no 252，或其至少12个连续核苷酸。
[0062]
在一些实施例中，连续核苷酸序列为选自由以下项组成的组的序列：seq id no 51、seq id no 52、seq id no 53、seq id no 54、seq id no 55、seq id no 62、seq id no 63、seq id no 67、seq id no 71、seq id no 73、seq id no 74、seq id no 75、seq id no 100、seq id no 134、seq id no 135、seq id no 196、seq id no 220、seq id no 228和seq id no 252，或其至少13个连续核苷酸。
[0063]
在一些实施例中，连续核苷酸序列为选自由以下项组成的组的序列：seq id no 51、seq id no 52、seq id no 53、seq id no 54、seq id no 55、seq id no 62、seq id no 63、seq id no 67、seq id no 71、seq id no 73、seq id no 74、seq id no 75、seq id no 100、seq id no 134、seq id no 135、seq id no 196、seq id no 220、seq id no 228和seq id no 252，或其至少14个连续核苷酸。
[0064]
在一些实施例中，连续核苷酸序列为选自由以下项组成的组的序列：seq id no 51、seq id no 52、seq id no 53、seq id no 54、seq id no 55、seq id no 62、seq id no 63、seq id no 67、seq id no 71、seq id no 73、seq id no 74、seq id no 75、seq id no 100、seq id no 134、seq id no 135、seq id no 196、seq id no 220、seq id no 228和seq id no 252，或其至少15个连续核苷酸。
[0065]
在一些实施例中，连续核苷酸序列选自由以下项组成的组：seq id no 51、seq id no 52、seq id no 53、seq id no 54、seq id no 55、seq id no 62、seq id no 63、seq id no 67、seq id no 71、seq id no 73、seq id no 74、seq id no 75、seq id no 100、seq id no 134、seq id no 135、seq id no 196、seq id no 220、seq id no 228和seq id no 252。
[0066]
在一些实施例中，连续核苷酸序列为seq id no 71。
[0067]
在一些实施例中，连续核苷酸序列为seq id no 73。
[0068]
在一些实施例中，连续核苷酸序列为seq id no 74。
[0069]
在一些实施例中，连续核苷酸序列为seq id no 75。
[0070]
在一些实施例中，连续核苷酸序列为seq id no 134。
[0071]
本发明提供了一种反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸的长度为8个至40个核苷酸并且包含长度为8个至40个核苷酸的连续核苷酸序列，其中该连续核苷酸序列选自由以下项组成的组：seq id no：289和seq id no：290。
[0072]
本发明提供了一种被分离、纯化或制造的反义寡核苷酸。
[0073]
在一些实施例中，反义寡核苷酸为反义寡核苷酸混聚物或全聚物或包含反义寡核苷酸混聚物或全聚物。在一些实施例中，连续核苷酸序列为混聚物或全聚物。
[0074]
本发明提供了包含根据本发明的反义寡核苷酸以及与所述反义寡核苷酸共价连接的至少一个缀合物部分的缀合物。
[0075]
本发明提供了共价连接至至少一个缀合物部分的反义寡核苷酸。
[0076]
本发明提供了根据本发明的反义寡核苷酸或根据本发明的缀合物的药用盐。
[0077]
本发明提供了根据本发明的反义寡核苷酸，其中该反义寡核苷酸呈药用盐的形式。在一些实施例中，药用盐为钠盐、钾盐或铵盐。
[0078]
本发明提供了根据本发明的反义寡核苷酸或根据本发明的缀合物的药用钠盐。
[0079]
本发明提供了根据本发明的反义寡核苷酸或根据本发明的缀合物的药用钾盐。
[0080]
本发明提供了根据本发明的反义寡核苷酸或根据本发明的缀合物的药用铵盐。
[0081]
本发明提供了药物组合物，其包含：本发明的反义寡核苷酸，或本发明的缀合物，以及药用的稀释剂、溶剂、载体、盐和/或佐剂。
[0082]
本发明提供药物组合物，其包含：本发明的反义寡核苷酸，或本发明的缀合物，以及药用盐。例如，该盐可以包含金属阳离子，诸如钠盐、钾盐或铵盐。
[0083]
本发明提供了根据本发明的药物组合物，其中该药物组合物包含：本发明的反义寡核苷酸或本发明的缀合物，或本发明的药用盐，以及水性稀释剂或溶剂。
[0084]
本发明提供了本发明的反义寡核苷酸或本发明的缀合物、或本发明的药用盐的溶液，诸如磷酸盐缓冲生理盐水。适当地，本发明的溶液诸如磷酸盐缓冲盐水溶液为无菌溶液。
[0085]
本发明提供了一种用于增强表达颗粒蛋白前体的细胞中外显子1-外显子2颗粒蛋白前体剪接变体的表达的方法，该方法包括向该细胞施用有效量的本发明的反义寡核苷酸或本发明的缀合物、或本发明的盐、或本发明的药物组合物。在一些实施例中，该方法为体外方法。在一些实施例中，该方法为体内方法。
[0086]
在一些实施例中，该细胞为人细胞或哺乳动物细胞。
[0087]
本发明提供了用于治疗或预防颗粒蛋白前体单倍剂量不足或相关疾患的方法，其包括向患有或易患颗粒蛋白前体单倍剂量不足或相关疾患的受试者施用治疗或预防有效量的本发明的反义寡核苷酸、或本发明的缀合物、或本发明的盐、或本发明的药物组合物。
[0088]
本发明提供用于治疗或预防神经系统疾病的方法，其包括向患有或易患神经系统疾病的受试者施用治疗或预防有效量的本发明的反义寡核苷酸、或本发明的缀合物、或本发明的盐、或本发明的药物组合物。在一个实施例中，神经系统疾病可以为tdp-43病理状况。
[0089]
本发明提供了本发明的反义寡核苷酸，其用作药物。
[0090]
本发明提供了本发明的反义寡核苷酸，其用于疗法中。
[0091]
本发明提供了本发明的反义寡核苷酸、或本发明的缀合物、或本发明的盐、或本发明的药物组合物，其用作药物。
[0092]
本发明提供了本发明的反义寡核苷酸、或本发明的缀合物、或本发明的盐、或本发明的药物组合物，其用于疗法中。
[0093]
本发明提供了本发明的反义寡核苷酸、或本发明的缀合物、或本发明的盐、或本发明的药物组合物，其用于治疗神经系统疾病。在一个实施例中，神经系统疾病可以为tdp-43病理状况。
[0094]
本发明提供了本发明的反义寡核苷酸、或本发明的缀合物、或本发明的盐、或本发明的药物组合物，其用于治疗或预防颗粒蛋白前体单倍剂量不足或相关疾患。
[0095]
本发明提供了本发明的反义寡核苷酸、或本发明的缀合物、或本发明的盐、或本发明的药物组合物用于制备药物的用途，该药物用于治疗或预防神经系统疾病。在一个实施例中，神经系统疾病可以为tdp-43病理状况。
[0096]
本发明提供本发明的反义寡核苷酸、或本发明的缀合物、或本发明的盐、或本发明的药物组合物用于制备药物的用途，该药物用于治疗或预防颗粒蛋白前体单倍剂量不足或相关疾患。
[0097]
在一些实施例中，本发明的方法、用途或供使用的反义寡核苷酸用于治疗额颞叶痴呆(ftd)、神经病理性额颞叶变性或神经发炎。在其他实施例中，本发明的方法、用途或供使用的反义寡核苷酸用于治疗肌萎缩侧索硬化症(als)、阿尔茨海默病、帕金森病、自闭症、海马硬化性痴呆、唐氏综合征、亨廷顿病、多聚谷氨酰胺疾病、脊髓小脑共济失调3型、肌病或慢性创伤性脑病。
[0098]
在一个方面中，本发明包括寡核苷酸颗粒蛋白前体激动剂，其具有与seq id no 71对应的结构：
[0099][0100]
在另一个方面中，本发明包括寡核苷酸颗粒蛋白前体激动剂，其具有与seq id no 73对应的结构：
[0101][0102]
在另一个方面中，本发明包括寡核苷酸颗粒蛋白前体激动剂，其具有与seq id no 74对应的结构：
[0103][0104]
在另一个方面中，本发明包括寡核苷酸颗粒蛋白前体激动剂，其具有与seq id no 75对应的结构：
[0105][0106]
在另一个方面中，本发明包括寡核苷酸颗粒蛋白前体激动剂，其具有与seq id no 134对应的结构：
[0107][0108]
在另一个方面中，本发明包括一种反义寡核苷酸，其中该寡核苷酸为寡核苷酸化合物gagctgggtcaagaat(seq id no：71)，其中大写字母代表β-d-氧基lna核苷，小写字母代表dna核苷，所有lna c均为5-甲基胞嘧啶，并且所有核苷间键合均为硫代磷酸酯核苷间键合。
[0109]
在另一个方面中，本发明包括一种反义寡核苷酸，其中该寡核苷酸为寡核苷酸化合物ggtcaagaatggtgtg(seq id no：73)，其中大写字母代表β-d-氧基lna核苷，小写字母代表dna核苷，所有lna c均为5-甲基胞嘧啶，并且所有核苷间键合均为硫代磷酸酯核苷间键合。
[0110]
在另一个方面中，本发明包括一种反义寡核苷酸，其中该寡核苷酸为寡核苷酸化合物cagaatggtgtggtc(seq id no 74)，其中大写字母代表β-d-氧基lna核苷，小写字母代表dna核苷，所有lna c均为5-甲基胞嘧啶，并且所有核苷间键合均为硫代磷酸酯核苷间键合。
[0111]
在另一个方面中，本发明包括一种反义寡核苷酸，其中该寡核苷酸为寡核苷酸化合物gaatggtgtggtccc(seq id no 75)，其中大写字母代表β-d-氧基lna核苷，小写字母代表dna核苷，所有lna c均为5-甲基胞嘧啶，并且所有核苷间键合均为硫代磷酸酯核苷间键合。
[0112]
在另一个方面中，本发明包括一种反义寡核苷酸，其中该寡核苷酸为寡核苷酸化合物ctcaagctcacatggc(seq id no 134)，其中大写字母代表β-d-氧基lna核苷，小写字母代表dna核苷，所有lna c均为5-甲基胞嘧啶，并且所有核苷间键合均为硫代磷酸酯核苷间键合。
附图说明
[0113]
图1显示了颗粒蛋白前体的外显子1-外显子2mrna剪接形式相对于hprt1和内含子1-外显子2相对于hprt1的表达水平。seq id no：1-49显示在图1a中。seq id no：50-109显示在图1b中。seq id no：110-169显示在图1c中。seq id no：170-229显示在图1d中。seq id no：230-275显示在图1e中。
[0114]
图2显示了用寡核苷酸处理5天后颗粒蛋白前体表达水平。
[0115]
图3显示了与来自wo 2020/191212的寡核苷酸s7和s10相比，用寡核苷酸处理5天后颗粒蛋白前体表达水平。
[0116]
图4显示了seq id no：73、seq id no：74、seq id no：75和seq id no：134的序列定位。
[0117]
图5显示了用寡核苷酸处理4天后颗粒蛋白前体表达水平。
[0118]
图6显示了与来自wo 2020/191212的寡核苷酸s7、s10和s37相比，用寡核苷酸处理4天后颗粒蛋白前体表达水平。
[0119]
图7显示了ddpcr数据，量化了h4细胞相对于模拟转染细胞转染后48小时grn mrna中5个utr剪接变体的丰度。灰色条量化了保留内含子1(int1-ex2)的剪接变体的丰度，并且黑色条量化了具有ex1-ex2(ex1-ex2)剪接的剪接变体。seq id#73(图7a)、seq id#74(图7b)和seq id#75(图7c)显示内含子1保留(int1-ex2)的剂量依赖性跳跃和ex1-ex2剪接变体的增加。来自wo 2020/191212(图7d)的s10化合物显示对内含子1保留的跳跃没有/有限的影响。
[0120]
图8显示了ddpcr数据，量化了h4细胞相对于模拟转染细胞转染后48小时grn mrna中5个utr剪接变体的丰度。灰色条量化了保留内含子1(int1-ex2)的剪接变体的丰度，并且黑色条量化了具有ex1-ex2(ex1-ex2)剪接的剪接变体。seq id#289(图8a)和seq id#290(图8b)显示内含子1保留(int1-ex2)的剂量依赖性跳跃和ex1-ex2剪接变体的增加。来自wo 2020/191212的s10化合物显示对内含子1保留的跳跃没有/有限的影响(图8c)。
[0121]
图9显示了ddpcr数据，该数据量化了小胶质细胞相对于pbs转染细胞在5天的剥裸后grn mrna中5个utr剪接变体的丰度。灰色条量化了保留内含子1(内含子1保留)的剪接变体的丰度，并且黑色条量化了具有外显子1-外显子2(外显子1-外显子2)剪接的剪接变体。seq id#290显示内含子1保留的剂量依赖性跳跃和外显子1-外显子2的剪接变体的增加。来自wo 2020/191212的s10化合物显示对内含子1保留的跳跃没有/有限影响。间隔聚体对照显示两种剪接变体的预期剂量依赖性敲低。
[0122]
图10显示了根据wo 2020/191912对应于化合物id#290发生，以及化合物s10不发生的剪接开关的生鱼片图。
[0123]
定义
[0124]
寡核苷酸
[0125]
如本文所用，术语“寡核苷酸”如本领域技术人员通常理解的那样被定义为包含两个或更多个共价连接的核苷的分子。此类共价结合的核苷也可被称为核酸分子或寡聚物。
[0126]
寡核苷酸通常是在实验室中制作，先经固相化学合成后再加以纯化和分离。当提及寡核苷酸的序列时，提及的是共价联接的核苷酸或核苷的核碱基部分或其修饰的序列或顺序。本发明的寡核苷酸是人造的，并且是化学合成的，并且通常是纯化或分离的。本发明的寡核苷酸可包含一个或多个经修饰的核苷，诸如2
′
糖修饰的核苷。本发明的寡核苷酸可包含一个或多个经修饰的核苷间键合，诸如一个或多个硫代磷酸酯核苷间键合。
[0127]
反义寡核苷酸
[0128]
如本文所用的术语“反义寡核苷酸”定义为能够通过与靶核酸特别是与靶核酸上的连续序列杂交来调节靶基因表达的寡核苷酸。反义寡核苷酸基本上不是双链的，因此不是sirna或shrna。本发明的反义寡核苷酸可以为单链的。应当理解，只要序列内或序列间自身互补性的程度低于跨寡核苷酸全长的大约50％，本发明的单链寡核苷酸便可形成发夹或分子间双链体结构(同一寡核苷酸的两个分子之间的双链体)。
[0129]
在某些情况下，本发明的反义寡核苷酸可被称为寡核苷酸。
[0130]
在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸可以不含rna核苷。
[0131]
有利地，本发明的反义寡核苷酸包含一个或多个经修饰的核苷或核苷酸，诸如2
′
糖修饰的核苷。此外，在本发明的一些反义寡核苷酸中，可能有利的是未修饰的核苷为dna核苷。
[0132]
连续核苷酸序列
[0133]
术语“连续核苷酸序列”是指寡核苷酸的与靶核酸互补的区域，其可以为或可以包含寡核苷酸基序序列。在本文中，该术语与“连续核碱基序列”可互换使用。在一些实施例中，寡核苷酸的所有核苷构成连续核苷酸序列。连续核苷酸序列是本发明的寡核苷酸中核苷酸的序列，其与靶核酸或靶序列或靶位点序列互补，并且在一些情况下完全互补。
[0134]
在一些实施例中，靶序列为seq id no 276。
[0135]
seq id no 276是人颗粒蛋白前体mrna前体转录本的外显子1、内含子1和外显子2的序列。
[0136]
在一些实施例中，靶序列为或包含seq id no 276的核苷酸441至核苷酸468。
[0137]
在一些实施例中，靶序列为或包含seq id no 276的核苷酸441至核苷酸462。
[0138]
在一些实施例中，靶序列为或包含seq id no 277。
[0139]
在一些实施例中，靶序列为或包含seq id no 278。
[0140]
在一些实施例中，靶序列为或包含seq id no 279。
[0141]
在一些实施例中，靶序列为或包含seq id no 280。
[0142]
在一些实施例中，靶序列为或包含seq id no 276的核苷酸268至核苷酸283。
[0143]
在一些实施例中，靶序列为或包含seq id no 281。
[0144]
在一些实施例中，靶序列为或包含seq id no 291。
[0145]
在一些实施例中，靶序列为或包含seq id no 292。
[0146]
在一些实施例中，寡核苷酸包含连续核苷酸序列，并且可任选地包含其他一个或多个核苷酸，例如可用于将官能团(例如，缀合物基团)连接至连续核苷酸序列的核苷酸接头区域。核苷酸接头区域可与靶核酸互补或不互补。应理解的是，该寡核苷酸的连续核苷酸序列不能比寡核苷酸本身更长，并且该寡核苷酸不能比连续核苷酸序列更短。
[0147]
核苷酸和核苷
[0148]
核苷酸和核苷是寡核苷酸和多核苷酸的组成部分，并且出于本发明的目的，包括天然存在的和非天然存在的核苷酸和核苷。在自然界中，核苷酸，诸如dna和rna核苷酸包含核糖糖部分、核碱基部分和一个或多个磷酸酯基团(其不存在于核苷中)。核苷和核苷酸也可以可互换地称为“单元”或“单体”。
[0149]
经修饰的核苷酸
[0150]
有利地，本发明的反义寡核苷酸可包含一个或多个经修饰的核苷。
[0151]
如本文所用，术语“修饰的核苷”或“核苷修饰”是指与等同的dna或rna核苷相比，通过引入糖部分或(核)碱基部分的一种或多种修饰而被修饰的核苷。有利地，本发明的反义寡核苷酸的一种或多种修饰的核苷可包含经修饰的糖部分。术语修饰的核苷在本文中还可与术语“核苷类似物”或修饰的“单元”或修饰的“单体”互换使用。具有未修饰的dna或rna糖部分的核苷在本文中被称为dna或rna核苷。在dna或rna核苷的碱基区域中具有修饰的核苷如果允许沃森克里克(watson crick)碱基配对，则通常仍称为dna或rna。可以在本发明的反义寡核苷酸中使用的示例性经修饰的核苷包括lna、2
′‑
o-moe和吗啉代核苷类似物。
[0152]
经修饰的核苷间键合
[0153]
有利地，本发明的反义寡核苷酸包含一个或多个经修饰的核苷间键合。
[0154]
如技术人员通常所理解的，术语“经修饰的核苷间键合”定义为除磷酸二酯(po)键合以外的键合，其将两个核苷共价偶联在一起。本发明的寡核苷酸可因此包含一个或多个经修饰的核苷间键合，诸如一个或多个硫代磷酸酯核苷间键合。
[0155]
在一些实施例中，反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列中至少50％的核苷间键合是硫代磷酸酯，反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列中的诸如至少60％、诸如至少70％、诸如至少75％、诸如至少80％、诸如至少90％或更多的核苷间键合是硫代磷酸酯。在一些实施例中，反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列中的全部核苷间键合均为硫代磷酸酯。
[0156]
有利地，反义寡核苷酸的连续核苷酸序列中的全部核苷间键合可以为硫代磷酸酯，或反义寡核苷酸全部核苷间键合可以为硫代磷酸酯键合。
[0157]
核碱基
[0158]
术语核碱基包括存在于核苷和核苷酸中的嘌呤(例如腺嘌呤和鸟嘌呤)和嘧啶(例如尿嘧啶、胸腺嘧啶和胞嘧啶)部分，其在核酸杂交中形成氢键。在本发明的上下文中，术语“核碱基”还包括经修饰的核碱基，其可以不同于天然存在的核碱基，但在核酸杂交过程中为功能性的。在此上下文中，“核碱基”是指天然存在的核碱基，诸如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸苷、尿嘧啶、黄嘌呤和次黄嘌呤，以及非天然存在的变体。此类变体例如描述于hirao等人(2012)accounts of chemical research第45卷第2055页和bergstrom(2009)current protocols in nucleic acid chemistry增刊371.4.1。
[0159]
在一些实施例中，通过以下方式修饰核碱基部分：将嘌呤或嘧啶改变为修饰的嘌
呤或嘧啶，诸如取代的嘌呤或取代的嘧啶，诸如选自异胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-噻唑-胞嘧啶、5-丙炔基-胞嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-噻唑-尿嘧啶、2-硫代-尿嘧啶、2
′‑
硫代-胸腺嘧啶、肌苷、二氨基嘌呤、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、2，6-二氨基嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤的核碱基。
[0160]
核碱基部分可由每个相应核碱基的字母代码来表示，例如a、t、g、c或u，其中每个字母可任选地包括具有同等功能的修饰的核碱基。例如，在示例性的寡核苷酸中，核碱基部分选自a、t、g、c和5-甲基胞嘧啶。任选地，对于lna间隔聚体，可使用5-甲基胞嘧啶lna核苷。
[0161]
经修饰的的寡核苷酸
[0162]
本发明的反义寡核苷酸可为经修饰的寡核苷酸。
[0163]
术语经修饰的寡核苷酸描述了一种寡核苷酸，其包含一个或多个糖修饰的核苷和/或修饰的核苷间键合。术语“嵌合寡核苷酸”是已经在文献中用于描述包含糖修饰的核苷和dna核苷的寡核苷酸的术语。在一些实施例中，可能有利的是，本发明的反义寡核苷酸为嵌合寡核苷酸。
[0164]
互补性
[0165]
术语“互补性”描述了核苷/核苷酸的watson-crick碱基配对的能力。沃森克里克碱基对为鸟嘌呤(g)-胞嘧啶(c)和腺嘌呤(a)-胸腺嘧啶(t)/尿嘧啶(u)。
[0166]
应当理解，寡核苷酸可包含具有经修饰的核碱基的核苷，例如经常使用5-甲基胞嘧啶代替胞嘧啶，并且因此，术语互补性包括未经修饰的核碱基与修饰的核碱基之间的沃森克里克(watson crick)碱基配对(参见例如hirao等人(2012)accounts of chemical research第45卷第2055页和bergstrom(2009)current protocols in nucleic acid chemistry增刊371.4.1)。
[0167]
如本文所用，术语“互补性百分比”是指核酸分子(例如寡核苷酸)中连续核苷酸序列的与参考序列(例如靶序列或序列基序)互补的核苷酸比例(以百分比表示)，该核酸分子跨连续核苷酸序列。因此，通过计数两个序列之间(当与靶序列5
′‑3′
和3
′‑5′
的寡核苷酸序列比对时)互补(形成watson crick碱基对)的对准的核碱基数，将其除以寡核苷酸中核苷酸的总数，然后乘以100，来计算互补性的百分比。在这种比较中，未对齐(形成碱基对)的核碱基/核苷酸被称为错配。在计算连续核苷酸序列的互补性百分比时，不允许插入和删除。应当理解的是，在确定互补性时，只要保留了形成watson crick碱基配对的核碱基的功能能力，就不考虑核碱基的化学修饰(例如，在计算互补性百分比时，认为5
′‑
甲基胞嘧啶与胞嘧啶相同)。
[0168]
在本发明中，术语“互补”要求反义寡核苷酸与人颗粒蛋白前体mrna前体转录本至少约80％互补，或至少约90％互补。在一些实施例中，反义寡核苷酸可以与人颗粒蛋白前体mrna前体转录本至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％互补。换句话讲，对于一些实施例，本发明的反义寡核苷酸可包括一个、二个、三个或更多个错配，其中错配为本发明的反义寡核苷酸内的不与其靶标碱基配对的核苷酸。
[0169]
术语“完全互补”是指100％互补性。
[0170]
本发明的反义寡核苷酸与人颗粒蛋白前体mrna前体互补。本发明的反义寡核苷酸
有利地与人颗粒蛋白前体mrna前体转录本的内含子1序列互补。人颗粒蛋白前体mrna前体转录本的外显子1、内含子1和外显子2的序列在本文中示例为seq id no 276。本文提供的seq id no 276为参考序列，并且应当理解，靶标颗粒蛋白前体核酸可以为seq id no 276的等位基因变体，诸如包含人颗粒蛋白前体核酸序列中的一个或多个多态性的等位基因变体。
[0171]
同一性
[0172]
如本文所用的术语“同一性”是指核酸分子(例如寡核苷酸)中连续核苷酸序列的与参考序列(例如序列基序)相同的核苷酸比例(以百分比表示)，该核酸分子跨连续核苷酸序列。
[0173]
因此，通过计数两个序列(在本发明的化合物的连续核苷酸序列中和在参考序列中)相同(匹配)的对准核碱基数，将该数除以寡核苷酸的核苷酸总数再乘以100，来计算同一性百分比。因此，同一性百分比＝(匹配数x 100)/比对区域的长度(例如，连续核苷酸序列)。在计算连续核苷酸序列的同一性百分比时，不允许插入和删除。应当理解的是，在确定同一性时，只要保留了形成watson crick碱基配对的核碱基的功能能力，就不考虑核碱基的化学修饰(例如，在计算同一性百分比时，认为5-甲基胞嘧啶与胞嘧啶相同)。
[0174]
杂交
[0175]
如本文所用的术语“杂交”(hybridizing/hybridizes)应当理解为两条核酸链(例如反义寡核苷酸和靶核酸)在相反链上的碱基对之间形成氢键，从而形成双链体。两条核酸链之间结合的亲和力为杂交的强度。它通常根据解链温度(tm)来描述，该解链温度被定义为一半寡核苷酸与靶核酸形成双链体的温度。在生理条件下，tm不与亲和力严格成正比(mergny和lacroix，2003，oligonucleotides 13：515-537)。标准状态的吉布斯自由能δg
°
更精确地表示结合亲和力，并且通过δg
°
＝-rtln(kd)与反应的解离常数(kd)相关，其中r为气体常数，t为绝对温度。因此，寡核苷酸与靶核酸之间的反应的非常低的δg
°
反映了寡核苷酸与靶核酸之间的强杂交。δg
°
是与水浓度为1m、ph为7、温度为37℃的反应相关的能量。寡核苷酸与靶核酸的杂交是自发反应，而自发反应的δg
°
小于零。δg
°
可经由实验来测量，例如，利用如hansen等人，1965，chem.comm.36-38和holdgate等人，2005，drug discov today中所描述的等温滴定量热法(itc)方法。技术人员将知道商用设备可用于δg
°
测量。δg
°
还可以进行数值估计，通过使用santalucia，1998，proc natl acad sci usa.95：1460-1465所描述的最近相邻模型，使用sugimoto等人，1995，biochemistry 34：11211-11216和mctigue等人，2004，biochemistry 43：5388-5405所描述的适当推导的热力学参数。
[0176]
在一些实施例中，对于长度为10个至30个核苷酸的寡核苷酸，本发明的反义寡核苷酸以低于-10kcal的δg
°
估值与靶核酸杂交。
[0177]
在一些实施例中，杂交的程度或强度通过标准状态吉布斯自由能δg测量。对于长度为8-30个核苷酸的寡核苷酸，寡核苷酸可与靶核酸以低于-10kcal，诸如低于-15kcal、诸如低于-20kcal和诸如低于-25kcal的δg
°
估值杂交。在一些实施例中，寡核苷酸以-10kcal至-60kcal诸如-12kcal至-40kcal诸如-15kcal至-30kcal或-16kcal至-27kcal诸如-18kcal至-25kcal的δg
°
估值与靶核酸杂交。
[0178]
高亲和力修饰的核苷
[0179]
高亲和力修饰的核苷是修饰的核苷酸，其在掺入到寡核苷酸中时，增强了寡核苷酸对其互补靶标的亲和力，例如通过解链温度(tm)测量。本发明的高亲和力修饰的核苷优选地使每一个修饰的核苷的解链温度增加介于+0.5℃至+12℃之间，更优选地介于+1.5℃至+10℃之间并且最优选地介于+3℃至+8℃之间。许多高亲和力修饰的核苷是本领域已知的，并且包括例如许多2
′
取代的核苷以及锁定的核酸(lna)(参见例如freier&altmann；nucl.acid res.，1997，25，4429-4443和uhlmann；curr.opinion in drug development，2000，3(2)，293-213)。
[0180]
糖修饰
[0181]
与dna和rna中发现的核糖部分相比时，本发明的反义寡核苷酸可包含一种或多种具有经修饰的糖部分(即糖部分的修饰)的核苷。
[0182]
已经制备了许多具有核糖糖部分的修饰的核苷，主要目的为改善寡核苷酸的某些特性，诸如亲和力和/或核酸酶抗性。
[0183]
这样的修饰包括其中核糖环结构被修饰的那些修饰，例如，通过用己糖环(hna)或双环替换核糖环结构来实现，其通常在核糖环(lna)的c2和c4碳原子之间具有双基桥，或通常在c2和c3之间缺乏键的未连接核糖环(例如una)。其他糖修饰的核苷包括，例如，双环己糖核酸(wo2011/017521)或三环核酸(wo2013/154798)。修饰的核苷还包括其中糖部分被非糖部分替换的核苷，例如在肽核酸(pna)或吗啉代核酸的情况下。
[0184]
糖修饰还包括通过将核糖环上的取代基改变为除氢以外的基团或dna和rna核苷中天然存在的2
′‑
oh基团而进行的修饰。例如，可以在2
′
、3
′
、4
′
或5
′
位置引入取代基。
[0185]2′
糖修饰的核苷
[0186]2′
糖修饰的核苷是一种核苷，其在2
′
位置具有除h或-oh以外的取代基(2
′
取代的核苷)或包含能够在2
′
碳与核糖环中的第二个碳原子之间形成桥的2
′
连接双基，诸如lna(2
′‑4′
双基桥连)核苷。
[0187]
事实上，2
′
糖基取代核苷的开发已经得到了广泛的关注，并且许多2
′
取代核苷被发现当并入寡核苷酸中时，具有有益的特性。例如，2
′
修饰的糖可提供对寡核苷酸的增强的结合亲和力和/或增加的核酸酶抗性。2
′
取代的修饰的核苷的实例是2
′‑
o-烷基-rna、2
′‑
o-甲基-rna、2
′‑
烷氧基-rna、2
′‑
o-甲氧基乙基-rna(moe)、2
′‑
氨基-dna、2
′‑
氟-rna和2
′‑
f-ana核苷。有关进一步的实例，请参见例如freier&altmann；nucl.acid res.，1997，25，4429-4443和uhlmann；curr.opinion in drug development，2000，3(2)，293-213以及deleavey和damha，chemistry and biology 2012，19，937。下面为一些2
′
取代的修饰的核苷的示意图。
[0188][0189]
关于本发明，2
′
取代的糖修饰的核苷不包括像lna那样的2
′
桥连的核苷。
[0190]
锁定的核酸核苷(lna核苷)
[0191]“lna核苷”是一种2
′‑
修饰的核苷，其包含连接所述核苷的核糖环的c2
′
和c4
′
的双基(也称为“2
′‑4′
桥”)，其限制或锁定核糖环的构象。这些核苷在文献中也被称为桥连核酸或双环核酸(bna)。当将lna掺入互补rna或dna分子的寡核苷酸中时，核糖构象的锁定与杂交亲和力的增强(双链体稳定化)相关。这可通过测量寡核苷酸/互补双链体的解链温度来常规确定。
[0192]
非限制性的示例性lna核苷公开于wo 99/014226、wo 00/66604、wo 98/039352、wo 2004/046160、wo 00/047599、wo 2007/134181、wo 2010/077578、wo 2010/036698、wo 2007/090071、wo 2009/006478、wo 2011/156202、wo 2008/154401、wo 2009/067647、wo 2008/150729、morita等人，bioorganic&med.chem.lett.12，73-76，seth等人.j.org.chem.2010，vol 75(5)pp.1569-81，和mitsuoka等人，nucleic acids research 2009，37(4)，1225-1238，和wan和seth，j.medical chemistry 2016，59，9645-9667中。
[0193]
其他非限制性的示例性lna核苷公开于方案1中。
[0194]
方案1：
[0195][0196]
特定的lna核苷是β-d-氧基-lna、6
′‑
甲基-β-d-氧基lna诸如(s)-6
′‑
甲基-β-d-氧基-lna(scet)和ena。
[0197]
一种特别有利的lna是β-d-氧基-lna。
[0198]
吗啉代寡核苷酸
[0199]
在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸包含吗啉代核苷或由吗啉代核苷组成(即，是吗啉代寡聚物和作为磷酸二氨基酯吗啉代寡聚物(pmo))。剪接调节吗啉代寡核苷酸已被批准用于临床-参见例如依特普森(eteplirsen)，靶向dmd中框移突变的30nt吗啉代寡核苷酸，用于治疗杜氏肌营养不良。吗啉代寡核苷酸具有附着在六元吗啉环上而不是核糖上的核碱基，诸如通过磷酸二氨基酯基团连接的亚甲基吗啉环，例如由以下4个连续的吗啉代核苷酸所说明：
[0200][0201]
在一些实施例中，本发明的吗啉代寡核苷酸的长度可以是例如20-40个吗啉代核苷酸，诸如长度为25-35个吗啉代核苷酸。
[0202]
rna酶h活性和募集
[0203]
反义寡核苷酸的rna酶h活性是指其与互补rna分子形成双链体时募集rna酶h的能力。wo01/23613提供了用于确定rna酶h活性的体外方法，其可以用于确定募集rna酶h的能力。如果寡核苷酸在提供有互补靶核酸序列的情况下具有的初始速率是使用wo01/23613(通过引用并入本文)的实例91至95提供的方法测量的(以pmol/l/min计)具有与所测试修饰的寡核苷酸相同的碱基序列但仅包含在寡核苷酸中所有单体之间均具有硫代磷酸酯键合dna单体的寡核苷酸的初始速率的至少5％诸如至少10％、至少20％或多于20％，则一般认为该寡核苷酸能够募集rna酶h。为了用于确定rna酶h活性，可从lubio science gmbh(lucerne，switzerland)获得重组rna酶h1。
[0204]
已知dna寡核苷酸可有效募集rna酶h，间隔聚体寡核苷酸也是如此，其包含dna核苷区域(通常至少5个或6个连续dna核苷)，其5
′
和3
′
侧接包含2
′
糖修饰的核苷(通常高亲和力2
′
糖修饰的核苷，诸如2-o-moe和/或lna)的区域。对于剪接的有效调节，前体mrna的降解是非所需的，并且因此优选地，避免靶标的rna酶h降解。因此，本发明的反义寡核苷酸并非rnaseh募集间隔聚体寡核苷酸。
[0205]
可以通过限制寡核苷酸中连续dna核苷酸的数量来避免rna酶h募集，因此可以使用混聚物和全聚物设计。有利地，本发明的反义寡核苷酸，或其连续核苷酸序列不包含多于3个连续dna核苷。进一步，有利地，本发明的反义寡核苷酸，或其连续核苷酸序列不包含多于4个连续dna核苷。进一步有利地，本发明的反义寡核苷酸，或其连续核苷酸序列不包含多
于2个连续dna核苷。
[0206]
混聚物和全聚物
[0207]
对于剪接调节，通常有利的是使用不募集rna酶h的反义寡核苷酸。由于rnaseh活性需要dna核苷酸的连续序列，因此反义寡核苷酸的rnaseh活性可通过设计不包含多于3个或多于4个的连续dna核苷的区域的反义寡核苷酸来实现。这可以通过使用具有混聚物设计的反义寡核苷酸或其连续核苷区域(其包含糖修饰的核苷，诸如2
′
糖修饰的核苷)以及短的dna核苷区(诸如1个、2个或3个dna核苷)来实现。混聚物在本文中通过“每两个”设计(其中核苷在1个lna与1个dna核苷之间交替，例如ldldldldldldldll，具有5
′
端和3
′
端lna核苷)和“每三个”设计(诸如lddlddlddlddlddl，其中每三个核苷为lna核苷)来举例说明。
[0208]
全聚物为不包含dna或rna核苷的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列，并且可以例如仅包含2
′‑
o-moe核苷，诸如完全moe硫代磷酸酯，例如mmmmmmmmmmmmmmmmmmmm，其中m＝2
′‑
o-moe，其被报告为用于治疗用途的有效剪接调节剂。
[0209]
替代性地，混聚物可包含经修饰的核苷的混合物，诸如mlmlmlmlmlmlmlmlmlml，其中l＝lna并且m＝2
′‑
o-moe核苷。
[0210]
有利地，混聚物和全聚物中的核苷间核苷或混聚物中的大部分核苷键合可以为硫代磷酸酯。混聚物和全聚物可包含其他核苷间键合，诸如磷酸二酯或硫代磷酸酯(作为示例)。
[0211]
寡核苷酸中的区域d
′
或d
″
[0212]
在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸可包含寡核苷酸的连续核苷酸序列以及进一步5
′
和/或3
′
核苷或由其组成，该寡核苷酸的连续核苷酸序列与靶核酸(诸如混聚物或全聚物区域)互补。所述其他5
′
和/或3
′
核苷可以与靶核酸互补或可以不互补(诸如完全互补)。此类其他的5’和/或3’核苷本文中可称为区域d’和d
″
。
[0213]
出于将连续核苷酸序列(诸如混聚物或全聚物)与缀合物部分或另一个官能团接合的目的，可以使用添加区域d
′
或d
″
。当用于将连续核苷酸序列与缀合物部分接合时，其可用作可生物裂解的接头。另选地，其可用于提供核酸外切酶保护或促进合成或制造。
[0214]
区域d’或d
′’
可以独立地包含1个、2个、3个、4个或5个另外的核苷酸或由其组成，它们可以与靶核酸互补或不互补。与f或f
′
区域相邻的核苷酸不是糖修饰的核苷酸，诸如dna或rna或这些的碱基修饰形式。d’或d
′’
区域可用作核酸酶敏感的可生物裂解的接头(参见接头的定义)。在一些实施例中，另外的5
′
和/或3
′
端核苷酸与磷酸二酯键联接，并且是dna或rna。wo2014/076195中公开了适合用作区域d
′
或d
″
的基于核苷酸的可生物裂解的接头，其包括例如磷酸二酯连接的dna二核苷酸。wo2015/113922中公开了在聚寡核苷酸构建体中可生物裂解的接头的用途，其中它们被用于在单个寡核苷酸内连接多个反义构建体。
[0215]
在一个实施例中，本发明的反义寡核苷酸除包含构成混聚物或全聚物的连续核苷酸序列外还包含区域d
′
和/或d
″
。
[0216]
在一些实施例中，位于区域d
′
或d
″
与混聚物或全聚物区域之间的核苷间键合为磷酸二酯键合。
[0217]
缀合物
[0218]
本发明包括一种反义寡核苷酸，其共价连接至至少一个缀合物部分。在一些实施例中，它可以称为本发明的缀合物。
[0219]
如本文所用，术语“缀合物”是指与非核苷酸部分(缀合物部分或区域c或第三区域)共价连接的反义寡核苷酸。缀合物部分可以与反义寡核苷酸共价连接，任选地经由接头(诸如区域d
′
或d
″
)基团。
[0220]
寡核苷酸缀合物及其合成也在manoharan于antisense drug technology，principles，strategies，and applications，s.t.crooke编辑，第16章，marcel dekker，inc.，2001中所作综述和manoharan，antisense and nucleic acid drug development，2002，12，103中报导。
[0221]
在一些实施例中，非核苷酸部分(缀合物部分)选自由以下项组成的组：碳水化合物(例如galnac)、细胞表面受体配体、原料药、激素、亲脂物质、聚合物、蛋白质、肽、毒素(例如细菌毒素)、维生素、病毒蛋白(例如衣壳)或它们的组合。
[0222]
连接基
[0223]
键合或接头是两个原子之间的连接，其经由一个或多个共价键将一个目标化学基团或区段与另一个目标化学基团或区段联接。缀合物部分可直接或通过连接部分(例如接头或系链)连接到反义寡核苷酸。接头用于将第三区域诸如缀合物部分(区域c)与第一区域共价连接，该第一区域例如与靶核酸互补的寡核苷酸或连续核苷酸序列(区域a)。
[0224]
在本发明的一些实施例中，本发明的缀合物或反义寡核苷酸缀合物可以任选地包含位于与靶核酸互补的寡核苷酸或连续核苷酸序列(区域a或第一区域)与缀合物部分(区域c或第三区域)之间的接头区域(第二区域或区域b和/或区域y)。
[0225]
区域b是指包含生理上不稳定的键或由其组成的可生物裂解的接头，该键在哺乳动物体内通常遇到的条件下或与之相似的条件下可裂解。生理上不稳定的接头经历化学转化(例如裂解)的条件包括化学条件，诸如ph、温度、氧化或还原条件或试剂，以及在哺乳动物细胞中遇到的盐浓度或与之相似的盐浓度。哺乳动物细胞内条件还包括通常存在于哺乳动物细胞中的酶活性，诸如来自蛋白水解酶或水解酶或核酸酶的酶活性。在一个实施例中，可生物切割的接头对s1核酸酶切割敏感。在一些实施例中，核酸酶敏感接头包含1个至5个核苷，诸如一个或多个包含至少两个连续磷酸二酯键合的dna核苷。包含可生物裂解的接头的磷酸二酯的详细说明请参阅wo 2014/076195。
[0226]
区域y是指不必为可生物裂解的但主要用于将缀合物部分(区域c或第三区域)共价连接至寡核苷酸(区域a或第一区域)的连接基。区域y接头可以包含重复单元诸如乙二醇、氨基酸单元或氨基烷基的链结构或寡聚物。本发明的反义寡核苷酸缀合物可以由以下区域性元件a-c、a-b-c、a-b-y-c、a-y-b-c或a-y-c构成。在一些实施例中，接头(区域y)为氨基烷基，诸如c2-c36氨基烷基基团，包括例如c6至c12氨基烷基基团。在一些实施例中，接头(区域y)为c6氨基烷基基团。
[0227]
治疗
[0228]
本文所用的术语“治疗”是指既存疾病(例如本文所指的疾病或疾患)的治疗或疾病的阻止，即预防。因此将认识到，在一些实施例中，本文所指的治疗可以是预防性的。
[0229]
tdp-43病理
[0230]
tdp-43病理是一种与tdp-43表达减少或异常相关联的疾病，其通常与细胞质tdp-43(特别是过度磷酸化和泛素化tdp-43)的增加相关联。
[0231]
与tdp-43病理相关联的疾病包括肌萎缩侧索硬化症(als)、额颞叶变性(ftld)、阿
尔茨海默病、帕金森病、自闭症、海马硬化性痴呆、唐氏综合征、亨廷顿病、多聚谷氨酰胺疾病诸如脊髓小脑共济失调3、肌病或慢性创伤性脑病。
具体实施方式
[0232]
发明人已经确定，用反义寡核苷酸靶向颗粒蛋白前体mrna前体转录本可以增加颗粒蛋白前体外显子1-外显子2剪接mrna的表达，降低颗粒蛋白前体内含子1-外显子2剪接mrna(保留内含子1的271核苷酸5
′
片段)的表达和/或改变外显子1-外显子2与内含子1-外显子2mrna的比例。当使用包含高亲和力糖修饰的核苷的反义寡核苷酸时，情况尤其如此，诸如高亲和力2’糖修饰的核苷，诸如lna核苷或2
’‑
o-甲氧基乙基(moe)核苷。
[0233]
本文描述的是存在于人类颗粒蛋白前体mrna前体上的靶位点，其可以被反义寡核苷酸靶向。还描述了与这些靶位点互补，诸如完全互补的反义寡核苷酸。
[0234]
不希望受理论束缚，认为本发明的反义寡核苷酸可以通过结合到这些区域并且影响(诸如增加)外显子1-外显子2剪接变体的产生，增加颗粒蛋白前体外显子1-外显子2剪接mrna的表达，降低颗粒蛋白前体内含子1-外显子1剪接mrna的表达和/或改变外显子1-外显子2与内含子1-外显子2mrna的比率。
[0235]
寡核苷酸诸如募集单链反义寡核苷酸或sirna的rna酶h在本领域广泛用于抑制靶标rna，即用作其互补核酸靶标的拮抗剂。
[0236]
本发明的反义寡核苷酸可被描述为调节剂，即它们改变其互补靶标、颗粒蛋白前体mrna前体的特定剪接变体的表达，并且由此增加活性颗粒蛋白前体蛋白的产生。
[0237]
减少颗粒蛋白前体内含子1-外显子2剪接变体的表达是可取的，因为在成熟的mrna序列中包含一个内含子，诸如内含子1，会导致无义介导的mrna衰变(nmd)。
[0238]
增强颗粒蛋白前体外显子1-外显子2上在保留内含子1的5
′
部分的剪接变体的表达是可取的，因为外显子1-外显子2剪接变体不包括内含子1的271个核苷酸片段，在外显子2(开放阅读框)中的经典下游aug上游有两个aug位点。来自这两个上游aug位点的翻译不会编码颗粒蛋白前体蛋白，并且由于提前终止密码子，转录本可能会经历无义介导的mrna衰变(nmd)。将剪接更改为外显子1-外显子2剪接变体将导致颗粒蛋白前体蛋白的活性版本的翻译。颗粒蛋白前体是一种神经保护蛋白，并且增加其产量可用于治疗一系列神经系统疾患，诸如tdp-43病理。
[0239]
在某些实施例中，本发明的反义寡核苷酸可以增强外显子1-外显子2颗粒蛋白前体剪接变体的产生。
[0240]
在某些实施例中，本发明的反义寡核苷酸相对于不存在本发明的反义寡核苷酸情况下的外显子1-外显子2颗粒蛋白前体剪接变体mrna的产生，可以将外显子1-外显子2颗粒蛋白前体剪接变体mrna的产生提高至少约10％。在其他实施例中，本发明的反义寡核苷酸相对于在不存在本发明的反义寡核苷酸的情况下的外显子1-外显子2颗粒蛋白前体剪接变体mrna的产生，可以将外显子1-外显子2颗粒蛋白前体剪接变体mrna的产生提高至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约200％、至少约300％、至少约400％、至少约500％或更多。
[0241]
在某些实施例中，本发明的反义寡核苷酸可以减少内含子1-外显子2颗粒蛋白前
体剪接变体mrna的产生。
[0242]
在某些实施例中，本发明的反义寡核苷酸相对于不存在本发明的反义寡核苷酸的情况下的内含子1-外显子2颗粒蛋白前体剪接变体mrna的产生，可以将内含子1-外显子2颗粒蛋白前体剪接变体mrna的产生减少至少约10％。在其他实施例中，本发明的反义寡核苷酸相对于不存在本发明的反义寡核苷酸的情况下的内含子1-外显子2颗粒蛋白前体剪接变体mrna的产生，可以将内含子1-外显子2颗粒蛋白前体剪接变体mrna的产生减少至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约200％、至少约300％、至少约400％、至少约500％或更多。
[0243]
颗粒蛋白前体外显子1-外显子2剪接变体的增强表达应导致颗粒蛋白前体蛋白活性版本的翻译。在某些实施例中，本发明的反义寡核苷酸相对于不存在本发明的反义寡核苷酸的情况下的颗粒蛋白前体蛋白的产生，可以使颗粒蛋白前体蛋白的产生增加至少约10％。在其他实施例中，本发明的反义寡核苷酸相对于不存在本发明的反义寡核苷酸的情况下的颗粒蛋白前体蛋白的产生，可以使颗粒蛋白前体蛋白的产生增加至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约200％、至少约300％、至少约400％、至少约500％或更多。
[0244]
在某些实施例中，本发明的反义寡核苷酸可以改变外显子1-外显子2与内含子-外显子2颗粒蛋白前体mrna的比率。
[0245]
在某些实施例中，本发明的反义寡核苷酸相对于不存在本发明的反义寡核苷酸的情况下的外显子1-外显子2与内含子1-外显子2颗粒蛋白前体mrna的比率，可以改变外显子1-外显子2与内含子1-外显子2颗粒蛋白前体mrna的比率至少约10％。在其他实施例中，本发明的反义寡核苷酸相对于不存在本发明的反义寡核苷酸的情况下的外显子1-外显子2与内含子1-外显子2颗粒蛋白前体mrna的比率，可以改变外显子1-外显子2与内含子1-外显子2颗粒蛋白前体mrna的比率至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、在至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约100％或更多。
[0246]
在某些实施例中，本发明的反义寡核苷酸可将外显子1-外显子2与内含子1-外显子2颗粒蛋白前体mrna的比率改变为至少约1.2。在某些实施例中，本发明的反义寡核苷酸可以将外显子1-外显子2与内含子1-外显子2颗粒蛋白前体mrna的比率改变为至少约1.3、至少约1.4、至少约1.5、至少约1.6、至少约1.7、至少约1.8、至少约1.9、至少约2.0或更多。
[0247]
在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列在长度上包含10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个或40个连续核苷酸或由其组成。
[0248]
在一些实施例中，反义寡核苷酸的整个核苷酸序列为连续核苷酸序列。
[0249]
在一个实施例中，连续核苷酸序列可为选自由以下项组成的组的序列：seq id no 71、seq id no 73、seq id no 74、seq id no 75和seq id no 134。本发明还设想到了这些
连续核苷酸序列的片段，包括其至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个或至少15个连续核苷酸的片段。
[0250]
在一些实施例中，反义寡核苷酸或连续核苷酸序列包含选自由以下项组成的组的序列或由选自由以下项组成的组的序列组成：seq id no 71、seq id no 73、seq id no 74、seq id no 75和seq id no 134。应当理解，seq id no 71、seq id no 73、seq id no 74、seq id no 75和seq id no 134中所示的序列可包括经修饰的核碱基，这些经修饰的核碱基在碱基配对中充当所示的核碱基，例如，可使用5-甲基胞嘧啶代替甲基胞嘧啶。肌苷可用作通用碱基。
[0251]
在一些实施例中，反义寡核苷酸或连续核苷酸序列包含长度为8个至30个或8个至40个的核苷酸或由其组成，其与选自由seq id no 71、seq id no 73、seq id no 74、seq id no 75和seq id no 134组成的组的序列具有至少90％同一性，优选100％同一性。在一些实施例中，反义寡核苷酸的长度可以为8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个或40个核苷酸。
[0252]
在一些实施例中，反义寡核苷酸或连续核苷酸序列的长度包含8个至30个核苷酸或8个至40个核苷酸或由其组成，与选自由seq id no：289和seq id no：290组成的组的序列具有至少90％同一性、优选100％同一性。在一些实施例中，反义寡核苷酸的长度可以为8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个或40个核苷酸。
[0253]
应当理解，连续核碱基序列(基序序列)可经修饰以例如增加核酸酶抗性和/或对靶核酸的结合亲和力。
[0254]
将修饰的核苷(例如高亲和力修饰的核苷)掺入寡核苷酸序列中的模式通常称为寡核苷酸设计。
[0255]
本发明的反义寡核苷酸经设计具有经修饰的核苷和dna核苷。有利地，使用高亲和力修饰的核苷。
[0256]
在一实施方案中，反义寡核苷酸包含至少1个经修饰的核苷，如至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个或至少16个经修饰的核苷。
[0257]
在一实施方案中，反义寡核苷酸包含1至10个经修饰的核苷，如2至9个经修饰的核苷、如3至8个经修饰的核苷、如4至7个经修饰的核苷、如6或7个经修饰的核苷。合适的修饰在“定义”章节的“修饰的核苷”、“高亲和力修饰的核苷”、“糖修饰”、“2
′
糖修饰”和“锁定的核酸(lna)”下进行了描述。
[0258]
在一实施方案中，反义寡核苷酸包含一个或多个糖修饰的核苷，如2’糖修饰的核苷。优选地，本发明的反义寡核苷酸包含一个或多个2’糖修饰的核苷，其独立地选自2
′‑
o-烷基-rna、2
′‑
o-甲基-rna、2
′‑
烷氧基-rna、2
′‑
o-甲氧基乙基-rna、2
′‑
氨基-dna、2
′‑
氟-dna、阿糖核酸(ana)、2
′‑
氟-ana和lna核苷。如果一个或多个修饰的核苷是锁定的核酸(lna)，则是优选的。
[0259]
在进一步实施例中，反义寡核苷酸包含至少一个经修饰的核苷间键合。合适的核
苷间修饰描述于“定义”章节的“修饰的核苷间键合”下。如果连续核苷酸序列内的至少75％，如所有的核苷间键合是硫代磷酸酯或硼烷磷酸酯核苷间键合，则是有利的。在一些实施例中，寡核苷酸的连续序列中的所有核苷酸间键是硫代磷酸酯键。
[0260]
本发明的编号实施例
[0261]
1.一种反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸的长度为8个至40个核苷酸并且包含长度为8个至40个核苷酸的连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列与人颗粒蛋白前体mrna前体转录本的剪接调节位点互补。
[0262]
2.根据实施例1所述的反义寡核苷酸，其中人颗粒蛋白前体mrna前体转录本包含人颗粒蛋白前体mrna前体转录本的外显子1、内含子1和外显子2序列(seq id no 276)。
[0263]
3.根据实施例1或实施例2所述的反义寡核苷酸，其中连续核苷酸序列的长度为至少12个核苷酸。
[0264]
4.根据实施例3所述的反义寡核苷酸，其中连续核苷酸序列的长度为12个至16个核苷酸。
[0265]
5.根据实施例3所述的反义寡核苷酸，其中连续核苷酸序列的长度为12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个或40个核苷酸。
[0266]
6.根据实施例1至5中任一项所述的反义寡核苷酸，其中连续核苷酸序列的长度与该反义寡核苷酸的长度相同。
[0267]
7.根据实施例1至6中任一项所述的反义寡核苷酸，其中连续核苷酸序列与人颗粒蛋白前体mrna前体转录本完全互补。
[0268]
8.根据实施例1至7中任一项所述的反义寡核苷酸，其中连续核苷酸序列与包含在seq id no：276的核苷酸441至468内的核苷酸序列互补。
[0269]
9.根据实施例8所述的反义寡核苷酸，其中连续核苷酸序列与包含在seq id no 276的核苷酸441至462内的核苷酸序列互补。
[0270]
10.根据实施例9所述的反义寡核苷酸，其中连续核苷酸序列与seq id no 277、seq id no 278、seq id no 279或seq id no 280互补。
[0271]
11.根据实施例1至10中任一项所述的反义寡核苷酸，其中连续核苷酸序列与seq id no 277、seq id no 278、seq id no 279或seq id no 280完全互补。
[0272]
12.根据实施例1至11中任一项所述的反义寡核苷酸，其中连续核苷酸序列选自seq id no 71、seq id no 73、seq id no 74和seq id no 75或其至少8个或至少10个连续核苷酸。
[0273]
13.根据实施例12所述的反义寡核苷酸，其中连续核苷酸序列为seq id no 71。
[0274]
14.根据实施例12所述的反义寡核苷酸，其中连续核苷酸序列为seq id no 73。
[0275]
15.根据实施例12所述的反义寡核苷酸，其中连续核苷酸序列为seq id no 74。
[0276]
16.根据实施例12所述的反义寡核苷酸，其中连续核苷酸序列为seq id no 75。
[0277]
17.根据实施例1至7中任一项所述的反义寡核苷酸，其中连续核苷酸序列与包含在seq id no：276的核苷酸268至283内的核苷酸序列互补。
[0278]
18.根据实施例17所述的反义寡核苷酸，其中连续核苷酸序列与seq id no 281互补。
[0279]
19.根据实施例17或实施例18所述的反义寡核苷酸，其中连续核苷酸序列与seq id no 281完全互补。
[0280]
20.根据实施例17至19中任一项所述的反义寡核苷酸，其中连续核苷酸序列为seq id no 134，或其至少8个或至少10个连续核苷酸。
[0281]
21.根据实施例1至7中任一项所述的反义寡核苷酸，其中连续核苷酸序列选自由以下项组成的组：seq id no 51、seq id no 52、seq id no 53、seq id no 54、seq id no 55、seq id no 62、seq id no 63、seq id no 67、seq id no 71、seq id no 73、seq id no 74、seq id no 75、seq id no 100、seq id no 134、seq id no 135、seq id no 196、seq id no 220、seq id no 228和seq id no 252。
[0282]
22.根据实施例1至21中任一项所述的反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸是分离、纯化或制造的。
[0283]
23.根据实施例1至22中任一项所述的反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含一个或多个经修饰的核苷酸或一个或多个经修饰的核苷。
[0284]
24.根据实施例1至23中任一项所述的反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含一个或多个经修饰的核苷，诸如一个或多个独立地选自由以下项组成的组的经修饰的核苷：2
′‑
o-烷基-rna；2
′‑
o-甲基rna(2
′‑
ome)；2
′‑
烷氧基-rna；2
′‑
o-甲氧基乙基-rna(2
′‑
moe)；2
′‑
氨基-dna；2
′‑
氟-rna；2
′‑
氟-dna；阿糖核酸(ana)；2
′‑
氟-ana；双环核苷类似物(lna)；或其任何组合。
[0285]
25.根据实施例23或实施例24所述的反义寡核苷酸，其中一个或多个经修饰的核苷为糖修饰核苷。
[0286]
26.根据实施例23至25中任一项所述的反义寡核苷酸，其中一个或多个经修饰的核苷包含双环糖。
[0287]
27.根据实施例23至26中任一项所述的反义寡核苷酸，其中一个或多个经修饰的核苷为亲和力增强的2
′
糖修饰核苷。
[0288]
28.根据实施例23至27中任一项所述的反义寡核苷酸，其中一个或多个经修饰的核苷为lna核苷，诸如一个或多个β-d-氧基lna核苷。
[0289]
29.根据实施例1至28中任一项所述的反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含一个或多个5
′‑
甲基-胞嘧啶核碱基。
[0290]
30.根据实施例1至29中任一项所述的反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸的连续核苷酸序列内的一个或多个核苷间键合是经修饰的。
[0291]
31.根据实施例30所述的反义寡核苷酸，其中至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或约100％的核苷间键合是经修饰的。
[0292]
32.根据实施例30或实施例31所述的反义寡核苷酸，其中一个或多个经修饰的核苷间键合包含硫代磷酸酯键合。
[0293]
33.根据实施例1至32中任一项所述的反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸为吗啉代经修饰的反义寡核苷酸。
[0294]
34.根据实施例1至22中任一项所述的反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸为反义寡核苷酸混聚物或全聚物或包含反义寡核苷酸混聚物或全聚物。
[0295]
35.根据实施例1至34中任一项所述的反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸或其连续
核苷酸序列的长度为10个至20个核苷酸。
[0296]
36.根据实施例35所述的反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列的长度为16个核苷酸。
[0297]
37.一种反义寡核苷酸，其具有以下结构：
[0298][0299]
38.一种反义寡核苷酸，其具有以下结构：
[0300][0301]
39.一种反义寡核苷酸，其具有以下结构：
[0302][0303]
40.一种反义寡核苷酸，其具有以下结构：
[0304][0305]
41.一种反义寡核苷酸，其具有以下结构：
[0306][0307]
42.一种反义寡核苷酸，其中寡核苷酸为寡核苷酸化合物gagctgggtcaagaat(seq id no：71)，其中大写字母代表β-d-氧基lna核苷，小写字母代表dna核苷，所有lna c均为5-甲基胞嘧啶，并且所有核苷间键合均为硫代磷酸酯核苷间键合。
[0308]
43.一种反义寡核苷酸，其中寡核苷酸为寡核苷酸化合物ggtcaagaatggtgtg(seq id no：73)，其中大写字母代表β-d-氧基lna核苷，小写字母代表dna核苷，所有lna c均为5-甲基胞嘧啶，并且所有核苷间键合均为硫代磷酸酯核苷间键合。
[0309]
44.一种反义寡核苷酸，其中寡核苷酸为寡核苷酸化合物cagaatggtgtggtc(seq id no 74)，其中大写字母代表β-d-氧基lna核苷，小写字母代表dna核苷，所有lna c均为5-甲基胞嘧啶，并且所有核苷间键合均为硫代磷酸酯核苷间键合。
[0310]
45.一种反义寡核苷酸，其中寡核苷酸为寡核苷酸化合物gaatggtgtggtccc(seq id no 75)，其中大写字母代表β-d-氧基lna核苷，小写字母代表dna核苷，所有lna c均为5-甲基胞嘧啶，并且所有核苷间键合均为硫代磷酸酯核苷间键合。
[0311]
46.一种反义寡核苷酸，其中寡核苷酸为寡核苷酸化合物ctcaagctcacatggc(seq id no 134)，其中大写字母代表β-d-氧基lna核苷，小写字母代表dna核苷，所有lna c均为5-甲基胞嘧啶，并且所有核苷间键合均为硫代磷酸酯核苷间键合。
[0312]
47.根据实施例1至46中任一项所述的反义寡核苷酸，其共价连接至至少一个缀合物部分。
[0313]
48.根据实施例1至47中任一项所述的反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸呈药用盐的形式。
[0314]
49.根据实施例48所述的反义寡核苷酸，其中盐为钠盐、钾盐或铵盐。
[0315]
50.一种药物组合物，其包含根据实施例1至49中任一项所述的反义寡核苷酸以及药用的稀释剂、溶剂、载体、盐和/或佐剂。
[0316]
51.根据实施例50所述的药物组合物，其中药物组合物包含水性稀释剂或溶剂，诸如磷酸盐缓冲盐水。
[0317]
52.一种用于增强表达颗粒蛋白前体的细胞中外显子1-外显子2颗粒蛋白前体剪接变体的表达的体内或体外方法，所述方法包括向所述细胞施用有效量的根据实施例1至49中任一项所述的反义寡核苷酸或根据实施例50或实施例51所述的药物组合物。
[0318]
53.根据实施例52所述的方法，其中细胞为人细胞或哺乳动物细胞。
[0319]
54.一种用于治疗或预防神经系统疾病的方法，其包括向患有或易患神经系统疾病的受试者施用治疗或预防有效量的根据实施例1至49中任一项所述的反义寡核苷酸或根据实施例50或实施例51所述的药物组合物。
[0320]
55.一种用于治疗或预防神经系统疾病的方法，其包括向患有或易患颗粒蛋白前体单倍剂量不足或相关疾患的受试者施用治疗或预防有效量的根据实施例1至49中任一项所述的反义寡核苷酸或根据实施例50或实施例51所述的药物组合物。
[0321]
56.根据实施例1至49中任一项所述的反义寡核苷酸或根据实施例50或实施例51所述的药物组合物，其用作药物。
[0322]
57.根据实施例1至49中任一项所述的反义寡核苷酸或根据实施例50或实施例51所述的药物组合物，其用于治疗神经系统疾病。
[0323]
58.根据实施例56所述的用于治疗神经系统疾病的反义寡核苷酸或药物组合物，其中神经系统疾病为tdp-43病理状况。
[0324]
59.根据实施例1至49中任一项所述的反义寡核苷酸或根据实施例50或实施例51所述的药物组合物，其用于治疗颗粒蛋白前体单倍剂量不足或相关疾患。
[0325]
60.根据实施例1至49中任一项所述的反义寡核苷酸或根据实施例50或实施例51所述的药物组合物用于制备药物的用途，该药物用于治疗或预防神经系统疾病。
[0326]
61.根据实施例60所述的反义寡核苷酸或药物组合物的用途，其中神经系统疾病为tdp-43病理状况。
[0327]
62.根据实施例1至49中任一项所述的反义寡核苷酸或根据实施例50或实施例51所述的药物组合物用于制备药物的用途，该药物用于治疗或预防颗粒蛋白前体单倍剂量不足或相关疾患。
[0328]
实例
[0329]
实例1：筛选275种寡核苷酸对内含子1跳跃的影响
[0330]
在培养基中转染前一天，将h4神经胶质瘤细胞以每孔15000个细胞接种在96孔板中(dmem sigma：d0819、15％fbs、1 mm丙酮酸钠、25μg/m1庆大霉素)。
[0331]
选择小胶质细胞进行分析是因为这些细胞产生高水平的颗粒蛋白前体。单独减少小胶质细胞中的颗粒蛋白前体就足以以细胞自主方式再现炎症、溶酶体功能障碍和过度增殖。因此，靶向颗粒蛋白前体不足引起的小胶质细胞功能障碍代表了一种潜在的治疗策略来管理额颞叶痴呆的神经变性。为研究对细胞系统中颗粒蛋白前体的影响，已使用源自癌症患者的可商购获得的神经胶质细胞系h4细胞(atcc htb-148)鉴别能够增加颗粒蛋白前体产量的寡核苷酸。
[0332]
为进一步使用表现出与人小胶质细胞相似的功能特征(包括吞噬作用和细胞因子介导的炎症反应)并且表达相关的小胶质细胞标志物的小胶质细胞，已使用购自fujifilm cellular dynamics inc.的hipsc源性小胶质细胞microglia(货号r1131)研究选定的寡核苷酸对颗粒蛋白前体产量的影响。
[0333]
使用lipofectamine 2000(invitrogen)采用以下步骤进行转染。
[0334]
从细胞中去除培养基并且添加含有6.25μg/ml lipofectamine 2000(invitrogen)的80μl optimem还原血清培养基(gibco)，向每个孔中添加20μl optimem和化合物(125nm)(最终25nm)。作为对照，使用pbs代替化合物。5小时后，从孔中去除转染溶液并且加入完全生长培养基。转染后第二天，通过添加125μl rlt缓冲液(qiagen)并且使用来自qiagen的rneasy 97试剂盒和协议提取rna。cdna合成使用4ul输入rna进行并且使用用于rt-qpcr(bio-rad)的iscript高级cdna合成试剂盒进行，并且根据制造商的协议，2μl用作数字液滴pcr的输入使用，其使用ddpcr supermix作为探针(无dutp)(bio-rad)。使用了以下引物和探针(idt)：grn外显子1-外显子2(fam)：
[0335]
引物1：gctgctgcccaaggaccgcgga(seq id no 282)
[0336]
引物2：gccctgctgttaaggccaccca(seq id no 283)
[0337]
探针/56-fam/ggacgcagg/zen/cagaccatgtggaccctg/3iabkfq/(seq id no 284)
[0338]
grn内含子1-外显子2(hex)：
[0339]
引物1：ccaaagcagggaccacaccattctt(seq id no 285)
[0340]
引物2：gccctgctgttaaggccaccca(seq id no 286)
[0341]
探针/5hex/cccagctcc/zen/acccctgtcggcagaccatg/3iabkfq/(seq id no 287)
[0342]
hprt1：hprt1(fam，pt.58v.45621572，idt)和hprt1(hex，hs.pt.58v.45621572)idt。
[0343]
外显子1-外显子2grn mrna和内含子1-外显子2grn mrna浓度相对于管家基因hprt1使用quantasoft软件(bio-rad)进行量化。
[0344]
根据外显子1-外显子2mrna剪接形式相对于hprt1和内含子1-外显子2相对于hprt1的表达对化合物进行分析和排序，并且结果在图1中示出。
[0345]
相对于pbs转染的细胞，以下化合物显示外显子1-外显子2剪接mrna的表达增加，内含子1-外显子1剪接mrna的表达减少以及外显子1-外显子2与内含子1-外显子2的比率变化超过25％：化合物id#51、id#52、id#53、id#54、id#55、id#62、id#63、id#67、id#71、id#73、id#74、id#75、id#100、id#134、id#135、id#196、id#220、id#228和id#252，如图1所示。
[0346]
表1：所有反义寡核苷酸均设计为具有硫代磷酸酯主链的16聚体dna-lna混聚物、
具有硫代磷酸酯的dna-lna混聚物，lna位于5
′
和3
′
末端位置，例如对于每2个或每3个核苷酸的lna(参见化合物表)。
[0347]
[0348]
[0349]
[0350]
[0351]
[0352]
[0353]
[0354]
[0355][0356]
实例2：测试寡核苷酸对颗粒蛋白前体表达的影响
[0357]
将h4神经胶质瘤细胞以每孔5000个细胞接种在96孔板中，在200μl培养基中用最终浓度为3μm或10μm的的寡核苷酸处理5天。利用购自abcam的elisa(ab252364)评估按1∶8稀释后的培养基中的颗粒蛋白前体表达水平。如图2所示，与pbs相比，寡核苷酸#71、#73、#74、#75和#134诱导颗粒蛋白前体分泌超过1.5倍。专利(wo 2020/191212a1)中寡核苷酸s7和s10的比较效果在图3中示出。
[0358]
实例3：寡核苷酸的序列定位
[0359]
seq id no：73、seq id no：74、seq id no：75和seq id no：134的序列定位如图4所示。
[0360]
实例4：测试寡核苷酸对hipsc衍生的小胶质细胞中颗粒蛋白前体表达的影响
[0361]
将hipsc衍生的小胶质细胞(icell小胶质细胞试剂盒，01279，目录号r1131)接种(n＝3)在聚-d-赖氨酸包被的96孔板(greiner目录号#655946)中，每孔具有20000个细胞，200μl，并且进行用指定浓度的seq id no：73、seq id no：74、seq id no：75和seq id no：134处理4天。使用abcam(ab252364)的elisa，评估按1：8稀释后的培养基中的颗粒蛋白前体表达水平。如图5所示，与pbs相比，seq id no：73、seq id no：74、seq id no：75和seq id no：134诱导颗粒蛋白前体分泌超过1.5倍。来自wo 2020/191212的寡核苷酸s7、s10和s37的比较效果在图6中示出。
[0362]
实例5：测试寡核苷酸对h4神经胶质瘤细胞中颗粒蛋白前体表达的影响，在培养基中转染前一天，将h4神经胶质瘤细胞以每孔15000个细胞接种在96孔板中(dmem sigma：d0819、15％fbs、1mm丙酮酸钠、25μg/ml庆大霉素)。使用lipofectamine 2000(invitrogen)采用以下步骤进行转染。从细胞中去除培养基并且添加含有6.25μg/ml lipofectamine 2000(invitrogen)的80μl optimem还原血清培养基(gibco)，向每个孔中添加20μl optimem和化合物(125nm)(最终25nm)。作为对照，使用pbs代替化合物。5小时后，从孔中去除转染溶液并且加入完全生长培养基。转染后第二天，通过添加125μl rlt缓冲液(qiagen)并且使用来自qiagen的rneasy 97试剂盒和协议提取rna。cdna合成使用4μl输入rna进行并且使用用于rt-qpcr(bio-rad)的iscript高级cdna合成试剂盒进行，并且根据制造商的协议，2μl用作数字液滴pcr的输入使用，其使用ddpcr supermix作为探针(无dutp)(bio-rad)。
[0363]
使用了以下引物和探针(idt)
[0364]
grn外显子1-外显子2(fam)：
[0365]
引物1：gctgctgcccaaggaccgcgga，
[0366]
引物2：gccctgctgttaaggccaccca和
[0367]
探针/56-fam/ggacgcagg/zen/cagaccatgtggaccctg/3iabkfq/grn内含子1-外显子2(hex)：
[0368]
引物1：ccaaagcagggaccacaccattctt，
[0369]
引物2：gccctgctgttaaggccaccca和
[0370]
探针/5hex/cccagctcc/zen/acccctgtcggcagaccatg/3iabkfq/hprt1：hprt1(fam，pt.58v.45621572，idt)和hprt1(hex，hs.pt.58v.45621572)idt。
[0371]
外显子1-外显子2grn mrna和内含子1-外显子2grn mrna浓度相对于管家基因hprt1使用quantasoft软件(bio-rad)进行量化。
[0372]
seq id#73、seq id#74和seq id#75的结果在图7中示出。seq id#73、seq id#74和seq id#75显示内含子1保留(int1-ex2)的剂量依赖性跳跃和ex1-ex2剪接变体的增加。来自wo 2020/191212的s10化合物显示对内含子1保留的跳跃没有/有限影响。
[0373]
实例6-测试寡核苷酸对h4神经胶质瘤细胞颗粒蛋白前体表达的影响
[0374]
在培养基中转染前一天，将h4神经胶质瘤细胞以每孔15000个细胞接种在96孔板中(dmem sigma：d0819、15％fbs、1mm丙酮酸钠、25μg/ml庆大霉素)。使用lipofectamine 2000(invitrogen)采用以下步骤进行转染。从细胞中去除培养基并且添加含有6.25μg/ml lipofectamine 2000(invitrogen)的80μl optimem还原血清培养基(gibco)，向每个孔中添加20μl optimem和化合物(125nm)(最终25nm)。作为对照，使用pbs代替化合物。5小时后，从孔中去除转染溶液并且加入完全生长培养基。转染后第二天，通过添加125μl rlt缓冲液(qiagen)并且使用来自qiagen的rneasy 97试剂盒和协议提取rna。cdna合成使用4μl输入rna进行并且使用用于rt-qpcr(bio-rad)的iscript高级cdna合成试剂盒进行，并且根据制造商的协议，2μl用作数字液滴pcr的输入使用，其使用ddpcr supermix作为探针(无dutp)(bio-rad)。使用了以下引物和探针(idt)grn外显子1-外显子2(fam)：
[0375]
引物1：gctgctgcccaaggaccgcgga，
[0376]
引物2：gccctgctgttaaggccaccca和
[0377]
探针/56-fam/ggacgcagg/zen/cagaccatgtggaccctg/3iabkfq/grn内含子1-外显子2(hex)：引物1：
[0378]
ccaaagcagggaccacaccattctt，
[0379]
引物2：gccctgctgttaaggccaccca和
[0380]
探针/5hex/cccagctcc/zen/acccctgtcggcagaccatg/3iabkfq/hprt1：hprt1(fam，pt.58v.45621572，idt)和hprt1(hex，hs.pt.58v.45621572)idt。
[0381]
外显子1-外显子2grn mrna和内含子1-外显子2grn mrna浓度相对于管家基因hprt1使用quantasoft软件(bio-rad)进行量化。
[0382]
seq id#289和seq id#290的结果在图8中示出。seq id：289和290显示了内含子1保留(int1-ex2)的剂量依赖性跳跃和ex1-ex2剪接变体的增加。来自wo 2020/191212的s10化合物显示对内含子1保留的跳跃没有/有限影响。
[0383]
实例7-测试寡核苷酸对hipsc衍生的小胶质细胞中颗粒蛋白前体表达的影响
[0384]
将hipsc衍生的小胶质细胞(icell小胶质细胞试剂盒，01279，目录号r1131)接种(n＝3)在聚-d-赖氨酸包被的96孔板(greiner目录号#655946)中，每孔具有20000个细胞，200μl，并且用不同浓度的化合物s10和seq id#290处理5天。
[0385]
通过添加125μl rlt缓冲液(qiagen)并且使用来自qiagen的rneasy 97试剂盒和协议提取rna。cdna合成使用使用4μl输入rna并且使用用于rt-qpcr(bio-rad)的iscript高级cdna合成试剂盒进行，并且根据制造商的协议，2μl用作数字液滴pcr的输入，其使用ddpcr supermix作为探针(无dutp)(bio-rad)。使用了以下引物和探针(idt)
[0386]
grn外显子1-外显子2(fam)：
[0387]
引物1：gctgctgcccaaggaccgcgga，
[0388]
引物2：gccctgctgttaaggccaccca和
[0389]
探针/56-fam/ggacgcagg/zen/cagaccatgtggaccctg/3iabkfq/grn内含子1-外显子2(hex)：
[0390]
引物1：ccaaagcagggaccacaccattctt，
[0391]
引物2：gccctgctgttaaggccaccca和
[0392]
探针/5hex/cccagctcc/zen/acccctgtcggcagaccatg/3iabkfq/gapdh：gapdh(fam，hs.pt.39a.22214836，idt)和gapdh(hex，hs.pt.39a.22214836，idt)。
[0393]
外显子1-外显子2grn mrna和内含子1-外显子2grn mrna浓度相对于管家基因gapdh使用quantasoft软件(bio-rad)进行量化。
[0394]
seq id#290的结果在图9中示出。seq id：290显示内含子1保留(intl-ex2)的剂量依赖性跳跃和exl-ex2剪接变体的增加。来自wo 2020/191212的s10化合物显示对内含子1保留的跳跃没有/有限的影响，包括间隔聚体作为对照，显示了两种剪接变体的预期剂量依赖性敲低。
[0395]
实例8-使用seq id no：290的剪接开关分析
[0396]
在培养基中转染前一天，将h4神经胶质瘤细胞以每孔15000个细胞接种在96孔板中(dmem sigma：d0819、15％fbs、1mm丙酮酸钠、25μg/ml庆大霉素)。使用lipofectamine 2000(invitrogen)采用以下步骤进行转染。从细胞中去除培养基并且添加含有6.25μg/ml lipofectamine 2000(invitrogen)的80μl optimem还原血清培养基(gibco)，向每个孔中添加20μl optimem和化合物(125nm)(最终25nm)。作为对照，使用pbs代替化合物。5小时后，从孔中去除转染溶液并且加入完全生长培养基。转染后两天，通过添加350μl magnapure裂解缓冲液(roche)并且使用来自roche的magnapure系统和协议(包括dna酶处理)提取rna。总rna在50μl洗脱缓冲液中洗脱。kapa mrna hyperprep试剂盒(roche)用于生成下一代测序(ngs)文库，使用100ng总rna作为输入。在illumina nextseq 550系统上进行测序，每个样品获得超过3000万个配对的末端读数(2x151bp)。通过去除3
′
端的1个核苷酸来修剪读数，并且在使用clc genomic workbench(qiagen)进行rna-seq分析之前，对每个样品进行二次取样至3000万个读数。为了生成生鱼片图(显示跨越外显子连接处的读数的数量)，bam文件从clc genomic workbench(qiagen)导出并导入到broad institute的the integrative genomics viewer(igv)(版本igv_2.8.2)中。生鱼片图显示了用id#290并且不是来自wo 2020/191212的s10化合物剪接转换，以获得从外显子1到外显子2的正确剪接。这种如图10所示。
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技术特征：
1.一种反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸的长度为8个至40个核苷酸并且包含长度为8个至40个核苷酸的连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列与人颗粒蛋白前体mrna前体转录本的剪接调节位点互补。2.根据权利要求1所述的反义寡核苷酸，其中所述人颗粒蛋白前体mrna前体转录本包含所述人颗粒蛋白前体mrna前体转录本的外显子1、内含子1和外显子2序列(seq id no 276)。3.根据权利要求1或权利要求2所述的反义寡核苷酸，其中所述连续核苷酸序列与seq id no 277、seq id no 278、seq id no 279或seq id no 280互补。4.根据权利要求1至3中任一项所述的反义寡核苷酸，其中所述连续核苷酸序列选自seq id no 71、seq id no 73、seq id no 74和seq id no 75，或其至少8个或至少10个连续核苷酸。5.根据权利要求1或权利要求2所述的反义寡核苷酸，其中所述连续核苷酸序列与seq id no 281互补。6.根据权利要求5所述的反义寡核苷酸，其中所述连续核苷酸序列为seq id no 134，或其至少8个或至少10个连续核苷酸。7.根据权利要求1或权利要求2所述的反义寡核苷酸，其中所述连续核苷酸序列选自由以下项组成的组：seq id no 51、seq id no 52、seq id no 53、seq id no 54、seq id no 55、seq id no 62、seq id no 63、seq id no 67、seq id no 71、seq id no 73、seq id no 74、seq id no 75、seq id no 100、seq id no 134、seq id no 135、seq id no 196、seq id no 220、seq id no 228和seq id no 252。8.根据权利要求1至7中任一项所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含一个或多个经修饰的核苷酸或一个或多个经修饰的核苷。9.根据权利要求1至7中任一项所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸为反义寡核苷酸混聚物或全聚物或包含反义寡核苷酸混聚物或全聚物。10.一种反义寡核苷酸，其具有以下结构：
11.一种反义寡核苷酸，其中所述寡核苷酸为寡核苷酸化合物gagctgggtcaagaat(seq id no：71)、ggtcaagaatggtgtg(seq id no：73)、cagaatggtgtggtc(seq id no 74)、gaatggtgtggtccc(seq id no 75)或ctcaagctcacatggc(seq id no 134)，其中大写字母代表β-d-氧基lna核苷，小写字母代表dna核苷，所有lna c均为5-甲基胞嘧啶，并且所有核苷间键合均为硫代磷酸酯核苷间键合。12.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至11中任一项所述的反义寡核苷酸以及药用的稀释剂、溶剂、载体、盐和/或佐剂。13.一种用于增强表达颗粒蛋白前体的细胞中外显子1-外显子2颗粒蛋白前体剪接变体的表达的体内或体外方法，所述方法包括向所述细胞施用有效量的根据权利要求1至11中任一项所述的反义寡核苷酸或根据权利要求12所述的药物组合物。14.根据权利要求1至12中任一项所述的反义寡核苷酸或根据权利要求13所述的药物组合物，其用于治疗神经系统疾病。15.根据权利要求1至12中任一项所述的反义寡核苷酸或根据权利要求13所述的药物组合物，其用于治疗颗粒蛋白前体单倍剂量不足或相关疾患。

技术总结
本发明涉及修改细胞中颗粒蛋白前体的剪接模式的寡核苷酸，以及它们在治疗神经系统疾患中的用途。患中的用途。


技术研发人员：拉维
受保护的技术使用者：豪夫迈
技术研发日：2021.12.16
技术公布日：2023/8/13