醛糖还原酶抑制剂作为制备治疗或预防药物性耳聋药物的应用

1.本发明涉及治疗或预防药物性耳聋药物技术领域，特别是涉及醛糖还原酶抑制剂作为制备治疗或预防药物性耳聋药物的应用。


背景技术：

2.听力损失是一项全球性的健康问题，根据2021年世界卫生组织(who)的报告，超过15亿人口，占全球人口的20.3％，受到听力损失的影响。导致听力损失的主要原因包括听觉创伤、遗传变异以及耳毒性药物等因素。
3.顺铂是一种广泛用于癌症治疗的化疗药物，但其引起的药物性听力损失的严重影响治疗后的生活质量。已有研究表明，顺铂诱导耳毒性的机制主要涉及氧化还原稳态的失衡、炎症的过度激活等。耳蜗听觉感受器(corti)是主要的感音结构，在听觉形成中起至关重要的作用，其中耳蜗毛细胞(hc)、支持细胞(sc)和螺旋神经节神经元(sgn)是形成感音功能的关键。铂类药物可以通过血液-内淋巴屏障进入内耳，并通过ctr1、oct2和met等多个跨膜通道进入感觉毛细胞，导致线粒体dna损伤和毛细胞死亡。此外，支持细胞和螺旋神经节神经元也容易受到顺铂耳毒性的影响。尽管已经进行了一些临床前和临床试验探索能够预防或治疗顺铂引起的听力损失的药物，如抗氧化剂和抗炎药等，但大多数药物的有效性仍有限，迄今为止还没有临床批准的药物可以治疗或预防铂类药物引起的听力损失。因此，研究和开发更多的听力保护药物仍然具有重要意义。
4.醛糖还原酶(ar，aldose reductase)是多元醇途径中的限速酶，使用nadph作为氢化物供体将葡萄糖底物转化为山梨醇。醛糖还原酶存在于许多组织和器官中，但其在正常生理条件下活性较低。然而，当受到糖尿病、肿瘤、组织缺血等刺激时，醛糖还原酶的活性显着增加。先前的研究表明，醛糖还原酶活性增加可导致糖尿病周围神经损伤，糖尿病肾病和心脏缺血再灌注损伤等并发症。在外周神经损伤中，醛糖还原酶抑制剂可能具有以下作用：1)抗炎作用：外周神经损伤常伴有炎症反应，而醛糖还原酶抑制剂可能通过减轻炎症反应来发挥保护作用。它们可能抑制炎性介质的释放，减少炎症细胞的浸润，从而减轻神经组织的炎症损伤。2)抗氧化作用：外周神经损伤会导致氧化应激，增加自由基的产生，损伤细胞和组织。醛糖还原酶抑制剂可能通过减少氧化应激和自由基的生成，保护神经组织免受氧化损伤。3)神经保护作用：醛糖还原酶抑制剂可能通过多种机制对神经组织起到保护作用。它们可能减少神经细胞凋亡，促进神经细胞的再生和修复，增强神经组织的抗损伤能力。其中依帕司他是一种已上市的醛糖还原酶抑制剂，主要用于治疗糖尿病其并发症用于改善糖尿病并发的末梢神经障碍和神经病变等。然而目前为止没有关于醛糖还原酶在耳科领域的研究。
5.迄今为止，还没有临床批准的药物可以治疗或预防铂类药物引起的听力损失。因此，对醛糖还原酶的抑制为预防听力损失的一种有希望的作用靶点，醛糖还原酶抑制剂是否能发挥治疗或预防听力损失的作用，是本领域技术人员凾待研究的问题。


技术实现要素：

6.本发明的目的是针对现有技术中存在的对治疗或预防药物性耳聋的药物的研究不足，而提供一种醛糖还原酶抑制剂作为制备治疗或预防药物性耳聋药物的应用。
7.本发明的另一目的，提供一种治疗或预防药物性耳聋的药物。
8.为实现本发明的目的所采用的技术方案是：
9.一种醛糖还原酶抑制剂作为制备治疗或预防药物性耳聋药物的应用。
10.在上述技术方案中，所述醛糖还原酶抑制剂为托瑞司他、非达司他、唑泊司他、榭皮素、银椴苷和依帕司他中的一种或多种。
11.在上述技术方案中，所述所述醛糖还原酶抑制剂为银椴苷和/或依帕司他。
12.在上述技术方案中，所述依帕司他经腹腔给药，给药量为20-40mg/kg；
13.所述银椴苷为每侧耳经鼓室给药，给药量为0.175-0.3mg/kg。
14.在上述技术方案中，所述药物性耳聋为铂类药物和/或氨基糖苷类抗生素所导致的耳聋。
15.在上述技术方案中，所述铂类药物为顺铂。
16.本发明的另一方面，提供一种治疗或预防药物性耳聋的药物，包括醛糖还原酶抑制剂。
17.在上述技术方案中，所述药物还包括缓释剂。
18.在上述技术方案中，所述缓释剂为泊洛沙姆。
19.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
20.本发明中首次将醛糖还原酶抑制剂依应用于预防或治疗药物性耳聋中，经试验表明，醛糖还原酶抑制剂可以减轻顺铂诱导的醛糖还原酶活性增高。其中，依帕司他和顺铂共同培养耳蜗外植体，发现不同浓度的依帕司他(10/50/100μm)对顺铂引起的毛细胞损伤都有保护作用。依帕司他用于小鼠顺铂急性耳毒性模型，可以缓解顺铂诱导的听力损失。并且发现银椴苷作为新的醛糖还原酶抑制剂同样具有缓解顺铂诱导的听力损失的性能，具体的，银椴苷应用于新生鼠耳蜗离体培养时，银椴苷在p2新生鼠耳蜗离体培养中显示出对耳蜗毛细胞(hcs)和螺旋神经元神经节(sgn)的保护作用。银椴苷应用于小鼠体内的顺铂损伤模型时，银椴苷显著改善了顺铂引起的听力损失。通过动物实验证实，银椴苷对顺铂诱导的听力损失具有保护作用，听性脑干反应检测结果显示，在小鼠的主要听力频率范围内，银椴苷能使听力阈值改善10-20db。
21.这些结果证明醛糖还原酶抑制剂通过抑制顺铂损伤时醛糖还原酶增高，降低耳蜗毛细胞氧化应激水平，有效抑制细胞凋亡，同时改善顺铂诱导的听力损失。为药物性耳聋的预防和治疗开辟了一条新的途径，同时这也为制备减轻药物性耳聋副作用的抗癌药物提供了新思路。
附图说明
22.图1为western印迹检测ar蛋白表达，其中，图1a为不同实验组ar蛋白的sds-page分析，图1b为不同实验组的ar蛋白表达量数据。统计分析：#，p《0.05；**，p《0.01，数据显示平均值
±
sem。
23.图2a为ar(绿色)与myosin7a(红色)在耳蜗hc中的免疫荧光染色，图2b为毛细胞的
计数统计，横坐标为不同实验分组，纵坐标为每200μm的myosin7a-ar共标阳性的毛细胞数，图中计数为均数
±
sem。统计分析：****/####，p《0.0001。
24.图3a为醛糖还原酶活性在340nm处nadph吸光度图，斜率最大为ar阳性对照组表示酶活性最高，黑色线为顺铂损伤组，其斜率对比对照组也有改变，横坐标为测试的时间，纵坐标为340nm处的吸光值；图3b为结合bca的蛋白质浓度测定，计算耳蜗外植体(约15μg蛋白浓度)的醛糖还原酶活性，横坐标代表不同处理组，纵坐标为计算所得的ar活性值。统计分析：**/##，p《0.01，数据显示平均值
±
sem。
25.图4a为依帕司他和顺铂共同培养的耳蜗外植体的免疫荧光染色，myosin7a(绿色荧光)用于标记毛细胞。图4b为毛细胞的计数统计，横坐标为耳蜗对应部位，纵坐标为每100μm的myosin7a阳性的毛细胞数，图中计数为均数
±
sem。
26.图5为体内急性顺铂实验流程图。
27.图6a为顺铂诱导急性损伤后72小时的abr阈值，横坐标为对应频率，纵坐标为阈值的分贝数，与顺铂损伤组相比，依帕司他组每个频率的听力阈值均降低；图6b为每只小鼠损伤前后的abr阈移，横坐标为对应频率，纵坐标为阈移的分贝数。统计分析：*，p《0.05，数据显示平均值
±
sem。
28.图7a为体内急性顺铂实验后耳蜗毛细胞的共聚焦图像，用myosin7a(红色荧光)标记毛细胞；图7b为毛细胞的计数统计，横坐标为耳蜗对应部位，纵坐标为每100μm的myosin7a阳性的毛细胞数，图中计数为均数
±
sem。统计分析：**，p《0.01；****，p《0.0001。
29.图8a为体内急性顺铂实验后耳蜗内突触的共聚焦图像，用ctbp2(绿色荧光)标记突触，内毛细胞轮廓用白线勾勒；图8b为ctbp2阳性突触点的计数统计，横坐标为耳蜗对应部位，纵坐标为每个内毛细胞上的突触点计数。图中计数为均数
±
sem。统计分析：*，p《0.05；***，p《0.001。
30.图9a为体内急性顺铂实验后耳蜗内螺旋神经节神经元切片的共聚焦图像，用tuj1(绿色荧光)标记螺旋神经节神经元，图9b为tuj1阳性细胞的计数统计，横坐标为耳蜗对应部位，纵坐标为每10,000μm2范围内的tuj1阳性细胞计数。图中计数为均数
±
sem。统计分析：****/####，p《0.0001。
31.图10a为毛细胞中线粒体活性氧的mitosox荧光检测，细胞凋亡后的红色荧光增强；图10b为每100μm范围内mitosox荧光阳性的毛细胞计数，横坐标为耳蜗对应部位，纵坐标为每100μm内mitosox阳性的毛细胞数，图中计数为均数
±
sem，***，p《0.001；####，p《0.0001。
32.图11a为荧光探针jc-1检测细胞中线粒体的膜电位。顺铂诱导的线粒体功能异常增加了jc-1的单体形式(绿色荧光)，依帕司他的加入减少了顺铂引起的线粒体损伤，增强了线粒体中的jc-1聚合形式(红色荧光)；图11b为计算并统计jc-1聚合物(红色荧光)和jc-1单体(绿色荧光)的比例变化。图中计数为均数
±
sem，****/####，p《0.0001。
33.图12为银椴苷的3d构象图(pubchem id：5320686)。
34.图13为醛糖还原酶蛋白akr1b1的晶体结构(pdb id：4lbs)。
35.图14为用swisstargetprediction网站预测的银椴苷的作用靶点。
36.图15为银椴苷与akr1b1蛋白的分子对接结合模式图，akr1b1蛋白显示为彩色背景结构，nadp碳原子显示为灰色，4o8碳原子显示为绿色，蓝色为氮原子，橙色为磷原子，红色
为氧原子，深红色为溴原子，浅蓝色为氟原子，银椴苷与akr1b1残基trp20、gln49、thr113和cys298形成氢键(黄色虚线)，并与akr1b1残基trp111形成π-π相互作用(洋红色虚线)。
37.图16为银椴苷与akr1b1活性残基相互作用的2d模式图。银椴苷与akr1b1残基trp20、gln49、thr113和cys298形成氢键(虚线箭头)，并与akr1b1残基trp111形成π-π相互作用(虚线带苯环箭头)。
38.图17为两种已知与akr1b1结合的阳性化合物4o8和4jir的对接构象，青色棒代表4o8，黄色棒代表4jir。
39.图18a为akr1b1的静电表面图；图18b为银椴苷与阳性化合物4o8的分子对接结构。青色棒显示4o8，绿色棒显示银椴苷，蛋白akr1b1的结构显示为背景线状，黄色虚线表示氢键，洋红色虚线表示π-π相互作用。
40.图19为4o8与akr1b1蛋白相互作用的2d模式图。
41.图20a为醛糖还原酶活性的测量，最大斜率表示酶活性最高，为醛糖还原酶阳性对照组。灰线的最小斜率表示阴性对照组；图20b为根据组织蛋白量计算相对醛糖还原酶活性，星号(*)表示与ar阳性对照的统计学差异，统计分析：**，p《0.01；****，p《0.0001，数据显示sem
±
平均值。
42.图21为qrt-pcr检测顺铂与til处理后耳蜗外植体中醛糖还原酶和山梨醇脱氢酶的mrna水平。横坐标为相关基因名称(akr1b1、akr1b7、sord)，纵坐标为基因相对表达量，*，p《0.05；**/##，p《0.01。
43.图22为使用cck-8测定法检测细胞活力。横坐标为顺铂及银椴苷的浓度，纵坐标为在450nm时的吸光度值；统计分析：**，p《0.01；***，p《0.001；****，p《0.0001，数据显示sem
±
平均值。
44.图23a为流式细胞术分析银椴苷对顺铂诱导的细胞凋亡的影响，图23b为细胞死亡率分析。统计分析：**，p《0.01，数据显示sem
±
平均值。
45.图24a为使用银椴苷和顺铂共同培养的耳蜗外植体的免疫荧光染色，myosin7a(绿色荧光)用于标记毛细胞；图24b为毛细胞的计数统计，横坐标为耳蜗对应部位，纵坐标为每100μmmyosin7a阳性的毛细胞数，图中计数为均数
±
sem，****，p《0.0001。
46.图25a为用银椴苷和顺铂共同培养的螺旋神经元神经节的免疫染色，毛细胞用myosin7a(绿色荧光)标记，sgn用tuj1(红色荧光)标记；图25b为每100μm长度的神经突密度(n＝6)，图25c为神经突生长长度的定量分析(n＝6)，图中计数为均数
±
sem，****，p《0.0001。
47.图26为qrt-pcr检测耳蜗外植体的顺铂损伤模型中，凋亡相关基因的相对mrna水平变化。横坐标为凋亡相关基因名称(bax，bcl2，caspase3)，纵坐标为基因相对表达量，图中计数为均数
±
sem，*/#，p《0.05；**/##，p《0.01；***/###，p《0.001。
48.图27a为毛细胞凋亡通过cleaved-caspase3免疫荧光染色(红色荧光)测定；图27b为caspase-3阳性的毛细胞定量统计，横坐标为耳蜗对应部位，纵坐标为每100μm caspase-3阳性的毛细胞数，图中计数为均数
±
sem，***，p《0.001。
49.图28a为通过caspase-3免疫荧光染色(红色荧光)测定新生鼠耳蜗外植体螺旋神经元神经节的凋亡；图28b为caspase-3荧光定量统计，横坐标为耳蜗对应部位，纵坐标为代表caspase-3的红色荧光强度，**，p《0.01。
50.图29为小鼠两个周期顺铂损伤后的abr听力检测。其中，a为小鼠abr阈值，横坐标为对应频率，纵坐标为阈值的分贝数，银椴苷给药组(蓝色线)的abr听力阈值在8k、16k和24k频率均低于顺铂损伤组(红色线)；b为90db声音强度刺激时abr i波振幅分析，横坐标为对应频率，纵坐标为i波幅值；c为90db声音强度刺激时abr波i波潜伏期，横坐标为对应频率，纵坐标为i波潜伏期统计值，d为每只小鼠损伤前后的abr阈移。横坐标为对应频率，纵坐标为阈移的分贝数。统计分析：*，p《0.05；**，p《0.01；***，p《0.001；****，p《0.0001，数据显示sem
±
平均值。
51.图30a为两个给药周期后小鼠耳蜗免疫组化后的共聚焦图像，用myosin7a(红色荧光)标记毛细胞；30b为毛细胞的计数统计，横坐标为耳蜗对应部位，纵坐标为每100μm myosin7a阳性的毛细胞数，图中计数为均数
±
sem，****/####，p《0.0001。
52.图31a为两个给药周期后小鼠耳蜗免疫组化后的共聚焦图像，用ctbp2(绿色荧光)标记突触，内毛细胞轮廓用白线勾勒；图31b为ctbp2阳性突触点的计数统计，横坐标为耳蜗对应部位，纵坐标为每个内毛细胞上的突触点计数。图中计数为均数
±
sem，****/####，p《0.0001。
53.图32a为两个给药周期后小鼠耳蜗的冰冻切片染色，用myosin7a(红色荧光)标记毛细胞，用tuj1(绿色荧光)标记sgn。图32b为用tuj1(绿色荧光)标记螺旋神经节神经元。图32c为sgn的计数统计，横坐标为耳蜗对应部位，纵坐标为每10,000μm2范围内tuj1阳性的sgn数量，图中计数为均数
±
sem，统计分析：***/###，p《0.001。
具体实施方式
54.以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
55.实施例1实验材料及方法
56.1.1实验材料：
57.小鼠耳蜗毛细胞系(hei-oc1)。p2日龄c57/bl6新生鼠及5-6周龄c57/bl6成年鼠(jsj生物和灵畅生物)。所有动物均严格按照中华人民共和国科技部2006年发布的《实验动物人道待遇指南》进行处理。本发明中采用依帕司他和银椴苷作为醛糖还原酶抑制剂验证醛糖还原酶抑制剂抑制剂对治疗或预防药物性耳聋的作用，依帕司他和银椴苷均于selleck购买。
58.1.2实验方法
59.1.2.1新生鼠耳蜗外植体培养
60.体外培养使用p2 c57/bl6新生鼠的感觉上皮。实验步骤如下：
61.1)在清洁的细胞房中，首先使用75％酒精消毒小鼠，用高温消毒过的剪刀断头，沿大脑矢状位正中线剪开颅骨，去掉多余的脑组织，保留耳蜗及周围组织，放入75％酒精后，迅速转移至pbs缓冲液中；
62.2)在解剖显微镜下解剖耳蜗感觉上皮，首先去除蜗壳，探到蜗轴底端，将蜗轴连同感觉上皮和螺旋韧带一起从颞骨上游离出，然后从底圈末端小心分离螺旋韧带和感觉上皮，按底圈至顶圈的顺序慢慢地去除螺旋韧带；
63.3)最后将分离出的感觉上皮转移至在涂cell-tek的玻片上，铺平后置于冰上5-10
分钟，确保其紧密粘附在玻片上；
64.4)待其稳定后加入100ul由dmem/f12(hyclone)与n2(生命技术)，b27(生命技术)和5mg/ml氨苄西林组成的培养基；
65.5)在37℃下、5％co2中培养过夜。全部操作遵循无菌操作原则。
66.1.2.2耳蜗外植体顺铂损伤模型及给药分组
67.在耳蜗外植体稳定培养过夜后，加入含不同浓度顺铂培养耳蜗外植体24小时，观察剂量反应，发现毛细胞损伤峰值为30μm，同时结合既往文献经验，选择30μm处理24小时作为耳蜗外植体实验的损伤模型。
68.将培养的耳蜗外植体分组：
69.1)给药组：损伤前2小时给予含有不同浓度醛糖还原酶抑制剂的培养基预处理，2小时随后换为醛糖还原酶抑制剂(本发明中为依帕司他和银椴苷)与顺铂共同处理，24小时后换为仅含有醛糖还原酶抑制剂的培养基继续处理24小时。
70.2)单纯损伤组：30μm顺铂处理24小时后，更换为培养液继续处理24小时。
71.3)对照组：只使用培养基，期间与其余组同时换液。每组至少4根基底膜。
72.1.2.3免疫组化
73.1)取出培养完成的基底膜，用pbs洗去残留培养基，换为4％pfa固定基底膜，室温半小时(或4℃2小时-24小时)；
74.2)固定结束后去除pfa，用pbs清洗3次，放置在摇床上，每次清洗10分钟；
75.3)使用含10％驴血清及1％triton的pbs进行封闭通透，去除pbs，加入配置好的封闭通透液，4℃过夜；
76.4)一抗染色：配置含有1％驴血和1％triton的pbs作为抗体稀释液，抗兔-myosin7a、抗鼠-ar的稀释比例为1:500。每孔加入大约50μl配置完成的抗体后，避光放置在4℃过夜；
77.5)4℃孵育结束后，放置于室温复温1小时。随后放置在摇床上，用pbs清洗3次，每次清洗10分钟；
78.6)二抗染色：使用抗体稀释液，将一抗对应的alexa flour488 donkey anti-mouse、alexa flour cy3 donkey anti-rabbit二抗按1:500稀释，每孔加入大约50μl配置完成的抗体后，避光放置在4℃过夜；
79.7)4℃孵育结束后，用pbs清洗3次，每次清洗10分钟；
80.8)细胞核染色：使用1:1000比例稀释dapi，室温下孵育10分钟；
81.9)pbs清洗3遍后(同上)，将基底膜附着的小圆玻片取出放至载玻片上，加入甘油后，用盖玻片缓慢盖好。
82.1.2.4醛糖还原酶活性测定
83.使用醛糖还原酶活性测定试剂盒(abcam，ab273276)，该试剂盒利用醛糖还原酶(ar)催化nadph氧化的能力，检测醛糖还原酶活性。新生鼠耳蜗外植体分为三组：对照组、顺铂损伤组和醛糖还原酶抑制剂+顺铂共同处理的给药组(n＝14耳蜗)。为了检测340nm处吸光度的下降，首先按照说明制备耳蜗组织裂解物，并裂解后取少量用bca试剂盒(bca，beyotime，上海)定量蛋白质浓度。接下来，根据试剂的说明生成nadph并制作标准曲线。在曲线的线性范围内选择开始和结束时间点(t1和t2)，获得相应的吸光度值(od1和od2)，并
使用δod＝od1-od2计算测试样品的醛糖还原酶活性。将δod应用于nadph标准曲线，以估计反应过程中产生的nadph(b nmol)的量(δt＝t2-t1)。使用以下公式确定每个组的ar活性：
[0084][0085]
样品ar活性(sample ar activity)＝nmol/min/mg＝mu/mg
[0086]
b＝标准曲线(nmol)中的nadph量
[0087]
δt＝反应时间(分钟)
[0088]
m＝添加到反应孔中的样品总蛋白(mg)
[0089]
d＝稀释比例
[0090]
1.2.5western印迹检测相关蛋白表达
[0091]
取培养的耳蜗外植体在含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液(ripa)中在冰上均质化，提取的蛋白经100℃水浴变性后，在聚丙烯酰胺凝胶电泳上进行分离，后经过转膜、封闭、一抗[β-tubulin、ar]反应、二抗反应后进行曝光、获取图片。
[0092]
1.2.6小鼠体内急性顺铂损伤实验
[0093]
5-6周龄c57/bl6野生型小鼠用于体内实验。将随机编号的小鼠分为三组：单纯损伤组(n＝7)，醛糖还原酶抑制剂和顺铂共同处理的给药组(n＝5)，以及用泊洛沙姆和生理盐水处理的对照组(n＝5)。雄性和雌性小鼠保证在整个实验组中的均匀分布。在检测完每只小鼠基础听力后，损伤组通过腹腔内给予顺铂一次，浓度为30mg/kg。给药组在顺铂损伤前一天及后两天，连续三天腹腔给予依帕司他40mg/kg/d，其余组给相同剂量的溶剂。饲养期间，每天向小鼠提供软性饲料和新鲜水果。在顺铂给药后72小时进行小鼠abr测试，随后处死进行组织检查。
[0094]
1.2.7图像采集和统计分析
[0095]
免疫组化染色后的图像采集使用leica sp8共聚焦显微镜，图像处理及计数使用lecia软件、adobe photoshop 2020和adobe illustrator 2020，使用graphpad prism软件或excel表格对数据统计分析。使用单因素方差分析；如果仅比较两个条件，则使用双样本t检验。
[0096]
实施例2依帕司他作为制备治疗或预防药物性耳聋药物的应用
[0097]
2.1顺铂损伤性时的醛糖还原酶活性增高
[0098]
如图1所示，通过western印迹检测醛糖还原酶蛋白表达，蛋白质印迹表明顺铂损伤后耳蜗外植体中醛糖还原酶蛋白水平增加，确定醛糖还原酶在顺铂损伤期间在耳蜗中被高度激活。通过ar蛋白的免疫荧光染色，如图2所示，观察到用顺铂处理后的耳蜗毛细胞中ar表达增加，同时依帕司他减少了顺铂损伤时的醛糖还原酶表达增加。
[0099]
为了验证顺铂损伤时耳蜗中醛糖还原酶活性的变化，使用市面上有的醛糖还原酶活性测定试剂盒，通过利用ar催化nadph氧化的能力，通过检测nadph吸光度的变化反应ar活性变化。ar阳性对照组的吸光度下降最显着。顺铂损伤组的ar活性下降幅度大于对照组，表明顺铂损伤的耳蜗外植体的ar活性增加。研究依帕司他(epa)对顺铂损伤时耳蜗外植体组织内ar活性的影响。如图3所示，从醛糖还原酶活性检测结果显示，相对于顺铂损伤组，使用依帕司他后减轻了顺铂诱导的吸光度值改变。结合bca蛋白浓度检测，最终计算醛糖还原
酶活性，显示顺铂损伤组的醛糖还原酶活性高于对照组，说明顺铂会诱导耳蜗外植体组织内的ar活性增高，并且依帕司他可以减轻顺铂诱导的ar活性增高。
[0100]
2.2依帕司他在新生鼠耳蜗外植体顺铂损伤模型中起保护作用
[0101]
对于p2新生鼠耳蜗的离体培养，使用myosin7a和tuj1对耳蜗毛细胞(hcs)和螺旋神经元神经节(sgn)的进行免疫荧光染色。使用依帕司他和顺铂共同培养耳蜗外植体，如图4所示，通过免疫荧光染色后的共聚焦图像结果发现不同浓度的依帕司他(10/50/100μm)对顺铂引起的毛细胞损伤都有保护作用。
[0102]
2.3依帕司他在小鼠体内对顺铂耳毒性的保护作用
[0103]
为了进一步验证抑制醛糖还原酶对顺铂诱导耳毒性的作用，结合既往研究证明依帕司他体内给药有改善神经损伤作用，使用全身给药的方法探索依帕司他对听力损失的保护作用。为了避免顺铂长期损伤模型所导致小鼠的死亡率过高，采用小鼠体内急性顺铂损伤模型，通过一次给予大剂量顺铂(30mg/kg)诱导小鼠急性听力损失，在损伤前和损伤后72小时均进行听力检测。依帕司他实验组，在顺铂急性模型损伤前一天及后两天，分别腹腔给予40mg/kg的依帕司他，其余处理同顺铂损伤组。对照组和顺铂损伤组连续三天腹腔给予实验组等量的溶剂(dmso+玉米油)，流程图如图5所示。如图6所示，对比三组小鼠72小时后abr听力检测数据发现，急性顺铂损伤会造成听力损失，而依帕司他组小鼠听力阈值对比顺铂损伤组有降低，证明在小鼠体内给药后依帕司他缓解了听力损失或减慢了听力损失的进程。对小鼠耳蜗的组织学检测，如图7所示，使用myosin7a标记内耳毛细胞，可见顺铂损伤组外毛细胞大量缺失，特别是在耳蜗底圈。而依帕司他组底圈毛细胞数较顺铂组存活数量多。同时用ctbp2标记的突触数量，如图8所示，也可见依帕司他处理后内毛细胞上突触点存活数量多。如图9所示，在耳蜗内螺旋神经节神经元切片中，用tuj1标记螺旋神经节神经元，可见依帕司他处理后底圈sgn计数较顺铂组存活数量多。
[0104]
3.4依帕司他阻止顺铂诱导的线粒体功能缺陷
[0105]
使用mito-sox荧光探针，检测耳蜗毛细胞中线粒体活性氧水平。如图10所示，结果证实顺铂损伤时耳蜗毛细胞中线粒体活性氧水平明显升高，而依帕司他有效地减少了线粒体活性氧的产生。然后，如图11所示，利用jc-1荧光探针检测线粒体膜电位变化，顺铂损伤后线粒体膜电位下降，但在依帕司他组未见明显下降，证明依帕司他阻止了顺铂诱导的线粒体功能缺陷。由此可见，依帕司他在顺铂引起的肾脏损伤、消化道问题、骨髓移植、神经毒性的等副作用也具有潜在应用前景。
[0106]
综上所述，从听力检测和组织学检测都可以发现，醛糖还原酶抑制剂依帕司他可以缓解顺铂诱导的听力损失。
[0107]
实施例3银椴苷的醛糖还原酶抑制剂的验证
[0108]
3.1实验方法
[0109]
3.1.1银椴苷的结构以及构象搜索
[0110]
从pubchem下载化合物银椴苷(tiliroside)的3d结构，pubchem id：5320686(图12)。通过moe软件的conformation search模块进行构象搜索，生成化合物的多构象文件用于分子对接，最终化合物tiliroside生成173个构象。
[0111]
3.1.2分子靶点预测
[0112]
使用基于互联网网站的分子靶点预测工具swisstargetprediction(http://
www.swisstargetprediction.ch)和similarity ensemble approach(sea)工具，根据已知配体-靶点结合的结构相似性，预测银椴苷最可能的蛋白质靶标。这些工具将银椴苷与所有已知的生物活性化合物进行比较，然后利用可比较化合物具有相似生物活性的事实来预测可能靶点。
[0113]
3.1.3明确蛋白结构和对接位点
[0114]
使用银椴苷(pubchem id：5320686)生成的几个构象文件用于分子对接。目前已有关于人源性akr1b1蛋白靶点的晶体结构，如图13所示，选择分辨率最低的晶体结构4lbs进行后续处理。发现蛋白质结合了底物和配体，分子对接位点明确。
[0115]
3.1.4分子对接
[0116]
通过moe软件执行银椴苷与akr1b1蛋白的分子对接。下载pdb id：4lbs的蛋白质晶体结构并用作分子对接的受体。在amber10：eht力场中，受体被质子化，配体4o8口袋区域被设置为对接位点。对于分子对接，采用诱导拟合对接方案。采用triangle match算法生成复合物的对接模式，londonδg函数用于计算每个对接姿势的亲和力，保留前1000个对接姿势。然后使用gbvi/was g评分函数和诱导拟合算法计算最佳对接姿势的结合亲和力。最终每个复合物中蛋白质和化合物的相互作用能量打分值以s值表示，该值越小，说明亲和力越强。根据分子自身的构象合理性，确定银椴苷和akr1b1蛋白最佳互作模型，该模式下其亲和力打分值为-10.00kcal/mol。
[0117]
3.1.5定量pcr检测
[0118]
使用tb green
tm
primescript
tm
rt-pcr kit(takara)试剂盒、abi7500实时荧光定量pcr系统(applied biosystems)和cfx-96实时pcr检测系统(bio-rad)，进行了定量pcr检测(qpcr)。
[0119]
本部分使用的引物序列表1所示下：
[0120]
表1引物序列
[0121]
基因正向引物反向引物akr1b1gtgactgaggccgtgaaaggctgacaatgaagagatcctgcakr1b7aatctccattactacggggtctccaatactgtcaatccaaggsordcggcccaaatgatgtgttactctcctacttttgtgactgttccagapdhtcatcatctccgccccttccatgagcccttccacaatgc
[0122]
3.2实验结果
[0123]
3.2.1预测银椴苷的作用靶点
[0124]
为了确定银椴苷的作用靶点，首先将其化学结构提交给在线预测程序swisstargetprediction和similarity ensemble approach(sea)。通过预测的银椴苷前五个作用靶点的分析，如图14所示，确定醛糖还原酶(ar)是与细胞凋亡相关的最有潜力的靶点。
[0125]
3.2.2银椴苷和醛糖还原酶蛋白的分子对接模拟
[0126]
如图15所示，进行分子对接模拟以研究化合物银椴苷(pubchem id：5320686)与akr1b1(pdb id：4lbs)蛋白的结合。induced fit docking protocol用于蛋白质-小分子化合物的柔性分子对接，其中triangle match算法用于生成复合物的对接模式，londonδg评分函数用于评估akr1b1与银椴苷的对接亲和力。如图16所示，根据分子的构象合理性选择
银椴苷与akr1b1蛋白的最佳相互作用模型，亲和力评分为-10.00kcal/mol。如图15所示，分子对接模拟结构显示，银椴苷的立体构象与akr1b1的trp20、gln49、thr113和cys298产生氢连接，并与trp111产生π-π堆积作用。
[0127]
3.2.3银椴苷与醛糖还原酶抑制剂有相似的结合位点
[0128]
自1990年代以来，醛糖还原酶一直是糖尿病并发症的关键治疗靶点，因此，目前已经发现了许多醛糖还原酶抑制剂(ari)。为了研究银椴苷和已知的醛糖还原酶抑制剂与akr1b1相互作用模式之间的异同，选择醛糖还原酶抑制剂的两种结构4o8和4jir。如图17所示，分子对接模拟结构显示，这两种抑制剂与akr1b1的结合位点，与氨基酸残基his100，trp111，tyr48和thr113相关。
[0129]
如图18所示，akr1b1蛋白的静电表面示意图显示，银椴苷具有类似于ari的结构，并且结合在akr1b1的同一口袋中。除此之外，如图19所示，在与akr1b1的分子对接中可见，银椴苷和4o8有相同的结合位点trp-111和thr-113。这些数据表明银椴苷与akr1b1具有稳定的结合构象，并且与ari具有相似的结构和结合位置。
[0130]
3.2.4银椴苷对醛糖还原酶具有抑制作用
[0131]
通过使用市售的醛糖还原酶活性测定试剂盒进一步检测了til对醛糖还原酶活性的药理作用，其中醛糖还原酶的活性通过340nm处nadph吸光度的变化来反映。如图20所示，醛糖还原酶阳性对照组的吸光度下降最显著。与醛糖还原酶阳性组相比，添加til剂量依赖性减轻了nadph吸光度的下降，表明醛糖还原酶活性受到til的抑制。同时，cfda批准的醛糖还原酶抑制剂epalrestat(epa)也减轻了nadph吸光度的下降。这些结果证明，til可以抑制醛糖还原酶活性。
[0132]
3.2.5银椴苷可以抑制顺铂损伤性时的醛糖还原酶活性增高
[0133]
使用qpcr检测了顺铂损伤期间耳蜗外植体中醛糖还原酶和山梨醇脱氢酶rna水平的变化(图21)。使用市面上有的醛糖还原酶活性测定试剂盒，通过利用ar催化nadph氧化的能力，通过检测nadph吸光度的变化反应ar活性变化。ar阳性对照组的吸光度下降最显着。顺铂损伤组的ar活性下降幅度大于对照组，表明顺铂损伤的耳蜗外植体的ar活性增加。研究银椴苷(til)和醛糖还原酶抑制剂依帕司他(epa)对顺铂损伤时耳蜗外植体组织内ar活性的影响。如图3所示，从醛糖还原酶活性检测结果显示，相对于顺铂损伤组，使用til和epa后减轻了顺铂诱导的吸光度值改变。结合bca蛋白浓度检测，最终计算醛糖还原酶活性，显示顺铂损伤组的醛糖还原酶活性高于对照组，说明顺铂会诱导耳蜗外植体组织内的ar活性增高，并且发现til或epa可以减轻顺铂诱导的ar活性增高。
[0134]
3.2.6银椴苷减少小鼠耳蜗外植体中顺铂损伤性时醛糖还原酶的表达
[0135]
通过western印迹检测醛糖还原酶蛋白表达，蛋白质印迹表明顺铂损伤后耳蜗外植体中醛糖还原酶蛋白水平增加，确定醛糖还原酶在顺铂损伤期间在耳蜗中被高度激活，使用til和epa后减少了顺铂诱导的醛糖还原酶表达(图1)。通过ar蛋白的免疫荧光染色，观察到用顺铂处理后的耳蜗毛细胞中ar表达增加，同时银椴苷和依帕司他减少了顺铂损伤时的醛糖还原酶表达增加(图2)。
[0136]
实施例4银椴苷作为制备治疗或预防药物性耳聋药物的应用
[0137]
4.1银椴苷可以缓解顺铂诱导的hei-oc1细胞凋亡
[0138]
氧化应激和ros堆积诱导的细胞凋亡是顺铂损伤的主要机制。为了确认银椴苷是
否对顺铂诱导的细胞凋亡具有保护作用，使用不同浓度银椴苷和30μm顺铂共同处理hei-oc1细胞，然后用cck8测定细胞活力。如图22所示，发现顺铂的耳毒性在加入5μm(银椴苷～300ng)银椴苷时开始降低，并且在3.5-6μg银椴苷下保护作用最显著。如图23所示，关于细胞凋亡相关的流式细胞术检测，结果显示银椴苷可以缓解顺铂诱导的细胞凋亡。
[0139]
4.2银椴苷在新生鼠耳蜗外植体顺铂损伤模型中起保护作用
[0140]
对于p2新生鼠耳蜗的离体培养，使用myosin7a和tuj1对耳蜗毛细胞(hcs)和螺旋神经元神经节(sgn)的进行免疫荧光染色。如图24-25所示，共聚焦图像结果可见，用银椴苷处理的小鼠耳蜗外植体中的hcs和sgn的数量明显大于顺铂损伤组，证实了银椴苷可以起到耳保护作用。
[0141]
4.3银椴苷可以缓解顺铂诱导的细胞凋亡
[0142]
为了探究顺铂损伤时细胞凋亡情况，检测主要的凋亡相关基因(bax，bcl2，caspase3)mrna水平的变化。如图26所示，qpcr结果显示，在顺铂处理24小时后的耳蜗组织中bax和caspase3凋亡因子表达升高，bcl2抗凋亡因子表达下降。在使用银椴苷处理后，减缓了细胞凋亡相关基因mrna的变化。
[0143]
cleaved-caspase3是细胞凋亡过程中的关键因子，为了研究新生鼠耳蜗外植体中细胞凋亡的情况，如图27所示，使用基于cleaved-caspase3荧光标记的免疫组织化学分析表明，cleaved-caspase3阳性hcs的数量在顺铂损伤后显着增加，并在银椴苷组减少。同时，如图28所示，对sgns的共聚焦图片荧光强度分析，也可发现cleaved-caspase3荧光强度在银椴苷组明显减弱。进一步证明银椴苷可以缓解顺铂诱导的细胞凋亡。
[0144]
4.4银椴苷保护小鼠免受顺铂耳毒性的损伤
[0145]
为了验证银椴苷在体内的作用，使用5-6w龄的c57小鼠进一步评估银椴苷的保护作用。首先构建小鼠体内的顺铂损伤模型，顺铂以3.5mg/kg/天的剂量腹膜内连续给予4天，随后恢复10天，然后重复两个周期。该方案与癌症化疗的临床过程相似，它降低了小鼠的死亡率，同时可以诱发显着的听力损失。在每个周期给予顺铂之前两小时，通过经鼓膜途径给予银椴苷和泊洛沙姆混合液至小鼠双耳的中耳腔内，银椴苷给药量为每只耳朵内给予0.3mg/kg。泊洛沙姆是一种起缓释药物作用的传递载体，使化合物在耳内缓慢吸收。同时，对照组和顺铂损伤组通过鼓膜单纯给予泊洛沙姆，以排除给药载体和鼓膜穿孔对听力的影响。
[0146]
经过两个周期给药后对小鼠进行abr检测，观察小鼠听力变化。如图29所示，结果显示，银椴苷给药组的abr听力阈值在8k、16k和24k频率均低于顺铂损伤组，而在32k频率时给药组和顺铂损伤组听力阈值均高于90db上限，这表明在小鼠耳内给予银椴苷能够减轻顺铂诱导的听力损失。对abr波形的分析可见，与对照组相比，90db声强刺激时abr波形在顺铂损伤后，i波振幅在8k和16khz频率时均下降，而银椴苷组与顺铂损伤组的i振幅无明显差异。同时分析代表听觉通路外周传导时间的abr i波潜伏期，发现对比对照组，在顺铂损伤组i波潜伏期延长，而银椴苷组的潜伏期在16khz时没有延长。当abr波形无法检测到时，无法进行幅度和潜伏期的计算。
[0147]
随后对小鼠内耳进行解剖和免疫荧光染色，通过myosin7a标记毛细胞，发现顺铂损伤组外毛细胞明显丢失，其中耳蜗底圈毛细胞损伤最为严重，银椴苷组毛细胞丢失较顺铂损伤组轻(图30)。为了探究感音传导途径中的突触和sgn变化，使用ctbp2标记耳蜗底圈
内毛细胞上的突触点，结果可见，顺铂损伤时突触的数量明显减少，而对比损伤组，银椴苷组的突触存活数量明显增多(图31)。通过耳蜗组织冰冻切片观察tuj1标记的sgn改变，结果显示在耳蜗底圈，顺铂会减少sgn数量，银椴苷组的sgn存活数量对比损伤组多(图32)。
[0148]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.醛糖还原酶抑制剂作为制备治疗或预防药物性耳聋药物的应用。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述醛糖还原酶抑制剂为托瑞司他、非达司他、唑泊司他、榭皮素、银椴苷和依帕司他中的一种或多种。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述所述醛糖还原酶抑制剂为银椴苷和/或依帕司他。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述依帕司他经腹腔给药，给药量为20-40mg/kg；所述银椴苷为每侧耳经鼓室给药，给药量为0.175-0.3mg/kg。5.如权利要求1-4任意一项所述的应用，其特征在于，所述药物性耳聋为铂类药物和/或氨基糖苷类抗生素所导致的耳聋。6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述铂类药物为顺铂。7.一种治疗或预防药物性耳聋的药物，其特征在于，包括醛糖还原酶抑制剂。8.如权利要求7所述的药物，其特征在于，还包括缓释剂。9.如权利要求8所述的药物，其特征在于，所述缓释剂为泊洛沙姆。

技术总结
本发明公开了一种醛糖还原酶抑制剂作为制备治疗或预防药物性耳聋药物的应用。本发明中首次将醛糖还原酶抑制剂依应用于预防或治疗药物性耳聋中，经试验表明，醛糖还原酶抑制剂可以减轻顺铂诱导的醛糖还原酶活性增高。其中，依帕司他和顺铂共同培养耳蜗外植体，发现不同浓度的依帕司他(10/50/100μM)对顺铂引起的毛细胞损伤都有保护作用。依帕司他用于小鼠顺铂急性耳毒性模型，可以缓解顺铂诱导的听力损失。并且发现银椴苷作为新的醛糖还原酶抑制剂同样具有缓解顺铂诱导的听力损失的性能，具体的，银椴苷应用于新生鼠耳蜗离体培养时，银椴苷在P2新生鼠耳蜗离体培养中显示出对耳蜗毛细胞(HCs)和螺旋神经元神经节(SGN)的保护作用。护作用。护作用。


技术研发人员：李华伟 陈岩 李文妍 廖雅琦 毛寰宇 高宪 林海亮
受保护的技术使用者：复旦大学附属眼耳鼻喉科医院
技术研发日：2023.06.30
技术公布日：2023/8/13