番泻苷在制备磷脂酰肌醇-3激酶抑制剂中的应用

1.本发明属于医药技术领域，涉及番泻苷作为磷脂酰肌醇-3激酶(pi3k)抑制剂或在制备pi3k抑制剂中的应用。


背景技术：

2.pi3k存在于体内各种细胞中，是脂质激酶的一种，能磷酸化细胞膜上的磷脂酰肌醇家族成员，募集和激活下游的底物而启动一系列信号联级反应，在细胞的有丝分裂、细胞存活与分化、细胞骨架的构型与重塑、血管生成及葡萄糖转运中起着重要的作用。pi3k根据其编码基因，结构特点和底物特异性可分为i、ii、iii三种类型。i类pi3k由一个分子量为110-120kd的催化亚基和一个分子量为50-100kd的调节亚基组成的异二聚体。催化亚基有p110α、p110β、p110γ和p110δ四种亚型，调节亚基有p50、p55、p85和p101四种亚型。pi3kα、pi3kβ广泛表达于所有细胞和组织中，然而，pi3kγ和pi3kδ主要表达于造血和免疫细胞中。pi3kα基因的突变将直接导致pi3kca激酶活性的增强，从而诱发卵巢癌、乳腺癌、结肠癌、子宫内膜癌和脑癌等发生，因此，pi3kα已成为肿瘤治疗的重要靶点。pi3kβ亚型的激活与pten的缺失或失活导致pip3增加有关，诱导肿瘤的形成；另外，pi3kβ还与血小板的聚集、血栓的形成及胰岛素信号有关。pi3kγ主要在白细胞和t淋巴细胞中表达，与炎症和免疫紧密相关，在炎症的靶向治疗中具有较大的潜力。pi3kδ主要分布在免疫细胞与造血细胞中，pi3kδ的失调容易导致骨髓和淋巴微环境内恶性b细胞的増殖和存活，从而引起如多发性骨髓瘤、淋巴瘤、非淋巴性白血病等的发生，因此，pi3kδ被认为是治疗急性髓性白血病等血液系统恶性肿瘤的关键靶点。pi3k作为多种疾病的治疗靶点之所以引人注目，是因为它位于几个重要信号转导通路的中心位置，这些通路参与调控细胞增殖、代谢、迁移、以及血糖稳态等细胞调节过程，在肿瘤以及动脉粥样硬化、高血压、冠心病心肌梗死等心血管疾病中发挥了重要作用。
3.天然产物是新药开发的重要来源，临床使用的许多药物均来源于天然产物或其衍生物。天然产物具有结构多样性和生物活性潜能等优点，从植物、微生物和海洋植物中分离得到的化合物可能成为药物的先导化合物，通过对这些天然活性化合物进行结构修饰和改造可以增加其活性；此外，对先导化合物进行功能基团分子修饰而获得的半合成新化合物可能具有更强的药效和更小的副作用。因此，从天然产物中筛选并发现具有分子靶向性的天然小分子化合物是创新药物研发的重要基础。
4.番泻苷(sennoside)包括番泻苷a、b、c、d、e、f、g等。其中番泻苷a与b、番泻苷c与d、番泻苷e与f互为立体异构体，而番泻苷g为番泻苷a的手性异构体。泻下药番泻叶、大黄及清凉解毒药诃子中均含有番泻苷。番泻苷主要用于泻下药品和减肥产品中。
5.番泻苷a英文名为sennoside a，cas登录号为81-27-6，分子量为862.74，分子式为c
42h38o20
，结构如式i所示。
[0006][0007]
番泻苷b英文名为sennoside b，cas登录号为128-57-4，分子量为862.74，分子式为c
42h38o20
，结构如式ii所示。
[0008][0009]
番泻苷是番泻叶致泻的主要活性成分，在临床上含番泻苷的药品用于治疗便秘和清肠。番泻苷作为pi3k抑制剂的应用，或作为制备pi3k抑制剂的应用国内外均未见有报道。


技术实现要素：

[0010]
为了克服现有技术的缺陷，本发明通过对多种天然小分子化合物进行pi3k抑制活性筛选，意外发现番泻苷对pi3k具有显著抑制作用，在制备治疗和/或预防以pi3k为靶点的增殖性疾病的药物开发方面具有潜在的应用前景。
[0011]
本发明的第一个目的是提供番泻苷(sennoside)作为pi3k抑制剂的应用。
[0012]
所述的番泻苷选自番泻苷a、b、c、d、e、f、g中的一种或几种；
[0013]
所述的番泻苷还可以为番泻苷在药学上可接受的盐类、溶剂化物或可水解酯类，如盐酸番泻苷、氢溴酸番泻苷、马来酸番泻苷等。
[0014]
进一步地，
[0015]
所述的番泻苷为番泻苷a、番泻苷b中的任意一种或两种的组合。
[0016]
所述的番泻苷可以与药学上可接受的载体或赋形剂组成药物组合物。
[0017]
所述的番泻苷或药物组合物可以与药学上可接受的载体或赋形剂制备成临床上可接受的制剂。
[0018]
所述的制剂可以为片剂、胶囊、颗粒剂、混悬剂、注射剂等。
[0019]
本发明的第二个目的是提供番泻苷在制备pi3k抑制剂中的应用。
[0020]
所述的pi3k为pi3kα，pi3kβ，pi3kγ或pi3kδ。
[0021]
番泻苷可有效抑制pi3k四个亚型的激酶活性，尤其是番泻苷a(sennoside a)和番泻苷b(sennoside b)，其ic
50
值在0.2μm-18μm之间，番泻苷a较优于番泻苷b。
[0022]
进一步地，番泻苷a和番泻苷b抑制pi3kα，pi3kβ和pi3kδ三个亚型的ic
50
值均小于0.5μm，具有明显的抑制活性。
[0023]
本发明的第三个目的是提供番泻苷在制备治疗和/或预防以pi3k为靶点的增殖性疾病的药物中的应用。
[0024]
所述的以pi3k为靶点的增殖性疾病包括癌症(乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、肺癌、白血病、恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、甲状腺癌、鼻咽癌、脑膜癌、垂体瘤、口腔癌、胃癌、食管癌、结直肠癌、胰腺癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、骨癌、恶性黑色素瘤、神经胶质瘤、皮肤癌中的任意一种或多种)以及动脉粥样硬化、高血压、冠心病心肌梗死等心血管疾病。
[0025]
与现有技术相比，本发明首次发现并证明了番泻苷的抑制pi3k活性，尤其是番泻苷a和番泻苷b均能够抑制pi3k活性，可以作为pi3k抑制剂或用于制备pi3k抑制剂。用于预防和/或治疗与pi3k异常激活引起的相关疾病。
附图说明：
[0026]
图1为实施例1中番泻苷a对pi3k四个亚型激酶活性的抑制结果图。
[0027]
图2为实施例1中番泻苷b对pi3k四个亚型激酶活性的抑制结果图。
具体实施方式：
[0028]
下面结合附图，用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此来限定本发明。
[0029]
实施例1：番泻苷a和番泻苷b对pi3k四个亚型激酶活性的影响。
[0030]
1、化合物及试剂盒：番泻苷a和番泻苷b均购自上海mce公司；pi3k(p110α/p85α)、pi3k(p110β/p85α)、pi3k(p120γ)和pi3k(p110δ/p85α)均为i型pi3k，购自promega公司；pi3k激酶活性检测试剂盒购自echelon公司。
[0031]
2.实验方法：使用pi3k激酶活性检测试剂盒(购自echelon)，按照试剂盒说明书检测番泻苷a和番泻苷b对pi3k四个亚型激酶活性的影响。具体方法如下：
[0032]
a.将不同浓度的化合物(0，0.15625，0.3125，0.625，1.25，2.5，5，10，20μm)分别与0.2μg/ml激酶于室温条件下孵育10分钟，溶剂对照组加入等体积的dmso；
[0033]
b.将30μl 10μm pi(4,5)p2底物和30μl步骤a中的样品进行混合；
[0034]
c.密封激酶反应，使其在37℃下反应2.5小时；
[0035]
d.加入90μl激酶终止溶液以停止每个60μl激酶反应；
[0036]
e.制备pi(3,4,5)p3标准品：从3.6μm pi(3,4,5)p3原液中，取30μl加入至270μl标准曲线缓冲液，制备0.36μm的pi(3,4,5)p3标准溶液；用标准曲线缓冲液从0.36μm的pi(3,4,5)p3标准溶液中进行四次三倍系列稀释，制备得到不同浓度的pi(3,4,5)p3标准溶液(0.36，0.12，0.04，0.0133和0.0044μm)；
[0037]
f.将60μl/孔不同浓度的pi(3,4,5)p3标准溶液移到培养板的标准溶液反应孔中；同时，将60μl/孔的每个停止的激酶反应(步骤d中的样品)移到培养板的两个孔中，以获得重复的数据点；在上述每孔中加入60μl/孔pi(3,4,5)p3检测液，密封培养板，室温下放置60分钟；
[0038]
g.将100μl标准品和反应物分别从培养板转移到检测板；密封检测板，在室温下孵育60分钟；
[0039]
h.丢弃检测板中的溶液，并用200μl/孔的tbs-t清洗检测板3次；
[0040]
i.用tbs-t以1:80稀释二次检测液，向检测板的每个孔中加入100μl稀释后的二次检测液；密封检测板，室温下孵育30分钟；
[0041]
j.丢弃检测板中的溶液，并用300μl/孔的tbs-t清洗检测板3次；
[0042]
k.丢弃检测板中的溶液，并立即加入100μl室温tmb溶液；反应20分钟；当颜色变暗时，向每个孔中加入50μl 1n h2so4停止溶液停止显色；检测板于酶标仪450nm处读取吸光值。
[0043]
3.实验结果：番泻苷a和番泻苷b均可以抑制pi3kα，pi3kβ，pi3kγ和pi3kδ的活性，番泻苷a抑制四个亚型激酶活性的ic
50
分别为：pi3kα＝0.27μmol/l；pi3kβ＝0.25μmol/l；pi3kγ＝10.71μmol/l；pi3kδ＝0.26μmol/l(图1和表1)；番泻苷b抑制四个亚型激酶活性的ic
50
分别为：pi3kα＝0.45μmol/l；pi3kβ＝0.38μmol/l；pi3kγ＝17.98μmol/l；pi3kδ＝0.30μmol/l(图2和表1)；
[0044]
其中，番泻苷a和番泻苷b在0.625-20μmol/l浓度时，对pi3kα，pi3kβ和pi3kδ的抑制活性均大于50％；在1.25-20μmol/l浓度时，对pi3kα，pi3kβ和pi3kδ的抑制活性均接近100％。
[0045]
以上实验结果表明番泻苷a和番泻苷b均是新颖的pi3k抑制剂。
[0046]
表1实施例1中番泻苷a和番泻苷b抑制pi3k四个亚型激酶活性的ic
50
值
[0047]

技术特征：
1.番泻苷作为pi3k抑制剂的应用。2.番泻苷在制备pi3k抑制剂中的应用。3.番泻苷在制备治疗和/或预防以pi3k为靶点的增殖性疾病的药物中的应用。4.如权利要求1-3任何一项所述的应用，其特征在于，所述的pi3k为pi3kα，pi3kβ，pi3kγ或pi3kδ。5.如权利要求1-3任何一项所述的应用，其特征在于，所述的番泻苷选自番泻苷a、b、c、d、e、f、g中的一种或几种。6.如权利要求1-3任何一项所述的应用，其特征在于，所述的番泻苷选自番泻苷a、番泻苷b、番泻苷c或番泻苷d中的一种或几种。7.如权利要求1-6任何一项所述的应用，其特征在于，所述的番泻苷为番泻苷在药学上可接受的盐类、溶剂化物或可水解酯类。8.权利要求1-7任何一项所述的应用，其特征在于，所述的番泻苷与药学上可接受的载体或赋形剂制备成药物组合物。9.权利要求1-8任何一项所述的应用，其特征在于，所述的番泻苷或其药物组合物与药学上可接受的载体或赋形剂制备成药物制剂。10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的药物制剂为片剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、注射剂、粉剂、锭剂、乳剂、糖浆剂、乳膏剂、软膏剂或栓剂。

技术总结
本发明属于医药技术领域，涉及番泻苷作为磷脂酰肌醇-3激酶抑制剂或在制备PI3K抑制剂中的应用。所述的番泻苷包括番泻苷A、B、C、D、E、F、G等，或其在药学上可接受的盐类、溶剂化物或可水解酯类。本发明的番泻苷可有效抑制PI3K四个亚型的激酶活性，尤其是番泻苷A和番泻苷B，其对四种亚型的激酶的IC


技术研发人员：周宏宇 刘丹丹 卿晨
受保护的技术使用者：昆明医科大学
技术研发日：2023.06.07
技术公布日：2023/8/14